化瘀通便汤通过抑制PI3K/Akt信号通路促进慢传输型便秘大鼠肠道Cajal间质细胞的胞葬作用

Huayu Tongbian Decoction promotes efferocytosis of interstitial Cajal cells in rats with slow transit constipation by inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway

摘要

目的 基于磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路，通过对慢传输型便秘（STC）大鼠结肠Cajal间质细胞（ICCs）胞葬过程的变化进行评价，探索化瘀通便汤对慢传输型便秘的作用机制。 方法 取SD大鼠采用盐酸洛哌丁胺混悬液灌胃法制备STC模型，随机分为模型组、化瘀通便汤中药低剂量组、化瘀通便汤中药中剂量组、化瘀通便汤中药高剂量组、阳性药物（莫沙必利）组，每组12只，另取12只SD大鼠灌胃等剂量生理盐水设为空白组。测量各组大鼠首次黑便时间、粪便含水率、肠道推进率；通过透射电镜观察分析Cajal间质细胞超微结构，计算线粒体空泡率；免疫荧光实验检测各组大鼠巨噬细胞吞噬率；HE染色检测各组大鼠结肠病理形态；免疫组织化学（IHC）染色检测各组大鼠结肠组织酪氨酸蛋白激酶受体（c-Kit）表达水平；Western blotting法检测大鼠结肠c-Kit、整联蛋白相关蛋白（CD47）、PI3K、Akt蛋白含量，分析各项指标与胞葬作用的相关性。 结果 与空白组比较，模型组大鼠出现典型的便秘症状，Cajal间质细胞超微结构明显损坏，大鼠结肠黏膜出现明显病理损伤，首次黑便时间、线粒体空泡率、CD47、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平明显升高（P<0.01），粪便含水率、肠道推进率、c-Kit蛋白表达水平明显降低（P<0.01），吞噬率两组无明显差异。与模型组比较，化瘀通便汤中药各剂量组大鼠Cajal间质细胞超微结构形态基本正常，大鼠结肠黏膜病理损伤明显减轻，粪便含水率、肠道推进率、吞噬率、c-Kit蛋白表达明显升高（P<0.05），首次黑便时间、线粒体空泡率、CD47、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白含量均降低（P<0.05），其中，化瘀通便汤中药高剂量组结果最为显著（P<0.01）。 结论 化瘀通便汤可能通过抑制PI3K、Akt的磷酸化，下调CD47蛋白表达，提高巨噬细胞吞噬率，从而促进Cajal间质细胞的胞葬过程，发挥对慢传输型便秘的治疗作用。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Huayu Tongbian Decoction (HYTBD) for relieving slow transit constipation (STC) in rats. Methods Sixty SD rat models of STC induced by intragastric administration of loperamide hydrochloride suspension were randomized equally into 5 groups for treatment with daily gavage with saline (STC model group), low-, medium-, or high-dose HYTBD, or mosapride (positive control group), with another 12 normal rats receiving saline gavage as the blank control group. The first black stool time, fecal water content and intestinal propulsion rate of the rats were measured, and the ultrastructure of interstitial Cajal cells (ICCs) was observed using transmission electron microscopy to calculate the mitochondrial vacuolar rate. The phagocytosis rate of macrophages was detected using immunofluorescence assay, and colonic pathologies were examined using HE staining. The colonic expression levels of c-Kit, CD47, PI3K and Akt were detected with immunohistochemistry or Western Blotting, and their correlations with efferocytosis were analyzed. Results The rat models of STC showed significant ultrastructural damage of the ICCs with increased first black stool time, mitochondrial vacuolar rate, and colonic expression levels of CD47, p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt proteins, lowered fecal water content, intestinal propulsion rate and c-Kit expression level, without significant changes in phagocytic rate. Treatment with HYTBD, especially at the high dose, significantly increased fecal water content, intestinal propulsion rate, phagocytosis rate and colonic c-Kit expression, and decreased the first black stool time, mitochondrial vacuolar rate, and colonic expressions of CD47, p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in the mouse models. Conclusion HYTBD improves STC in rats possibly by down-regulating colonic CD47 expression and improving macrophage phagocytosis rate via inhibiting PI3K and Akt phosphorylation, thereby promoting efferocytosis of the ICCs.

Graphical abstract

关键词

化瘀通便汤 / 胞葬作用 / 慢传输型便秘 / PI3K/Akt信号通路 / Cajal间质细胞

Key words

Huayu Tongbian Decoction / efferocytosis / slow transit constipation / PI3K/Akt signaling pathway / interstitial Cajal cells

慢传输型便秘（STC）是由于肠道传输无力导致肠内容物排出缓慢而引起的疾病，结肠内肠内容物移动迟缓、粪便干结以及患者排便次数明显减少均为常见的临床表现，多种治疗方法效果不明显，严重者甚至需要手术干预^［1-3］。中医中，STC被归类至“便秘”范畴。便秘最早出现于《黄帝内经》，书中将便秘称作“后不利”或者“大便难”^［4］。便秘的病因较为繁杂，多与饮食不节、情志失调、年老体弱及体质等有密切关系^［5］。目前其发病机制的研究主要集中于肠道神经系统、Cajal间质细胞（ICCs）、肠道平滑肌功能、肠道菌群、水通道蛋白等。凋亡是ICCs数量减少导致STC发生的主要机制之一^［6-8］，当ICCs在程序性死亡的状态下，细胞内的线粒体结构会被破坏，供能不足的ICCs产生的胃肠慢波也相应减少，从而导致STC的发生^{［9， 10］}。

胞葬作用^［11-14］是指巨噬细胞吞噬清除凋亡细胞的生物学过程，包括招募、识别、吞噬3个阶段。程序性死亡的ICCs形成凋亡体，正常情况下凋亡体可被巨噬细胞吞噬清除，若胞葬效率低下，ICCs凋亡体将持续堆积，引起继发性坏死和局部炎症反应，损伤周围正常ICCs，形成恶性循环。有研究证实^［15-17］，胞葬在抑制炎症、组织修复等方面起着重要作用，而STC同样存在炎症因子大量释放、ICCs细胞凋亡、坏死肠道组织修复等相似病理生理背景，但目前尚缺少胞葬在肠道组织修复中的作用及分子机制研究。

于永铎教授^［18］对STC应用活血化瘀法，并组方化瘀通便汤，全方的配伍特点是既行血分瘀滞，又解气分郁结，活血而不耗血，祛瘀又能生新，肝脾调达则诸症可愈。磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路表达异常与STC发生发展存在密切关联，且该通路可抑制ICCs细胞凋亡、促进ICCs细胞增殖^［19-21］。激活PI3K/Akt信号通路可促进替代活化型（M2型）向促炎的经典活化型（M1型）巨噬细胞转化，因此具有高吞噬活性的M2型巨噬细胞比例相对降低，吞噬能力也相对降低，胞葬作用则受到抑制^{［22， 23］}。本研究将创新性探讨胞葬作用基于PI3K/Akt信号通路促进肠道黏膜修复的机制，从大鼠结肠组织内ICCs超微结构、线粒体空泡率、巨噬细胞吞噬率、肠道黏膜组织病理变化、ICCs特异性蛋白酪氨酸蛋白激酶受体（c-Kit）蛋白表达、胞葬信号分子整联蛋白相关蛋白（CD47）表达等方面进行验证，为化瘀通便汤治疗慢传输型便秘的作用机制提供新的理论和治疗思路。

1 材料和方法

1.1 动物

SD雄性大鼠72只［清洁级，6~8周，体质量为180~220 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK（辽）2020-0001］，在辽宁中医药大学动物实验中心动物房中饲养：温度23~25 ℃、湿度50%~60%、昼夜循环（12 h∶12 h）。本研究经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批号：21000062024096）。

1.2 药品

盐酸洛哌丁胺胶囊（2 mg/粒，国药准字：H10910085，西安杨森制药有限公司），临用前以生理盐水配制成浓度为0.3 mg/mL的药液，4 ℃保存。枸橼酸莫沙必利片（5 mg/片，国药准字：H20090158，亚宝药业集团股份有限公司），以生理盐水配制成浓度为0.135 mg/mL的药液，4℃保存。化瘀通便汤中药颗粒剂（当归30 g，生地黄20 g，陈皮、赤芍、麦冬、桃仁、川芎、白术、法半夏、枳壳、柴胡、甘草各15 g，上述剂量为等效饮片剂量，均购自岐黄医官中药局），以蒸馏水配制成浓度为1.06、2.215、4.23 g生药/mL的混悬液，4 ℃保存。生理盐水（500 mL，国药准字：H20083400，四川科伦药业股份有限公司）。

1.3 主要试剂及仪器

p-Akt抗体、Akt抗体、p-PI3K抗体、PI3K抗体、c-Kit抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司）；CD47抗体（武汉三鹰）；HRP标记山羊抗兔二抗（Immunoway）；β-Actin抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；CD68抗体、TUNEL试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司）；光学显微镜（Olympus）；化学发光图像分析系统（Tanon-5200，上海天能科技有限公司）；透射电子显微镜（H-7650，Hitachi）；数字扫描显微镜（3DHistech）；多功能酶仪（Thermo Fisher）。

1.4 构建模型及评价

将大鼠适应性喂养1周后，随机将72只大鼠分为模型对照组60只、空白组12只。采用盐酸洛哌丁胺灌胃法构建STC大鼠模型^{［2， 24］}，模型对照组大鼠以0.1 mL/10 g予以盐酸洛哌丁胺混悬液3 mg/（kg·d）灌胃，空白组予以等量的生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃14 d。每日观察并记录大鼠的一般状况，造模结束后称量记录大鼠体质量，每组随机取10只大鼠进行肠道传输功能检测，分别检测首次黑便时间及粪便含水率，以模型对照组大鼠较空白组大便量减少、精神状态差、体质量及进食量减少，首次黑便时间延长及粪便含水率降低为模型制备成功。

1.5 分组和治疗

于造模完成时将模型对照组按照随机数表法分为模型组、化瘀通便汤中药低、中、高剂量组、阳性药物（莫沙必利）组，每组各12只。按照大鼠等效剂量^［25］折算，化瘀通便汤低、中、高剂量组给药浓度分别为10.575、21.15、42.3 g/（kg·d）。阳性药物组予以莫沙必利混悬液1.35 mg/（kg·d），模型组、空白组灌服等量生理盐水，各组均按0.1 mL/10 g灌胃，1次/d，连续灌胃14 d。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 大鼠一般情况

观察并记录各组大鼠体质量、进食量、精神状态、活动度、皮毛色泽、排便情况。

1.6.2 首次黑便时间、粪便含水率、肠道推进率

为验证模型是否制备成功以及分析治疗药物疗效，检测各组大鼠首次黑便时间、粪便含水率及肠道推进率。末次灌胃完成后，各组大鼠禁食不禁水24 h。禁食结束时，灌胃制备好的炭末混悬液0.1 mL/10 g，记录首次黑便时间为从炭末灌胃结束到大鼠第1颗黑便排出的时间。首次黑便时间检测完成后，将大鼠置于代谢笼内，食水正常，24 h后收集各组大鼠粪便并称量原粪便质量，将粪便放入烘干箱干燥后，称量并记录烘干粪质量。粪便含水率（%）=（原粪便质量-烘干粪质量）/原粪便质量×100%。粪便含水率检测完成后，禁食不禁水24 h，灌胃上述炭末混悬液0.1 mL/10 g，30 min后腹腔注射1%戊巴比妥钠充分麻醉，取大鼠幽门到直肠末端肠管，测量肠道总长度及炭末推进长度（即为炭末自幽门到直肠中推进的最远处的距离）。肠道推进率（%）=炭末推进长度/肠道总长度×100%。

1.6.3 透射电镜检测各组大鼠结肠ICCs超微结构

将大约1 mm³的结肠组织使用戊二醛固定，进行脱水、包埋、切片、染色后，使用透射电镜进行观察并拍照。每组取一张切片进行观察，随机摄取5个ICCs（20 000×），观察ICCs形态、线粒体形态等。统计每个细胞所含的正常线粒体、空泡化线粒体数量。确定空泡化线粒体的标准为：线粒体有双层膜结构，有残存的嵴结构，空泡形状不会异常大^［26］。线粒体空泡率（%）=（空泡化线粒体数量/线粒体总数）×100%。

1.6.4 CD68⁺-TUNEL⁺双重免疫荧光

固定结肠组织进行石蜡包埋，切片脱蜡后进行抗原修复，按TUNEL试剂盒说明书进行反应，以CD68抗体孵育、复染后封片，使用共聚焦显微镜进行图像采集。随机选择5个视野，计数所有CD68阳性的巨噬细胞数量为巨噬细胞总数，计数其中胞内含有TUNEL阳性信号的巨噬细胞数量为吞噬数，吞噬率（%）=（吞噬数/巨噬细胞总数）×100%。

1.6.5 结肠组织HE染色

取固定好的结肠组织进行梯度脱水、石蜡包埋切片，苏木精-伊红（HE）染色后封片，使用显微镜下观察并拍照。

1.6.6 免疫组化法检测结肠c-Kit蛋白水平

将结肠组织固定、石蜡包埋切片、抗原修复、封闭、靶标检测，最后拍照采集图像。

1.6.7 Western blotting法比较各组整联蛋白相关蛋白（CD47）、c-Kit、PI3K、Akt的表达

结肠组织裂解提取蛋白后，凝胶电泳、转印、封闭、一抗4 ℃过夜孵育（CD47、c-Kit、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗体稀释比均为1∶1000），予二抗（1∶9000）室温孵育后滴加发光液进曝光显影后成像分析。

1.7 统计学分析

将获得的实验图像采用Image J软件进行分析，使用SPSS26.0软件进行数据整理分析，计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布的组间比较进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化瘀通便汤对STC大鼠一般情况的影响

空白组大鼠精神状态佳，食水量及大便量均处于正常范围；造模后大鼠精神欠佳，毛发打结干燥，反应迟缓，食水量及大便量均有减少，经治疗后有不同程度的好转。因灌胃操作失误等情况每组均有1~2只大鼠的死亡，每组取10只检测以达样本均衡。

造模前，各组大鼠的体质量差异无统计学意义（P>0.05）。造模后各组大鼠体质量与空白组相比较均显著减轻（P<0.01），5组间差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后除高剂量组，其余各组大鼠体质量与空白组相比较明显减轻（P<0.01、P<0.05）；阳性药物组和中、高剂量组大鼠体质量与模型组比较显著增加（P<0.01、P<0.05，表1）。

2.2 化瘀通便汤对STC大鼠粪便含水率、首次黑便时间及肠道推进率的影响

除高剂量组，其余各组大鼠粪便含水率、肠道推进率较空白组均显著降低（P<0.01），首次黑便时间均明显延长（P<0.01）。阳性药物组和中、高剂量组大鼠粪便含水率、肠道推进率较模型组均显著升高（P<0.01），首次黑便时间均明显缩短（P<0.01，表2）。

2.3 化瘀通便汤对STC大鼠结肠ICCs超微结构的影响

空白组大鼠结肠ICCs超微结构清楚，ICCs数量较多，一般呈梭形，胞核较大，细胞质少，细胞器数量多，含丰富的线粒体和粗面内质网，发育良好，结构无明显异常；模型组大鼠结肠ICCs超微结构严重损伤，线粒体嵴断裂消失，大量出现空泡变性肿胀，内质网扩张脱颗粒变性，可见溶酶体；与模型组比较，化瘀通便汤及枸橼酸莫沙必利干预后，大鼠结肠ICCs形态基本正常，细胞器数量有所增加，线粒体空泡化减少，仍有轻度肿胀，内质网结构恢复正常（图1）。空白组大鼠线粒体空泡率明显低于其余各组（P<0.01），中剂量组、高剂量组、阳性药物组大鼠线粒体空泡率低于模型组（P<0.05，P<0.01）。

2.4 化瘀通便汤对STC大鼠胞葬水平的影响

空白组大鼠结肠组织中可见散在的巨噬细胞和极少数的凋亡体，未观察到吞噬事件发生；模型组中凋亡体明显增多，无明显双色信号出现；治疗后各组凋亡体仍较多，但吞噬事件发生率显著增加，其中高剂量组中双色信号最多（图2）。与空白组、模型组相比，中剂量组、高剂量组、阳性药物组吞噬率明显上调（P<0.01，表4），模型组与空白组、低剂量组吞噬率之间无明显差异。

2.5 化瘀通便汤对STC大鼠结肠组织形态的影响

空白组大鼠结肠黏膜组织形态正常，无明显病理改变；模型组大鼠结肠组织黏膜形态异常，杯状细胞减少，腺体结构破坏严重，可见炎性细胞浸润。与模型组比较，治疗后各组结肠黏膜糜烂程度明显改善，腺体结构紧密，其中高剂量组效果最佳（图3）。

2.6 化瘀通便汤对STC大鼠c-Kit、CD47、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达的影响

免疫组化结果表示（图4、表5），模型组大鼠的结肠组织c-Kit水平与空白组相比显著降低（P<0.01）；高剂量组大鼠结肠组织c-Kit表达与模型组比较明显升高（P<0.01）。Western blotting结果显示（图5、表6），模型组结肠组织c-Kit蛋白相对表达量与空白组比较有明显降低（P<0.01），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量则明显升高（P<0.01）；化瘀通便汤各组结肠组织c-Kit蛋白相对表达量与模型组比较有不同程度的升高（P<0.05），且高剂量组c-Kit蛋白相对表达量最高；化瘀通便汤各组与模型组比较，结肠组织中CD47、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量有不同程度的降低（P<0.05），且高剂量组CD47、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量最低。

3 讨论

ICCs作为胃肠道转运和传播电慢波活动的关键起搏细胞^［27］，其功能依赖于c-Kit/SCF系统及其下游信号通路的精密调控^［28］。本次研究发现STC大鼠模型中ICCs数量减少、c-Kit蛋白表达下降、吞噬率低，同时伴随CD47水平上调和PI3K/Akt通路异常激活，提示CD47/PI3K/Akt轴可能通过调控胞葬作用参与ICCs稳态失衡。STC大鼠ICCs出现过度凋亡，且ICCs表面的CD47持续性高表达，一方面促进Akt磷酸化^［29］，直接增强ICCs凋亡敏感性；另一方面通过与信号调节蛋白α链（SIRPα）结合发出“don’t-eat-me”信号抑制巨噬细胞对凋亡ICCs的清除^{［30，31］}，吞噬率低导致凋亡体积聚并引发局部炎症微环境，损伤周围健康ICCs细胞结构及肠黏膜屏障。这种微环境可能通过TNF-α/caspase途径进一步加剧ICCs凋亡，形成正反馈循环^［8，32］。

化瘀通便汤的干预实验显示，其能同时下调CD47表达从而提高吞噬率和抑制PI3K/Akt磷酸化，打破上述恶性循环，使磷脂酰丝氨酸（PtdSer）与TAM受体（Tyro3、Axl、MerTK）结合，将“eat-me”信号转化为吞噬信号，促进巨噬细胞吞噬清除凋亡细胞^［33］。研究表明^［34］，巨噬细胞极化可调控ICCs的功能与数量，而激活PI3K/Akt信号通路可促进巨噬细胞的极化，M1型巨噬细胞可产生肿瘤坏死因子-α而丢失c-Kit，且可通过天冬氨酸蛋白水解酶依赖性凋亡直接损伤ICCs；M2型巨噬细胞则有介导ICCs细胞修复的作用^［35］。化瘀通便汤可通过抑制PI3K/Akt信号通路从而抑制M2型巨噬细胞向M1型转化，减少M1型介导的ICC损伤；且M2型巨噬细胞具有高吞噬活性，M2型巨噬细胞相对比例的增高以及CD47低表达，可提高巨噬细胞吞噬凋亡ICCs的能力。通过上述两种路径共同促进了ICCs结构和功能的恢复。值得注意的是，高剂量化瘀通便汤表现出最显著的治疗效果，提示CD47/PI3K/Akt轴可能是其关键作用靶点。

综上所述，化瘀通便汤可通过抑制PI3K/Akt信号通路，下调STC大鼠体内的胞葬作用信号分子CD47蛋白表达，促进巨噬细胞吞噬ICCs凋亡体，防止凋亡体过度堆积，维持健康ICCs的正常功能，且提高修复肠黏膜结构的能力和恢复肠道传输功能。通过调控胞葬作用恢复ICCs稳态，而不仅仅是传统的促动力思路，在治疗STC等肠道传输功能障碍疾病中有重要的参考价值，后续研究可通过构建ICCs-巨噬细胞共培养体系，特异性敲低或过表达CD47及PI3K/Akt通路关键分子，直接验证该轴在ICCs胞葬过程中的调控作用，从而为靶向胞葬作用的肠道动力障碍治疗提供实验依据。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金(81804094)

辽宁省教育厅(JYTMS20231814)

辽宁省教育厅高校基本科研项目储备项目(2024-JYTCB-001)

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