姜黄素通过抑制RANBP3L基因表达减轻2型糖尿病小鼠的骨质疏松症

Curcumin improves osteoporosis in type 2 diabetic mice by inhibiting RANBP3L expression

摘要

目的 探讨姜黄素通过影响Ran结合蛋白3样（RANBP3L）的表达对2型糖尿病（T2DM）引起的骨质疏松的治疗作用。 方法 取MC3T3-E1细胞，成骨诱导培养后随机分为以下4组：对照组（Control），高糖处理组（HG），姜黄素组（Cur），高糖处理+姜黄素组（HG+Cur），药物预先干预24 h。CCK-8法筛选姜黄素最佳干预浓度；碱性磷酸酶（ALP）和茜素红S（ARS）染色检测成骨分化和矿化相关标志物；采用RNA-seq测序分析姜黄素干预后高糖下培养MC3T3-E1成骨细胞转录特征。体内实验中，通过高脂饮食（HFD）和链脲霉素（STZ）注射建立T2DM小鼠模型，20只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为4组： 正常+溶剂组（Ctrl+Veh）、T2DM模型+溶剂组（T2DM+Veh）、T2DM模型+ RANBP3L敲低+溶剂组（T2DM+KD+Veh）、T2DM模型+ RANBP3L敲低+姜黄素组（T2DM+KD+Cur），5只/组。T2DM+KD+Cur组每日给予58 mg/kg的姜黄素灌胃处理，其余各组给予等量溶剂灌胃。ELISA检测小鼠血脂水平；HE染色观察骨微结构特征；茜素红S染色检测钙盐沉积情况；免疫组化染色检测ALP、RANBP3L表达；Q-PCR和Western blotting检测小鼠骨组织中RANBP3L、OCN、RANKL表达，及TNF-α/NF-κB通路相关蛋白表达情况。 结果 姜黄素可促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化，下调RANBP3L蛋白的表达（P<0.01）。体内研究表明，当RANBP3L基因敲减后，模型小鼠的骨微结构增强，成骨标志物水平提高，血糖浓度降低，血脂平衡改善，且TNF-α/NF-κB信号通路相关蛋白受抑制（P<0.05），联用姜黄素后可进一步降低小鼠骨组织中RANBP3L的表达并加强治疗效果（P<0.05）。 结论 姜黄素可通过降低RANBP3L的表达，促进成骨分化能力，缓解糖脂代谢紊乱，减轻二型糖尿病骨质疏松症，可能通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路发挥作用。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of curcumin for osteoporosis induced by type 2 diabetes mellitus (T2DM). Methods In cultured MC3T3-E1 osteoblasts exposed to high glucose (HG), the effects of curcumin treatment on osteogenic differentiation and mineralization were examined by assessing alkaline phosphatase (ALP) activity and using alizarin red S (ARS) staining. RNA-seq sequencing was used to analyze the transcriptional characteristics of MC3T3-E1 osteoblasts in HG culture after curcumin treatment. In a mouse model of T2DM established by high-fat diet feeding and streptococcal injection, the effects of solvent vehicle, vehicle+RANBP3L knockdown, and RANBP3L knockdown+curcumin treatment on blood lipids, bone microstructure and calcium deposition was evaluated using ELISA, HE staining, and Alizarin red S staining. Osteogenic differentiation ability of mouse femoral tissues were assessed by detecting ALP, RANBP3L, OCN and RANKL expressions using immunohistochemical staining, RT-qPCR and Western blotting, and the changes in the TNF‑α/ NF‑κB pathway were detected with Western blotting. Results Curcumin obviously promoted proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells in HG culture and down-regulated cellular expression of RANBP3L protein. In the diabetic mouse models, RANBP3L knockdown significantly improved bone microstructure and blood lipid balance, increased expression levels of osteogenic markers, decreased blood glucose level, and caused inhibition of the TNF‑α/NF‑κB signaling pathway. The combined treatment with curcumin further reduced RANBP3L expression levels in the bone tissue and significantly enhanced the therapeutic effect. Conclusion Curcumin promotes osteogenesis, alleviates glucose and lipid metabolism disorders, and improves osteoporosis in type 2 diabetic mice possibly by inhibiting TNF‑α/NF‑κB signaling pathway via suppressing RANBP3L expression.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / RANBP3L / 2型糖尿病骨质疏松 / RNA转录组测序

Key words

curcumin / RANBP3L / type 2 diabetes osteoporosis / mRNA sequencing

2型糖尿病（T2DM）作为一种慢性代谢性疾病，主要特征为胰岛素抵抗以及β细胞功能逐步下降^［1］。研究显示，糖尿病患者患骨质疏松症的风险显著增高，这可能由多种因素所致，如胰岛素抵抗、慢性炎症以及骨代谢紊乱等，这种状况致使成骨细胞功能降低，同时破骨细胞活性提高，打乱了成骨和骨吸收机制间的平衡^［2-4］。另外晚期糖基化终末产物的积聚以及脂质代谢失调或许会对骨的微观结构产生影响^［5］。当前针对T2DM性骨质疏松症，依旧欠缺理想的治疗策略与特效药物，传统药物（如双磷酸盐、钙补充剂、地诺单抗）主要针对骨吸收或骨形成单一路径，难以对T2DM骨质疏松症的复杂病理网络进行干预，在疗效和安全性方面存在诸多不足，对糖脂代谢紊乱的改善作用有限^［6-8］。找到针对糖尿病骨质疏松症病因的药物并检测其效果，对开发更好的治疗方案尤为重要。

姜黄素（Cur）是从姜黄类植物中提取的一种多酚类化合物，因其对多种疾病有潜在治疗作用而知名，大量研究说明，姜黄素有抗糖尿病、降脂、抗氧化以及抗炎等特性^［9-12］。已观察到这些效应能降低升高的血糖水平并减缓糖尿病相关并发症的发展^［13］。研究说明，姜黄素可减轻糖尿病引发的心脏、视网膜和肾脏等各器官系统并发症，且有影响骨代谢过程的潜力^［14-17］。另有研究发现，姜黄素可以减轻糖尿病对骨骼健康的影响^［18］，姜黄素预处理可通过调节TGFβ/Smad2/3信号通路促进高糖环境下的成骨，从而增强糖尿病大鼠的骨形成^［19］。尽管姜黄素有广阔应用前景，但其具体作用机制仍不明确，尤其是在T2DM引发的骨质疏松方面。

Ran结合蛋白3样（RANBP3L）属于Ran结合蛋白家族，其特征是含有Ran结合结构域。Ran是Ras超家族的一种小GTP酶，在细胞核和细胞质之间的物质转运以及细胞周期的调节中至关重要^{［20， 21］}。相关研究表明，RANBP3L显著影响BMP信号调控，其表达水平与干细胞分化和成骨分化相关^［22］。目前，RANBP3L在T2DM骨质疏松症中的作用尚缺乏详细的研究。本研究探讨了姜黄素对高糖条件下骨细胞生长的影响，采用RNA-seq测序分析确定了RANBP3L是一个受姜黄素影响的关键靶基因，并建立T2DM小鼠模型进行初步验证，观察姜黄素及特定基因对糖尿病小鼠成骨能力的影响，以期揭示姜黄素治疗T2DM相关骨质疏松症的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及动物

小鼠MC3T3-E1 细胞购自湖南丰晖生（CL0204）。8周龄雄性C57BL/6小鼠，采购于南方模式生物［生产许可证号码：SCXK（沪）2019-0002］。所有动物实验操作和饲养均遵循实验动物福利及伦理要求，本研究涉及动物的所有程序均得到蚌埠医学院实验动物管理和伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字［2004］第368号）。

1.1.2 药物及主要试剂

姜黄素（瑞芬思德丹生物科技公司）；CCK-8试剂盒（佰欧晶生物）；MC3T3-E1细胞成骨诱导分化培养基（赛业）；碱性磷酸酶染色试剂盒（索莱宝）；AG RNAex Pro RNA提取试剂；SYBR Green Pro Taq HS预混型（艾科瑞生物）；ECL化学发光检测试剂盒（Proteintech）； 成骨细胞矿化结节染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂混合物PVDF膜（碧云天）；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（爱必信）；链脲霉素（源叶）；60%脂肪供能高脂饲料（协同）；抗小鼠/ 兔二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒、苏木素、伊红染色液（ebiogo）；TG、LDL、HDL酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（上海酶联）；TC ELISA检测试剂盒（上海科艾博）。

1.1.3 主要仪器

生物安全柜（Thermo）；酶标仪（Tecan）；荧光显微镜（Mshot）；qTOWER3 Real-Time PCR Thermal Cycler（Analytikjena）；超微量紫外可见分光光度计（Implen）；化学发光成像系统（杭州申花）；生物组织摊烤片机、脱水机、包埋机（湖北亚光）；显微镜（OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理

MC3T3-E1细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基中培养（37 ℃、5%CO₂）。待细胞密度超过80%后，收集细胞以8×10⁴/cm²的密度接种与六孔板中，按照2 mL/孔分别注入小鼠MC3T3-E1细胞成骨诱导分化培养基。3 d/次更换培养基，7 d或14 d后观察成骨分化情况。成骨诱导后，把细胞分为对照组（Control），高糖处理组（HG），姜黄素组（Cur），高糖+姜黄素组（HG+Cur）。应用α-MEM培养基（5.5 mmol/L葡萄糖）培养正常组细胞；高糖处理组中使用含25 mmol/L葡萄糖的α-MEM培养基；姜黄素组细胞即在正常培养基中加入1 μmol/L姜黄素预先处理24 h的细胞；高糖+姜黄素组细胞即使用1 μmol/L姜黄素预先处理24 h的在含25 mmol/L葡萄糖α-MEM培养基中培养的细胞。

1.2.2 CCK-8检测细胞活性

在采集细胞后，对其进行计数，并以2×10³/孔的密度分配到96孔板上，随后向其中添加了浓度为0、0.5、1、2、4、8、32 μmol/L的姜黄素，不同浓度的姜黄素处理24 h后在含25 mmol/L葡萄糖的α-MEM培养基培养24 h，在接下来的5 d里，1 d/次从各个孔中提取样品，并加入10 μL/孔的CCK-8液体后，将样品板放入恒温箱中继续培养2 h。最后，采用酶联免疫吸光度法对培养结束后的样本检测吸光度A_{450 nm}。

1.2.3 ALP染色

各组细胞在成骨诱导培养基中培养7 d后，去除原培养基使用PBS洗涤；加入配置好的ALP固定液固定样品45 s，蒸馏水清洗后，去除剩余水分。每孔样品滴加1 mL ALP孵育液，置于37 ℃孵育20 min，加入蒸馏水清洗干净，之后于显微镜下拍照观察。

1.2.4 茜素红染色

成骨诱导培养基中培养14 d后按上述分组处理，去除原培养基，PBS洗涤3次。使用固定液固定20 min，洗涤3次。加入适量茜素红S染液，均匀覆盖细胞染色30 min。蒸馏水充分冲洗，随后在镜下观察染色情况。

1.2.5 MC3T3-E1细胞RNA-seq分析及验证

取高糖处理组及高糖+姜黄素组的MC3T3-E1细胞进行RNA测序分析（百迈客生物公司）。从细胞中提取总RNA，NanoDrop 2000（Thermo）检测RNA浓度和纯度。生成测序文库，测序在Illumina NovaSeq平台上进行，并通过生物信息学分析平台BMK Cloud（www.biocloud.net）对原始读数进行后续处理。使用 DESeq2对两组进行差异表达分析，由DESeq2分析的校正后P<0.05和|log₂ FC|>2的基因被指定为差异表达。京都基因和基因组百科全书（KEGG）对差异表达基因进行通路富集分析。

1.2.6 qRT-PCR实验

从细胞样本或小鼠股骨组织中分离总RNA，配制逆转录体系对提取的RNA进行逆转录，采用SYBR Green Pro Taq HS预混PCR试剂盒（Aikori Biotechnology）进行qPCR反应，反应条件按95 ℃，预变性30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s循环40次。靶基因的表达水平随后根据GAPDH的表达进行标准化。使用2^{- ΔΔCt}方法评估成骨细胞或股骨组织中mRNA表达的变化。引物由通用生物股份有限公司设计合成，序列如表1。

1.2.7 Western blotting

收集细胞或股骨组织，用 RIPA 裂解液提取蛋白质，BCA法测定检测所提取蛋白的浓度；每组30 μL蛋白溶液，通过电泳法进行分离，并将分离好的样品转膜后密闭2 h，继而于4 ℃的环境中与一抗孵育（OCN，1∶1000；RANKL，1∶5000；TNF-α，1∶1000；NF‑κB p65，1：1000；p-p65，1∶1000；IKKβ，1∶1000；p-IKKβ，1∶1000；IκB‑α，1∶1000；p-IκB‑α，1∶1000；GAPDH，1∶10 000），然后与HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000）和HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000）孵育。在增强型化学发光底物反应后进行成像，并对图像中的灰度值进行评估。

1.2.8 动物实验

实验小鼠在温度范围为22~24℃，相对湿度为50%~60%环境下饲养。适应1周后将小鼠随机分为4组：正常+溶剂组（Ctrl+Veh）、T2DM模型+溶剂组（T2DM+Veh）、T2DM模型+RANBP3L敲低+溶剂组（T2DM+KD+Veh）、T2DM模型+RANBP3L敲低+姜黄素组（T2DM+KD+Cur），5只/组。Ctrl+Veh组给予常规喂养，T2DM模型组的小鼠给予60%脂肪供能的高脂饲料（HFD）喂养，共17周。8周时，小鼠禁食12 h后腹腔注射50 mg/kg链脲霉素，72 h检测血糖水平，血糖值>7.8 mmol/L为糖尿病模型建立成功。糖尿病模型建立后，T2DM+KD+Veh组和T2DM+KD+Cur组小鼠尾静脉注射靶向RANBP3L-shRNA的AAV9病毒载体（General Biol），10¹¹vg/只。shRNA序列如下：sh-RANBP3L： GGAGUGAUGACAUGAACAATT。将姜黄素溶于1%羧甲基纤维素钠溶液中制备混悬液，KD+T2DM+Cur组小鼠在注射AAV后每天灌胃姜黄素58 mg/kg，其余各组给予等量溶剂灌胃。28 d后处死小鼠，采集血液和股骨组织样本用于后续分析（图3A）。

1.2.9 ELISA检测

末次给药后收取小鼠血样，室温静置30 min，于4 ℃条件下以3000×g离心15 min，吸取上层血清并储存在-80 ℃下。使用血清总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）ELISA试剂盒，将血清样品加入酶标板中，37 ℃避光反应30 min，洗板5次，加入酶标试剂 50 μL/孔孵育30 min，洗板后加入显色剂反应15 min，使用酶标仪立即测定吸光度A_{450 nm}。

1.2.10 HE染色

收集各组小鼠股骨用 4% 多聚甲醛固定72 h，将股骨脱钙处理，经石蜡包埋后，切成4 μm厚的切片；组织依次经过梯度乙醇脱水和二甲苯透明处理，用苏木素和伊红（HE）染色封片，显微镜观察结果。

1.2.11 免疫组化染色

将股骨组织切片脱蜡至水，放入二甲苯和梯度浓度的酒精，蒸馏水冲洗至透明。使用抗原修复溶液（10 mmol/L pH 6.0 柠檬酸钠缓冲液）进行抗原修复。在PBS中洗涤切片3次后，将切片与一抗（ALP，1∶200；RANBP3L，1∶200）在37 ℃下孵育1 h，然后用二抗孵育30 min。用二氨基联苯胺（DAB）处理并用苏木素衬染后，1%盐酸酒精分化数秒，水洗干净，碳酸锂溶液蓝30 s，水洗后脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

1.2.12 骨组织茜素红染色

使用二甲苯和梯度浓度的酒精将股骨组织石蜡切片脱蜡至水，用茜素红染液染 5 min，自来水冲洗，烤干切片后入干净的二甲苯透明5 min，中性树胶封片，显微镜镜检，图像采集分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism8软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差描述。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素促进对高糖环境下MC3T3-E1细胞增殖及成骨能力

相比空白对照组，高糖处理组（即0 μmol/L姜黄素）细胞活力降低；相比高糖处理组，1 μmol/L组细胞活力升高（P<0.05，图1A），所有进一步实验均使用1 μmol/L姜黄素。在成骨诱导的第7天，相比空白对照组，高糖处理组染色区域较少，细胞ALP相对含量减少（P<0.05），姜黄素组ALP染色增加（P<0.01）；高糖处理加姜黄素组的细胞染色较高糖处理组更深，且ALP的相对含量明显增加（P<0.01，图1B、C）。在成骨诱导14 d时，相比空白对照组，高糖处理组细胞钙结节减少，姜黄素组染色更深、钙结节增加（P<0.05）；相较于高糖处理组，高糖处理组+姜黄素组细胞染色更强、钙结节形成更多（P<0.01，图1D、E）。

2.2 姜黄素降低了高糖条件下MC3T3-E1细胞中RANBP3L的表达

高糖培养下的细胞经姜黄素干预后 1000个基因的表达发生显着变化，其中上调基因858个，下调基因142个，进一步将筛选标准调整为|log₂ FC|>2且P<0.05，调整后获得上调基因217个，下调基因7个（图2A）。KEGG通路富集分析揭示了20个变化明显的通路（图2B）。基于分析结果，将RANBP3L选定为后续研究目的基因。通过q-PCR实验验证，高糖条件促使细胞中RANBP3L表达水平上调，姜黄素可抑制正常以及高糖条件下RANBP3L基因表达（P<0.001，图2C）。Western blotting 实验具有相同的趋势，相比对照组，高糖培养下的细胞RANBP3L蛋白表达量增加（P<0.01），姜黄素组中RANBP3L蛋白表达量下降（P<0.05）；与高糖组相比，Cur降低了高糖成骨细胞中RANBP3L蛋白的表达水平（P<0.01，图2D）。

2.3 糖尿病模型小鼠显示骨形成减少

与健康小鼠相比，T2DM模型小鼠血糖水平升高（图3A、B）。ELISA结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度升高，而HDL-C水平降低（P<0.01，P<0.001，图3C~F）。使用HE染色对小鼠骨组织切片进行组织学染色，模型组骨小梁结构由致密变为疏松，骨小梁数量减少，骨结构间距变大（图4A）；骨组织茜素红染色结果显示，与正常组相比，模型骨组织钙盐沉积减少（图4B）。由免疫组化结果可知，模型组骨组织ALP水平与正常组相比降低（图4C）。q-PCR以及免疫组化结果显示，T2DM模型小鼠RANBP3L表达高于正常组小鼠（P<0.001，图4D、E）。q-PCR、Western blotting检测骨组织骨形成相关基因OCN和骨吸收相关基因RANKL表达，与对照组相比，OCN蛋白在T2DM模型组中表达水平降低，而RANKL蛋白表达水平升高（P<0.001，图4F~J）。

2.4 姜黄素下调RANBP3L，促进T2DM小鼠骨形成

与T2DM+Veh组相比，注射RANBP3L-shRNA腺病毒的T2DM+KD+Veh组小鼠的骨质疏松表型得到了明显改善，骨小梁数量增多，骨小梁之间的间隙变小，骨组织中的钙盐沉积量有所增加，ALP的含量上升（P<0.05）；与T2DM+KD+Veh组相比，姜黄素联合治疗使得小鼠的骨小梁增多，骨间隙减小，钙盐沉积提高（图5A、B），ALP水平提高（P<0.05，图5C、E）。T2DM+KD+Veh组小鼠骨组织里OCN基因的表达有所增加，RANKL基因的表达则有所降低（P<0.05）。另外相比于T2DM+KD+Veh组，T2DM+KD+Cur组骨组织中OCN的表达进一步增加，而RANKL的表达降低（P<0.05，图5 H-L）。q-PCR以及免疫组织化学染色的结果显示，注射RANBP3L-shRNA腺病毒的小鼠RANBP3L表达水平低于模型组（P<0.05）；相较于T2DM+KD+Veh组，T2DM+KD+Cur组中RANBP3L的表达降低（P<0.001，图5D、F、G）。

2.5 下调RANBP3L抑制TNF-α/NF-κB信号通路

Western blotting检测小鼠骨组织中的TNF-α/NF-κB信号通路的激活。与Ctrl+Veh组相比，TNF-α、p-p65、p-IKKβ和p-IκB-α蛋白在T2DM+Veh组中表达水平升高（P<0.01，P<0.001）；与T2DM+Veh相比，TNF-α、p-p65、p-IKKβ和p-IκB-α蛋白在T2DM+KD+Veh组中表达水平降低；T2DM+KD+Cur组中相关蛋白水平相比T2DM+KD+Veh组进一步下降（P<0.001，P<0.05，图6）。

3 讨论

2型糖尿病骨质疏松症（T2DOP）作为2型糖尿病的并发症之一，可引发骨微结构受损、骨量减少及骨折风险上升，从而降低患者生活质量^［23］。2型糖尿病可能通过多种途径导致糖尿病骨质疏松症的发生，包括胰岛素抵抗、炎症反应、代谢紊乱、骨细胞活性改变等^{［24， 25］}。由于T2DM患者的骨质疏松症是一种骨转换率低的疾病，因此进一步降低骨转换率的抗吸收药物可能不是首选药物。报道表明姜黄素对糖尿病骨代谢具有良好的作用，这可能为治疗2型糖尿病诱发的骨质疏松症提供潜在的治疗途径^［26］。本研究结果表明，姜黄素可以在体外促进高糖条件下成骨细胞的成骨矿化，降低RANBP3L的表达；我们首次发现高血糖是诱导小鼠RANBP3L高表达的因素之一，在T2DM模型小鼠中特异性敲低RANBP3L，能够调节T2DM模型小鼠骨代谢相关基因的表达，改善骨微结构，恢复糖脂代谢紊乱，并抑制TNF-α/NF-κB信号通路相关蛋白的表达，姜黄素可对RANBP3L的表达起到抑制作用，增强骨形成作用。

我们在体外研究了姜黄素在高血糖条件下对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响。经姜黄素处理后的MC3T3-E1成骨细胞显示ALP的活性增强，提示姜黄素能够加速其早期的分化过程；而根据茜素红染色的观察结果，无论是在高糖处理之前还是之后，姜黄素都能有效增加成骨细胞矿化结节的数量和体积。已有研究证明了，姜黄素对于MC3T3-E1细胞有促进增殖分化及细胞外基质矿化的效果^［27］；姜黄素能够通过抑制NF-κB信号通路，并且缓解氧化应激的损害，从而促进MC3T3-E1细胞成骨^［28］。本研究证明姜黄素具有促进高糖条件下MC3T3-E1细胞成骨分化的能力。通过RNA测序分析发现RANBP3L是姜黄素作用于成骨细胞的一个关键靶点，经PCR及Western blotting实验验证RANBP3L蛋白在高糖环境下高表达，姜黄素干预可以使MC3T3-E1细胞中 RANBP3L蛋白表达降低。提示姜黄素促进MC3T3-E1细胞的成骨分化可能与RANBP3L水平有关。

为在体内验证姜黄素对T2DOP的影响，运用高脂饮食结合腹腔注射链脲霉素构建了2型糖尿病小鼠模型^{［29， 30］}。T2DM模型小鼠的成骨能力受抑制，RANBP3L的表达水平上升，动物实验结果与体外细胞实验结果一致。通过腺相关病毒特异性敲减RANBP3L基因表达，发现此干预措施能缓解糖尿病引发的骨形成减弱现象，新骨基质矿化增多，且缓解糖尿病导致的骨代谢不平衡。以往实验证明了姜黄素在体内对小鼠成骨有积极作用，在我们的实验中姜黄素给药与RANBP3L蛋白敲低联合使用产生协同效应，进一步降低RANBP3L基因的表达水平，提高对糖尿病模型小鼠骨形成的积极影响，平衡成骨代谢，T2DM+KD+Cur组的组织学染色强度接近正常组水平。这一结果说明姜黄素可以通过下调RANBP3L的表达发挥抗骨质疏松作用。糖尿病患者常出现TC、TG和LDL-C水平升高，可能导致脂代谢异常，有研究指出姜黄素治疗可改善T2DM大鼠的糖脂代谢紊乱，提高对胰岛素的敏感性，改善对胰岛素的抵抗^［31-33］。本研究发现腺病毒敲低RANBP3L表达或与姜黄素联用均能降低血糖水平，逆转糖尿病状态下的脂质代谢紊乱，提示RANBP3L可能参与糖尿病相关的代谢调节过程。

核因子κB（NF-κB）作为一种转录调节因子，影响与炎症反应和免疫系统活性相关的基因表达^［34］。NF-κB信号通路被发现在糖尿病的炎症反应和免疫调节中起着至关重要的作用^［35］。在糖尿病状态下，尤其是T2DM，体内常常伴随有低度慢性炎症，这会导致NF-κB通路的激活，其激活不仅促进了炎症因子的分泌，还影响了骨代谢的平衡。研究表明，在大鼠模型中，NF-κB抑制剂PDTC的腹腔内给药显著降低了NF-κB的活性，同时增加了骨形成相关蛋白的表达水平，包括骨钙素和BMP-2，从而增强了成骨能力^［36］。抑制NF-κB通路可减轻炎症反应，也具有减少骨质吸收的作用^［37］。巧合的是，先前的一项研究证实了，姜黄素通过抑制过度激活的NF-κB通路来改善高糖损伤的BMSCs的成骨和血管生成耦联，提示阻断这一通路可能是治疗糖尿病骨质疏松的潜在治疗策略^［38］。结合KEGG富集分析结果，TNF-α/NF-κB信号通路被富集，其可能参与姜黄素的抗DOP的作用。NF-κB信号通路在TNF-α诱导的成骨分化障碍中起关键作用，研究表明，TNF-α可激活NF-κB通路，抑制成骨前细胞的成骨分化^［39］。我们的研究结果证明了RANBP3L可能通过调控TNF-α/NF-κB信号通路影响骨代谢，姜黄素能够通过下调RANBP3L及抑制TNF-α/NF-κB信号通路的激活，缓解糖尿病导致的骨质流失。

有不少天然产物以及中药被广泛用于治疗骨质疏松症和骨折，且几乎不存在副作用，它们可在抑制破骨细胞活性同时促进成骨细胞的活性，从细胞层面改进骨代谢，缓解骨形成与骨吸收之间的失衡状况^［40］。姜黄素借助介导RANBP3L的下调，有利于骨形成的进程，提高了骨修复能力，还可减轻一般在糖尿病情形下会加剧的炎症反应以及糖脂代谢紊乱问题，同步改善“高糖-骨流失”的恶性循环，姜黄素与RANBP3L基因敲除共同发挥作用，扩大成骨修复以及抑制炎症信号传导来缓解T2DOP。这些发现凸显了姜黄素作为预防和治疗T2DOP的有效替代疗法所有的潜力。

综上所述，姜黄素可下调RANBP3L的表达来缓解T2DM小鼠的骨流失以及糖脂代谢紊乱，部分缓解糖尿病相关的有害影响，其机制或许和抑制TNF-α/NF-κB通路的激活存在关联。尽管本研究取得了一定进展，不过依然存在一些局限性，本研究的体内实验采用了股骨骨组织，该组织细胞构成复杂，残留RNA的干扰可能会致使靶基因PCR结果的准确性降低；我们首次发现姜黄素借助调节RANBP3L的表达来影响糖尿病小鼠的成骨性能，然而没能证实这一关联。虽然RANBP3L的具体功能以及待完全阐明，但本研究结果显示，RANBP3L可能是姜黄素改善糖尿病患者骨代谢的一个关键靶点，未来的研究应当提供更多证据，阐明其具体机制。本研究为剖析姜黄素潜在的分子机制以及改善糖尿病患者骨健康的创新治疗策略提供了参考。

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基金资助

安徽省高校自然科学重点科研项目(2023AH051941)

蚌埠医科大学第一附属医院高新技术项目(2024114)

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