铅是一种地壳中含量丰富的重金属元素，具有熔点低、耐腐蚀性强、塑性好等特性，被广泛应用于化工、蓄电池制造等领域。然而，长期大规模的生产和使用导致铅在环境中广泛蓄积，对全球生态和公共健康构成威胁。尽管多数发达国家通过公共卫生干预（如淘汰含铅汽油）显著降低了急性铅中毒风险
［1］，但发展中国家仍面临严峻的铅污染挑战。我国是全球最大的铅生产国和消费国，2024年金属铅的产量达763.7万吨
［2］。另外，我国在2011~2020年为推广太阳能项目，大量使用铅酸蓄电池作为储能装置，导致铅污染物排放量持续增加
［3］。尽管我国已通过政策法规和技术升级加强污染治理，铅污染仍对公共卫生形成持续性威胁。在我国某些城区土壤中，铅的平均含量为1350 mg/kg，高于土壤环境二级标准
［4］。长期低剂量的铅暴露会对人体神经系统、血液系统和生殖系统造成不可逆损伤，尤其是对发育期儿童的神经行为和生长发育的影响更加明显。
铅暴露可导致认知障碍、执行功能改变、异常社会行为和精细运动控制紊乱等多种神经行为的改变。目前对铅的神经系统毒性机制的研究主要包括氧化应激
［5］、线粒体功能障碍
［6］、神经炎症
［7］、表观遗传学改变
［8， 9］、影响离子稳态
［10， 11］、肠道菌群紊乱
［12］等，对铅中毒的治疗主要为螯合疗法，乙二胺四乙酸（EDTA）和二巯基琥珀酸（DMSA）等螯合剂通过促进铅排泄来治疗铅中毒，但会造成电解质紊乱等副作用，并且对铅的神经毒性作用不明显
［13］。近期研究表明，益生菌具有改善铅暴露引起的神经毒性的潜力
［14］，其中，植物乳杆菌（
L.plantarum）是一种广泛应用的革兰氏阳性乳酸菌，可对肠道健康
［15］、代谢平衡和神经系统产生有益影响
［16， 17］，显著改善帕金森患者的运动评分
［18］，减轻帕金森疾病模型小鼠的运动缺陷并抑制了神经退行性过程
［19， 20］，此外对多巴胺能神经元发挥显著的神经保护作用，从而改善运动症状，并通过调节ERK2和AKT/mTOR通路促进神经元存活
［21］。在酒精诱导的认知功能障碍的小鼠模型中，
L.plantarum可改善认知功能及学习记忆能力障碍
［22］。在铅暴露的小鼠模型中，
L.plantarum可有效抑制肠道铅吸收和促进粪便铅排泄，从而降低血液和脑组织铅水平，防止铅诱导的氧化应激和组织损伤
［23］，我们的前期研究结果表明
L.plantarum也可缓解铅引起的神经毒性
［24］，但
L.plantarum减轻铅诱导的神经毒性的机制尚不清楚。
综上所述，铅暴露引起的疾病负担仍然十分严重，上述提到的驱铅疗法都存在较多的不良反应。本研究通过L.plantarum干预缓解铅引起的神经毒性，并通过靶向代谢分析了小鼠血清胆汁酸代谢谱，探讨其中的机制，为防治铅诱导的神经毒性的方法提供新思路和实验基础。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂
倒置相差显微镜（Olympus，IX700），Odyssey双色红外荧光扫描成像系统（LiCor），酶标仪（Bio-Rad），电感耦合等离子体质谱仪（PerkinElmer），液相色谱仪（Exion LC），质谱仪（AB 6500 plus），氯化铅（Sigma-Aldrich），MRS培养基（HuanKai Microbial），ELISA试剂盒（酶免），TGR5，β‑Actin，NLRP3，Tubulin抗体（Proteintech）。实验中所用的L.plantarum由南方医科大学微生物学系范宏英教授惠赠。
1.2 实验动物及分组和处理
本研究选用4~5周龄C57BL/6J雄性小鼠，购于南方医科大学动物实验中心，初始体质量16~19 g，单位许可证号为SCXK（粤）2016-0041，使用许可证为SYKX（粤）2021-0167，动物质量合格证为440022100037042。饲养环境严格控制为恒温22±2 ℃，相对湿度维持在50%~70%，空间环境遵循昼夜交替各12 h的自然节律。本实验方案经过南方医科大学动物实验伦理委员会的审查与批准（伦理批号：SMUL2022307）。
将24只C57BL/6J小鼠随机分为对照组、铅组、
L.plantarum+铅组，8只/组。对照组的小鼠饮用无菌蒸馏水。铅组、
L.plantarum+铅组的小鼠饮用氯化铅（100 mg/L）溶液，对照组和铅组的小鼠每天灌胃0.1 mL磷酸盐缓冲盐水1次，
L.plantarum+铅组小鼠每天灌胃含
L.plantarum（浓度为10
10 CFU/mL）的磷酸盐缓冲盐水0.1 mL 1次。本研究中使用的铅暴露剂量与课题组之前的研究一致
［12］，处理10周后，采用Morris水迷宫实验评价小鼠的学习记忆能力，行为测试完成后，使用1.25%三溴乙醇腹腔注射麻醉，眼眶后血管丛取血，颈椎脱位处死后，收集小组脑组织和肠内容物用于后续分析。
1.3 Morris水迷宫实验
水迷宫的装置是一个圆形的水箱（直径1.5 m），包含一个直径10 cm的隐藏平台浸没在水下1 cm处，小鼠接受1 d的适应性实验，在此期间，将小鼠放在每个象限中，在60 s内寻找隐藏的平台，在探索测试中，移除平台，监测小鼠总游泳距离、在目标象限中花费的时间和游泳距离。
1.4 酶联免疫吸附分析（ELISA）
取组织样本在4 ℃下3000 r/min离心20 min，根据试剂盒说明书的操作，绘制标准曲线和样品检测，用酶标仪测定吸光度A450 nm，独立重复实验3次。
1.5 Western blotting
取适量小鼠海马组织，加入细胞裂解液使脑组织裂解后，用组织匀浆仪充分裂解组织，离心后收集上清液，加入考马斯亮蓝G-250染色液，用酶标仪测定各个样品吸光度A560 nm，并依据标准曲线公式计算蛋白浓度，以确定各组上样量。经SDS-PAGE电泳和转膜后，用5%BSA室温封闭，用抗体NLRP3（1∶1000）、Tubulin（1∶10 000）、TGR5（1∶1000）、β-Actin（1∶10 000）4 ℃过夜，用对应的荧光二抗（1∶10 000）孵育1~1.5 h，Odyssey显影仪扫描荧光蛋白条带，用ImageJ软件对条带进行分析。
1.6 胆汁酸靶向代谢分析
将血清与甲醇混合，4 ℃下12 000 g离心10 min。使用真空浓缩器将上清液浓缩至干。加入100 μL 30%甲醇再溶解样品。使用0.22 µm滤膜过滤上清液，加入到LC-MS测试小瓶中，通过EXion LC液相色谱仪和AB 6500 Plus质谱仪定量胆汁酸。
1.7 HE染色
将脑组织在4%多聚甲醛中固定48 h后，包埋在石蜡中，并进行切片。所有切片均进行脱蜡和水合后，用苏木精染色5~10 min，再用伊红染色1~3 min后，进行脱水、透明并密封处理。在显微镜下观察并拍照。
1.8 铅含量的测定
将200 μL全血样品依次加入3 mL浓硝酸与1 mL分析纯过氧化氢，室温静置消解2 h，恒温130 ℃进行赶酸3 h，实时监测体积至≤500 μL终止程序，消解后待自然冷却至40 ℃以下，用去离子水定容至10 mL，使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定铅浓度。血铅含量计算公式为：血铅含量=所测得铅浓度*（10 mL/200 μL），单位换算为 μg/L。
1.9 统计学分析
使用GraphPad Prism（8.0版）进行统计学分析，实验数据表示为均数±标准差。两组资料比较使用Student t检验，多组资料采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。所有的实验均独立重复3次。
2 结果
2.1 L.plantarum缓解铅诱导的学习记忆能力障碍
益生菌干预铅暴露小鼠10周后，使用Morris水迷宫实验评估小鼠的学习和记忆能力。结果显示，各组小鼠的游泳速度无明显差异（
图1A）；与铅组相比，
L.plantarum+Pb组的小鼠寻找水下隐藏平台潜伏期显著减少（
P<0.001，
图1B）。在空间探索实验中，与铅组相比，
L.plantarum+Pb组的小鼠在目标象限的探索距离百分比（
P<0.05）、探索时间百分比（
P<0.05）、平台穿越次数更多（
P<0.05，
图1C~E）。
2.2 L.plantarum干预不影响铅的内暴露剂量
采用ICP-MS对实验小鼠全血铅浓度进行定量检测。与对照组小鼠的血铅（14.7±5.1 μg/L）相比，铅暴露组小鼠血铅水平（95.4±8.6 μg/L）升高，有统计学意义（
P<0.001），而
L.plantarum干预组与单纯铅暴露组之间的血铅浓度差异无统计学意义（
图2）。
2.3 L.plantarum干预部分恢复了铅暴露小鼠的胆汁酸代谢失调
PCA分析表明铅暴露组与其余两组之间的血清胆汁酸谱存在差异有统计学意义，PC1和PC2的贡献值分别为68.08%和22.18%（
图3A）。在检测的14种胆汁酸中，铅暴露导致血清中的脱氧胆酸（DCA）（
P<0.01）、3-羟基脱氧胆酸和3-羟基熊去氧胆酸（THDCA+TUDCA）（
P<0.05）、3-硫代脱氧胆酸（TDCA）（
P<0.001）和3-硫代α-甲基胆酸（T-alpha-MCA）（
P<0.05）等胆汁酸浓度下降，而（
L.plantarum+Pb）恢复了铅暴露引起的血清中DCA（
P<0.05）、THDCA+TUDCA（
P<0.05）、TDCA（
P<0.01）和T-alpha-MCA（
P<0.05）含量的降低（
图3B）。
2.4 L.plantarum通过抑制NLRP3蛋白减轻铅诱导的神经炎症
检测小鼠大脑海马区的病理变化以及小胶质细胞的激活状态，结果显示，铅暴露导致海马齿状回（DG）区域的细胞形态萎缩和染色加深，而
L.plantarum干预逆转了这一病理学现象；铅组小鼠的小胶质细胞呈现出胞体增大、突起增多且变粗的激活状态，经
L.plantarum干预后得到恢复（
图4A）。ELISA结果显示，铅组小鼠的海马组织和血清中的TNF-α和IL-1β水平均显著升高，经过
L.plantarum干预后，这些细胞因子水平均出现下降，除血清中的IL-1β水平的下降外，其他均有统计学意义（
图4B）。另外，与对照组相比，铅组小鼠海马区NLRP3蛋白和TGR5蛋白显著升高，在经过
L.plantarum干预后NLRP3蛋白得到恢复，但TGR5蛋白与铅暴露组相比没有改变（
图4C）。
3 讨论
铅是一种普遍存在的金属污染物，具有很强的毒性。美国疾病控制与预防中心于2021年将1~5岁儿童正常血铅参考限值更新为≤35 μg/L，但研究发现即使是低水平的铅也会产生毒性作用
［28， 29］。在本研究中，选择100 mg/L作为铅暴露的剂量，处理10周后使用水迷宫检测小鼠的学习记忆能力，发现在该暴露浓度下，铅暴露小鼠血铅浓度为95.4 μg/L，与我国现行高血铅标准（≥100 μg/L）相近，说明该水平的铅可引起小鼠的认知功能障碍。
肠道微生物的代谢产物可经脑肠轴进入神经系统发挥作用。复合益生菌制剂（含长双歧杆菌BL986、嗜酸乳杆菌LA1063、发酵乳杆菌LF26等菌株）能够通过调控EZH2-H3K27me3表观遗传通路有效改善铅诱导的神经功能损伤
［30］。
L.plantarum的干预表现出多重保护效应，该菌不仅能部分改善铅暴露导致的肠道菌群紊乱，还可显著改善小鼠记忆功能障碍，同时有效抑制海马体及外周血清中过度激活的炎症反应
［24］。本研究发现通过Morris水迷宫实验发现
L.plantarum+Pb组在寻找水下隐藏平台潜伏期显著减少，在空间探索实验中，
L.plantarum+Pb组在目标象限探索距离百分比、探索时间百分比、平台穿越次数中更多，说明
L.plantarum缓解铅诱导的学习记忆障碍。既往研究发发现
L. plantarum CCFM8661处理能通过抑制肠道铅吸收和促进粪便铅排泄，从而降低血液和脑组织中的铅水平
［31］，但本研究发现
L.plantarum干预组与单纯铅暴露组之间的血铅浓度未观察到显著差异，说明
L.plantarum干预改善铅致小鼠学习记忆能力下降不是通过降低血铅所引起的。
L.plantarum属于革兰氏阳性益生菌，具有耐酸、调节肠道菌群、降胆固醇等多种功能，而肠道微生物在胆汁酸代谢中起重要作用，不仅参与次级胆汁酸代谢，而且可调节肝脏中的胆汁酸合成过程
［25］。因此，我们通过靶向代谢组学检测小鼠血清胆汁酸水平后发现，铅暴露小鼠的胆汁酸代谢谱发生紊乱，而
L.plantarum干预的铅暴露小鼠的胆汁酸代谢谱中DCA、THDCA+TUDCA、TDCA和T-alpha-MCA有所恢复。我们推测可能是
L.plantarum处理后影响小鼠胆汁酸代谢，使小鼠血清胆汁酸含量部分恢复。在进行抗生素处理的伪无菌小鼠也发现了胆汁酸代谢失调，游离胆汁酸含量显著减少
［32］，也证明了肠道菌群在胆汁酸代谢中的重要作用。
为探讨
L.plantarum干预是否可减轻铅诱导的神经系统损伤，我们检测了小鼠大脑海马区的病理变化，发现铅暴露导致海马齿状回（DG）区域的细胞形态萎缩和染色加深，同时发现铅组小鼠的小胶质细胞呈现出胞体增大、突起增多且变粗的激活状态，而在经
L.plantarum干预后得到恢复。另外，铅组小鼠的海马组织中TNF-α和IL-1β水平均显著升高，经
L.plantarum干预后，TNF-α和IL-1β水平均出现显著下降。有研究表明，胆汁酸可通过脑-肠轴进入神经系统，激活TGR5受体发挥抗炎作用。TGR5是一种胆汁酸受体，激活TGR5可减轻肝性脑病、急性脑损伤引起的小胶质细胞激活
［33， 34］，相反，内源性TRG5表达的减少加剧了与小胶质细胞活化相关的神经炎症，并降低了突触后可塑性TGR5激活在神经系统疾病中发挥的神经保护作用，而本研究发现铅暴露使TGR5表达量升高，
L.plantarum干预后没有明显改变。这可能是铅暴露导致的胆汁酸的下降，使其受体TGR5代偿性升高，加入
L.plantarum干预后可能对铅暴露的有害刺激起了内源性神经保护作用
［35］，且部分恢复了胆汁酸代谢谱，而恢复的胆汁酸进入神经系统后激活TGR5受体，从而发挥抗炎作用，缓解铅诱导的神经炎症。另外，前期研究发现铅暴露通过激活NLRP3炎性小体促进神经炎症
［26， 27］，本研究结果表明铅暴露组小鼠NLRP3蛋白显著高于对照组，在经过
L.plantarum处理后逆转了这一现象，故
L.plantarum可能是通过调控胆汁酸代谢，抑制了NLRP3炎症小体，从而缓解铅诱导的神经炎症，恢复铅所致的小鼠学习记忆障碍。
综上所述，补充益生菌L.plantarum可恢复铅所导致的小鼠的学习记忆障碍以及神经行为异常，但不影响铅的内暴露剂量，其机制是通过调节胆汁酸代谢，降低NLRP3蛋白表达，降低炎症因子TNF-α和IL-1β水平，从而缓解铅诱导的神经毒性，本研究为治疗铅相关神经损伤提供了新的干预策略。本研究中铅暴露小鼠的血铅浓度为95.4 μg/L，接近我国高血铅标准的水平100 μg/L，此浓度的血铅可引起小鼠的神经炎症及认知功能障碍。本研究使用浓度为1010 CFU/mL 的L.plantarum进行干预，一般以小鼠为实验对象进行灌胃乳酸菌时，浓度范围通常在10⁷~10¹¹ CFU/mL，但仅使用单一浓度的L.plantarum干预不足以全面评估其效果和安全性，仍需测试一系列浓度以确定最优剂量。
广东省自然科学基金(2023A1515012500)
广东省自然科学基金(2024A1515012722)
京公网安备11010202008535号
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