异牡荆素通过促进SIRT3表达减轻糖尿病小鼠的心肌氧化应激损伤

Isovitexin alleviates myocardial oxidative stress injury in diabetic mice by enhancing myocardial SIRT3 expression and reducing oxidative stress

摘要

目的 研究异牡荆素（ISO）对糖尿病小鼠心肌的保护作用及机制。 方法 选用成年雄性C57小鼠18只，随机分为对照组、糖尿病组（DM）和DM+ISO组（n=6）。分离新生小鼠原代心肌细胞（NMCMs），分为对照组、高糖组（HG，33 mmol/L葡萄糖）、HG+ISO组及HG+ISO+3-TYP组（SIRT3抑制剂）。HE染色评估心肌损伤；ELISA检测心肌丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平；免疫组化和荧光检测iNOS、NOX2、8-OHdG表达；Western blotting分析NRF2、NOX2、NQO1、SIRT3等通路蛋白；流式细胞术定量活性氧水平。 结果 与对照组相比，DM组心肌细胞炎症浸润增加，白细胞介素-1β（IL-1β），白细胞介素-6（IL-6），α-肿瘤坏死因子（TNF-α）水平升高（P<0.01），NQO1，NRF2，SIRT3蛋白水平下降（P<0.01），NOX2，AC-SOD2蛋白水平增加（P<0.01），与DM组相比，DM+ISO组心肌细胞炎症浸润减少，IL-1β，IL-6，TNF-α水平下降（P<0.01），NQO1，NRF2，SIRT3蛋白水平恢复（P<0.01），NOX2，AC-SOD2蛋白水平减少（P<0.01）。 结论 ISO可通过促进SIRT3表达，有效减轻氧化应激来减缓糖尿病心肌损伤，从而显著改善糖尿病心肌病。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of isovitexin (ISO) on the myocardium of diabetic mice and explore its mechanism. Methods Eighteen adult male C57 mice were randomly divided into control group, diabetes mellitus (DM) group and DM+ISO group (n=6). Primary cultures of neonatal mouse cardiomyocytes (NMCMs) were exposed to high glucose (33 mmol/L) and treated with ISO alone or in combination with 3-TYP (a SIRT3 inhibitor). HE staining was used to evaluate myocardial injury in the diabetic mice, and the levels of MDA, SOD and GSH-Px in the myocardium were detected with ELISA. The expressions of iNOS, NOX2 and 8-OHdG were detected using immunohistochemistry and fluorescence staining. Western blotting was used to analyze the expression levels of NRF2, NOX2, NQO1, and SIRT3, and ROS levels were determined with flow cytometry. Results The diabetic mice showed obvious inflammatory cell infiltration in the myocardium, increased myocardial levels of IL-1β, IL-6 and TNF‑α, decreased expression levels of NQO1, NRF2 and SIRT3 proteins, and increased expression levels of NOX2 and AC-SOD2 proteins. ISO treatment of the diabetic mice significantly reduced myocardial inflammatory cell infiltration, lowered the levels of IL-1β, IL-6 and TNF‑α, restored the protein levels of NQO1, NRF2 and SIRT3, and decreased the protein levels of NOX2 and AC-SOD2. Conclusion ISO can alleviate diabetic myocardial injury in mice by promoting SIRT3 expression and reducing oxidative stress.

Graphical abstract

关键词

异牡荆素 / 糖尿病 / 心肌病 / 氧化应激 / SIRT3

Key words

isovitexin / diabetes mellitus / cardiomyopathy / oxidative stress / SIRT3

糖尿病患病率正在逐年升高^［1］，糖尿病患者极易发展为糖尿病心肌病（DCM），表现为糖尿病患者在无明显冠心病，高血压等其他心脏疾病的情况下出现的与糖尿病相关的炎症，线粒体功能障碍，氧化应激引起的心肌结构和功能异常^［2］。基础研究表明，DCM的发生与心肌细胞能量代谢紊乱、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、纤维化以及线粒体功能障碍密切相关。氧化应激是由于活性氧（ROS）生成与抗氧化防御系统之间的不平衡造成的，在糖尿病的发展中起主要作用^［3］，有研究表明，高血糖引起氧化应激增加，导致糖尿病大鼠左心室收缩功能受损和心肌衰竭^［4］。ROS主要在线粒体中产生，并引起线粒体功能和完整性破坏，加重心肌炎症和心肌细胞凋亡^{［5， 6］}。因此，为了防止糖尿病心肌病的发展，减少心肌氧化应激显得尤为重要。

异牡荆素（ISO）是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于多种中药植物中，如牡荆、竹叶等，具有显著的抗氧化和抗炎特性，被认为是一种参与线粒体保护和动态平衡的靶分子^［7］。ISO能够抑制NF-κB和MAPK等经典炎症信号通路，减少促炎因子如α-肿瘤坏死因子（TNF-α）、介素-6（IL-6）的表达，从而发挥抗炎作用^［8］。近年来研究还发现，ISO在心血管疾病、神经退行性疾病等方面也具有潜在的治疗价值^［9］。Sirtuin-3（SIRT3）是一种高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的去乙酰化酶，主要在线粒体中表达，调节了线粒体生物学，包括ATP生成、线粒体动力学和线粒体未折叠蛋白反应的许多方面^{［10， 11］}。近年来，SIRT3已被报道参与了氧化应激和心肌炎症的发病机制^［12-14］。然而，关于ISO的抗氧化具体作用机制尚不清楚，其中，SIRT3是否参与了ISO的抗氧化应激损伤作用值得进一步探索。

本研究从氧化应激角度出发，结合体内外实验验证，系统探讨糖尿病心肌病后心肌细胞的氧化应激损伤变化，并评估ISO在这一过程的保护作用及相关机制，找到SIRT3作用ISO发挥抗氧化作用的主要靶点，为ISO在DCM治疗中的临床应用提供理论依据和实验支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

所有实验程序均符合美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》，并获重庆医科大学动物研究委员会批准（伦理批号：IACUC-CQMU-2025-0485）。实验选用成年健康雄性C57小鼠（体质量20~25 g），购自重庆医科大学实验动物中心。小鼠饲养于重庆医科大学实验动物中心，环境条件为：温度26±2 ℃、相对湿度50%±15%、12 h明暗交替的光照周期。所有小鼠均自由摄食和饮水。

1.1.2 试剂与仪器

NRF2（1∶1000）、AC-SOD2 （1∶1000）、NQO1 （1∶1000）（Affinity），NOX2 （1∶2000） SIRT3（1∶1000）， GAPDH （1∶10 000）iNOS（1∶200）， NOX4（1∶200）（Proteintech）。丙二醛（MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、检测试剂盒和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。8-OHdG（1∶200， MedChemExpress）。山羊抗兔IgG（1∶10 000）、山羊抗鼠IgG（1∶10 000） （Thermo Fisher）。免疫荧光染色试剂盒（湖南艾方生物科技有限公司），活性氧检测试剂盒（碧云天）。

主要仪器：CCL⁃170B⁃8细胞培养箱（ESCO）；高速台式冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific）；低温高速组织研磨仪（Servicebio）；电泳仪、转膜仪、ChemiDoc MP全能型凝胶成像系统（Bio-Rad）；荧光显微镜（徕卡DM4B）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠模型建立

将C57小鼠随机分为4组：对照（Sham）组，糖尿病（DM）组和糖尿病+ISO（DM+ISO）组，糖尿病+ISO+3-TYP（DM+ISO+3-TYP）组，每组6只。根据文献的方法^［15］，通过高脂饮食喂养4周，连续5 d腹腔注射链脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）的方法构建糖尿病模型。随后，根据先前的研究^［16］，对DM+ISO组每隔2 d腹腔注射ISO 15 mg/kg，对照组和糖尿病组注射等量0.9%的生理盐水，持续4周，对于DM+ISO+3-TYP组，在最后1周时，每2 d腹腔注射1次3-TYP（50 mL/kg），共3次。4周后，对小鼠实施二氧化碳麻醉处死，收集组织。

1.2.2 心肌细胞分离和培养

新生C57小鼠（1~2日龄；重庆医科大学实验动物中心）心室组织中分离出原代小鼠心肌细胞（NMCMs），实验方法参照既往研究^［17］。简言之，麻醉小鼠后取出心室组织并剪碎，采用胰蛋白酶和胶原酶消化心肌细胞，经1000 g离心5 min后收集心肌细胞，重悬于杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）-F12（Gibco）、10%胎牛血清（FBS；HyClone）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）混合培养液中，置于37 ℃、5% CO₂和95%空气条件（CON组）的培养箱中培养。

1.2.3 细胞培养和处理

NMCMs经消化，离心，重悬和铺板后，在细胞贴壁后进行分组干预，细胞被分为以下4组：对照组，高糖组，HG+ISO组，HG+ISO+3-TYP组。根据先前文献^［16］，采用33mmol/L葡萄糖浓度的培养基和150 μml/L的ISO处理细胞。

1.2.4 苏木精-伊红（HE）染色

小鼠通过吸入二氧化碳处死后，取出心脏并浸入4%多聚甲醛固定，经乙醇梯度脱水后石蜡包埋，沿心脏短轴方向切成5 μm厚切片。切片经二甲苯和酒精脱蜡后，在通风橱内依次进行苏木精染色与伊红染色。切片经常规脱水、透明、封片后，使用组织切片扫描仪扫描，查看心肌损伤程度。

1.2.5 ELISA测定心肌组织

收集心脏组织后，使用ELISA检测心肌组织中氧化应激水平。MDA，GSH-Px和SOD的浓度分别采用MDA检测试剂盒，GSH-Px检测试剂盒和SOD测定试剂盒进行测定，具体操作遵循制造商说明书。

1.2.6 免疫组织化学（IHC）染色

对组织切片进行脱蜡、水化及洗涤处理。抗原修复环节中，切片先经3%过氧化氢溶液浸泡10 min，再用5%牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，随后与抗iNOS和NOX4抗体4 ℃孵育过夜。继而采用HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次后进行DAB显色。最终通过荧光显微镜观察心肌组织结构，并运用ImageJ软件定量分析各实验免疫组化阳性率。

1.2.7 免疫荧光（IF）染色

组织石蜡切片经脱蜡处理后进行抗原修复。切片用0.3% TritonX-100透化，5%山羊血清封闭2 h。滴加8-OHdG抗体4 ℃孵育过夜。PBST洗涤后加入山羊抗兔二抗，最后使用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片。通过荧光显微镜观察心肌切片荧光信号，并采用Image J软件进行图像分析。

1.2.8 细胞活性氧检测

细胞处理完成后，与DCFH-DA（10 μmol）避光孵育30 min后，用无血清培养基洗涤3次以去除残留探针。使用荧光显微镜采集荧光强度图像（DCFH-DA激发波长488 nm，发射波长525 nm）。采用ImageJ软件定量分析平均荧光强度。

1.2.9 流式细胞分析

细胞处理完成后，收集100万个NMCMs，使用活性氧检测试剂盒对细胞进行染色，随后用特定缓冲液洗涤3次，并在25 ℃条件下以800 r/min离心5 min。弃去上清液后，将细胞重悬于300~500 μL缓冲液中。最后使用Coulter-XL流式细胞仪配合EXPO32 ADC分析软件对标记细胞进行检测和定量分析。

1.2.10 Western blotting分析

细胞或组织在RIPA裂解缓冲液中于4 ℃条件下裂解1 h，随后以12 000×g的转速离心15 min。收集蛋白上清液并浓缩，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。接下来，取适量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。依据相应的相对分子质量，将含有蛋白的凝胶进行水平切割，并转移至PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶封闭PVDF膜后，在4 ℃条件下与以下抗体孵育过夜：NRF2，NOX2，NQO1，AC-SOD2，SIRT3，GAPDH。将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔或抗鼠IgG二抗（1∶10 000，赛默飞）在室温下孵育1 h。化学发光试剂试剂盒（碧云天生物技术有限公司）检测蛋白质，并通过Image J软件对蛋白质浓度进行定量分析 。

1.3 统计学分析

所有数据均以均数±标准差表示，并采用Shapiro-Wilk正态性检验评估数据分布的正态性。符合正态分布的数据通过两组间非配对双尾Student's t检验进行分析。多组比较（≥6组）采用单因素方差分析，后续进行Scheffe检验、Bonferroni事后检验或Dunnett多重比较检验。数据分析与图表绘制使用GraphPad Prism 9.0软件完成，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ISO减轻糖尿病小鼠心肌损伤

HE染色结果显示，与Sham组相比，DM组的心肌细胞炎症浸润加剧，细胞呈现肿胀破裂形态，并伴有大量炎症细胞浸润，而DM+ISO组炎症反应较低，细胞形态紊乱减轻（图1A）。ELISA结果显示，相比Sham组，DM组心肌组织中的MDA含量升高4倍，GSH-Px水平降低了60%，SOD活性降低了40%（P<0.01），而DM+ISO组相比DM组的GSH-Px和SOD活性升高了约30%，MDA水平下降了40%左右（P<0.01，图1B~D）。Western blotting结果显示，相比Sham组，DM组的AC-SOD2，NOX2蛋白表达提升了2倍（P<0.01），而NQO1，NRF2，SIRT3蛋白水平下降（P<0.01）。与DM组相比，DM+ISO组的SIRT3蛋白表达提升约50%，NQO1，NRF2蛋白表达升高（P<0.01）。此外，ISO显著减轻了NOX2和AC-SOD的蛋白生成（P<0.01，图1E、F）。

2.2 ISO减轻糖尿病小鼠心肌氧化应激

免疫荧光结果显示，与Sham组相比，DM组的红色荧光强度显著增加（P<0.01），ISO治疗后荧光强度降低了50%左右（P<0.01），表明ISO显著减轻了糖尿病导致的氧化应激损伤（图2A、B）。通过诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和NADPH氧化酶4（NOX4）免疫组化检测小鼠心肌氧化应激水平，结果显示，相较于Sham组，DM组心肌组织iNOS蛋白表达提升了约3倍，NOX4蛋白表达水平显著上升（P<0.01）。与DM组相比，DM+ISO组的iNOS表达降低了60%左右，NOX4蛋白水平降低了40%左右（P<0.01，图2C~F）。

2.3 ISO减轻新生小鼠心肌细胞氧化应激

ROS染色结果显示，与正常组相比，HG组ROS水平升高约5倍（P<0.01），而与HG组相比，HG+ISO组ROS水平下降了50%（P<0.01，图3A、B）。Western blotting结果显示，与正常组相比，HG组的NOX2，AC-SOD2的表达水平升高2倍（P<0.01），SIRT3，NQO1， NRF2蛋白表达降低（P<0.01）。而与HG组相比，ISO治疗使得SIRT3蛋白表达升高40%，NOX2，AC-SOD2的表达降低1倍（P<0.01），NQO1，NRF2蛋白表达恢复50%，且差异具有统计学意义（P<0.01，图3C、D）。

2.4 ISO通过激活SIRT3在体外发挥保护作用

Western blotting结果显示，与CON组相比，HG组的NOX2和AC-SOD2表达升高，NRF2，NQO1及SIRT3表达下降（P<0.01）。而相比HG组，HG+ISO组的NRF2、NQO1及SIRT3表达水平得到恢复，NOX2和AC-SOD2蛋白表达降低（P<0.01）。3-TYP可阻断了SIRT3的表达，与HG+ISO组相比，HG+ISO+3-TYP组的SIRT3表达受到抑制，蛋白水平下降50%，NOX2和AC-SOD2表达升高，NRF2，NQO1表达下降（P<0.01，图4A、B）。流式细胞术分析显示，HG组ROS阳性细胞比例增加4倍，而HG+ISO组的ROS阳性细胞比例减少，相比HG+ISO组，HG+ISO+3-TYP组ROS阳性细胞比例增加1倍（P<0.01，图4C、D）。

2.5 ISO通过激活SIRT3在体内发挥保护作用

ELISA结果显示，相比DM组，DM+ISO组心肌组织中的MDA含量降低50%，GSH-Px水平和SOD活性升高1倍（P<0.01），而3-TYP处理后，相比DM+ISO组的MDA水平升高了1倍，GSH-Px水平和SOD活性下降了50%左右（P<0.01，图5A~C）。Western blotting结果显示，相比DM组，DM+ISO组的NQO1，NRF2蛋白表达显著上升，SIRT3蛋白水平升高约1倍（P<0.01），而AC-SOD2，NOX2蛋白水平显著下降（P<0.01）。与DM+ISO组相比，DM+ISO+3-TYP组的SIRT3蛋白表达下降4倍，NQO1，NRF2蛋白表达均降低（P<0.01）。此外，ISO显著增加了NOX2和AC-SOD的蛋白生成（P<0.01，图5D、E）。

3 讨论

自1972年研究提出了"糖尿病性心肌病"这一病种^［18］以来，越来越多的研究者对这一疾病给予重视，但糖尿病患者中该病症的患病率仍然被低估。该病症表现为约12%的糖尿病患者出现心功能异常，最终导致明显的心力衰竭和死亡，此外，2型糖尿病（T2DM）患者的男性和女性心力衰竭发病率分别比同性别非糖尿病人群高出至少2.4倍和5.1倍^［19］。糖尿病心肌病是独立于冠心病和高血压的糖尿病特异性并发症，其病理基础涉及心肌代谢重编程、线粒体动力学失衡、程序性细胞死亡等多维度机制。线粒体融合分裂失衡是糖尿病心肌病的核心病理特征，线粒体的损伤可激活细胞氧化应激反应^{［20， 21］}，氧化应激是推动DCM进展的关键因素，氧化应激是指过量ROS的产生超过了抗氧化剂的固有能力，导致蛋白质、脂质和DNA的损伤，这些损伤均在包括糖尿病在内的各种疾病的病理过程中发挥关键作用^{［22， 23］}。本研究显示糖尿病小鼠的心肌组织中，氧化应激信号通路被激活，关键蛋白NOX2，AC-SOD2表达升高，抗氧化蛋白SIRT3，NQO1，NRF2表达下降，而ISO治疗能显著抑制心肌组织中NOX2，AC-SOD2蛋白表达，恢复SIRT3，NQO1，NRF2蛋白水平，从而减少心肌细胞的氧化损伤。

近年来，ISO因其广泛的抗炎和抗氧化功能受到重视，ISO广泛参与调节炎症因子，氧化应激和自由基清除等作用^{［7， 8， 24］}。有研究发现，ISO能够通过激活SKN-1/NRF2信号通路，上调抗氧化蛋白表达，减轻氧化应激，延缓衰老进程^［25］。Pal团队的研究进一步表明，ISO通过脂肪细胞受体和线粒体生物发生通路PGC-1α^［26］，诱导氧化磷酸化与ATP合成，最终促成成骨细胞分化。此外，ISO通过激活Nrf2/HO-1信号轴，增强细胞的抗氧化能力，减轻氧化应激对组织的损伤^［7］。本研究结果显示，糖尿病小鼠心肌中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α均显著升高，且心肌细胞呈现肿胀破裂形态，并伴有大量炎症细胞浸润，这与NOX2/AC-SOD2通路的激活释放炎症因子有关。ISO治疗可显著降低这三种炎症因子水平，并改善心肌结构损伤，对心脏起保护作用，提示ISO可降低DCM的炎症反应。MDA是氧化应激的标志物，GSH和SOD是消除过量MDA和ROS的关键抗氧化酶，我们发现，糖尿病小鼠心肌发生氧化应激，导致MDA积累，GSH和SOD表达降低，抗氧化能力减弱，炎症水平升高。结果显示，ISO治疗能够使得糖尿病小鼠心肌的氧化应激得到改善，表现为MDA含量下降，GSH和SOD的含量上升，提示ISO能够减轻活性氧的激活，从而减轻小鼠糖尿病心肌损伤。

为了进一步揭示ISO减轻DCM氧化应激的具体机制，我们在体外使用SIRT3抑制剂3-TYP进行进一步研究。SIRT3是线粒体定位的NAD⁺依赖性去乙酰化酶，在维持细胞能量代谢稳态、抗氧化防御和线粒体功能调控中发挥关键作用^{［27， 28］}。它可以调控ROS的生成，通过改变SOD2的乙酰化来调节氧化应激的清除，增加SOD2的产生^［29］。先前有研究表明，SIRT3在心肌重构中发挥重要作用^［30］，SIRT3敲除小鼠发生大量心肌纤维化^［31］，SIRT3通过对FOS/AP-1的抑制作用，减轻心肌纤维化的产生^［12］。由于我们在小鼠心肌组织中观测到氧化应激蛋白水平的变化，而SIRT3在氧化应激调控中起重要作用，因此推测ISO可能通过调控SIRT3来发挥抗氧化作用，进一步检测了SIRT3蛋白的变化。Western blotting结果显示，糖尿病后小鼠SIRT3蛋白的表达水平显著下降，而ISO治疗恢复了这一变化，随后，使用NMSMs中进行进一步的机制探究，通过添加3-TYP抑制SIRT3激活后，Western blotting结果显示，HG+ISO+3-TYP组NOX2，AC-SOD2表达升高，抗氧化蛋白SIRT3，NQO1，NRF2表达下降。此外，流式细胞术显示，HG处理可激活细胞的氧化应激水平，而HG+ISO可抑制细胞氧化应激，但这种效果在使用3-TYP后消失，提示ISO通过激活SIRT3来发挥抗纤维化和抗氧化应激作用。

综上所述，本研究揭示了ISO对心肌保护作用的两项新发现。首先，我们证实ISO能有效减轻糖尿病导致的心肌损伤，这表明其可能通过最大限度减少氧化应激来保护心脏。其次，发现这种保护作用与SIRT3激活相关，ISO通过激活SIRT3来减轻氧化应激。这些发现阐明了ISO的心脏保护的潜在机制，使其成为治疗糖尿病极具前景的新型疗法。

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