EB病毒（EBV）也称为人类疱疹病毒4（HHV-4），是γ-疱疹病毒家族的成员，于1964年在非洲儿童的伯基特淋巴瘤中被首次发现。EBV在全球范围内广泛流行，感染了90%以上的人群，其可在宿主体内长期潜伏并在某些情况下重新激活，引起多种疾病。作为一种普遍存在的致癌病毒，EBV通过LMP1等致癌蛋白和非编码RNA参与多种类型淋巴瘤和鼻咽癌、胃癌等上皮恶性肿瘤的发生发展
［1］；此外，EBV还与传染性单核细胞增多症、口腔毛状白斑病、系统性红斑狼疮和多发性硬化等多种感染性及自身免疫性疾病相关，造成了巨大的疾病负担
［2］。
多项研究发现人群鼻咽拭子或鼻粘膜组织EBV检测阳性率在0%~60%
［3-5］，这提示鼻粘膜可能是其潜在的活跃复制位点和长期储存库，但对于EBV引起的炎症和抗病毒反应，以及EBV致癌早期分子事件的研究仍有大量空白。EBV严格嗜人的生物学特性使得其在动物模型中的研究非常困难
［6］，因此既往EBV与上皮细胞的相互作用研究通常使用人源2D细胞系如癌细胞、永生化上皮细胞等体外模型。然而，癌细胞携带多种遗传突变，其生物学特征有所改变
［7］，永生化上皮细胞经转化亦含有端粒酶活化、p16缺失、NF-κB通路激活等变异
［8， 9］，均无法准确代表正常鼻上皮细胞。此外，2D细胞模型缺乏极性以及特定器官组织结构特点，相较之下3D细胞模型更接近体内真实环境，已有研究表明二者在丙肝病毒与细胞相互作用上存在差异
［10］，这迫使我们重新审视以往在2D细胞模型中得出的结论。基于此，迫切需要一个能概括来源组织遗传和结构特征的3D体外模型以模拟真实的病毒-鼻上皮相互作用。
类器官是由干细胞或器官特异性祖细胞在体外自组织形成的复杂3D聚集体，因其消除了物种差异，且与来源组织器官的结构、功能及分子特征高度相似，被广泛应用于疾病建模和再生医学
［11］。在病毒研究领域，类器官疾病模型不仅有助于更深入地了解病毒的致病机制，还为抗病毒药物筛选和疫苗开发提供了重要平台，显著提高了药物研发效率
［12］。先前我们应用类器官技术建立了支持新冠病毒感染和复制的鼻粘膜类器官模型，它概括了来源组织的遗传特征，并具备与真实鼻粘膜相似的组织学特点
［13， 14］。然而，目前的类器官培养方法通常需要基质胶，一种来自小鼠肿瘤细胞的基底膜提取物，其价格昂贵，依赖进口，且成分不明确、批次质量不一，为广泛应用带来不便
［15］；而在病毒研究中需要将类器官从基质胶中释放出来以使病毒与类器官充分接触，这一过程可能存在基质胶消化困难、残留以及类器官损失等问题
［16］。因此，为了弥补这些不足，有必要开发一种更经济、操作更简便的鼻粘膜类器官培养方法。
本研究使用新的鼻粘膜类器官培养方法即动态悬浮培养法，首次在全程无基质胶的条件下，实现了患者来源鼻粘膜类器官的快速扩增，并成功诱导其分化为与体内鼻粘膜相似的多细胞培养物，节约了成本且避免基质胶相关的繁琐操作。接着，我们首次证明了利用人源鼻粘膜类器官模拟EBV感染的可行性，有望为相关基础和临床前研究提供更接近体内真实状态的研究平台。
1 资料和方法
1.1 资料
1.1.1 实验样本
实验所用的鼻粘膜样本均来自2024年3月~2025年3月在南方医科大学南方医院耳鼻喉科接受鼻内镜手术的患者（
表1），本研究已获本院伦理审核（NFEC-202007-K8）并获得患者知情同意。
1.1.2 主要试剂和仪器
消化液I：IV型胶原酶、III型胶原酶（Worthington）。消化液II：DNA酶、透明质酸酶、分散酶。类器官培养基主要细胞因子：R- Sponding1、Noggin、不含Vit A的B27、A83-01、SB202190、Y-27632（peprotech）、N-acetylcysteine、Nicotinamide（sigma）等。分化培养基：PneumaCult-ALI medium （STEMCELL），DAPT（macklin）。细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific），-80 ℃超低温冰箱、生物安全柜（Biobase），全自动细胞计数仪 （Bodboge），普通光学显微镜（Olympus），低速离心机 （Eppendorf），荧光定量PCR仪（bio-rad），100 μm细胞过滤器、0.45 μm针头过滤器、0.22 μm针头过滤器（JET BIOFIL）等，Amicon® Ultra超滤管（100 000 MWCO），细胞基因组DNA提取试剂盒、血液DNA提取试剂盒、FastKing cDNA 第一链合成试剂盒（天根生化），Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix，Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen），即用型HRP标记羊抗兔/小鼠二抗（武汉三鹰）等。所用抗体的信息见
表2。
1.2 方法
1.2.1 人鼻粘膜样本处理和类器官构建
无菌条件下将手术取下的人鼻粘膜组织放入含1 %青霉素和链霉素的4 ℃预冷生理盐水中清洗数次并置于冰盒上剪切至约1 mm
3大小组织块。在消化液Ⅰ中37 ℃振荡消化2 h后用PBS终止，离心去上清，在消化液Ⅱ中37 ℃振荡消化约20 min，直至消化为30~50 μm细胞团则用PBS终止，用100 μm细胞过滤器过滤后离心，用鼻粘膜类器官培养基重悬细胞沉淀，混匀后接种于低吸附6孔板中，37 ℃、120 r/min振荡培养，每3 d更换新鲜培养基，使用TryPLE消化液消化或巴氏移液管吹打机械分离类器官进行传代。扩增一定时间后，更换为鼻粘膜类器官分化培养基（含10 μmol/L DAPT的PneumaCult-ALI培养基）
［17］，每3 d更换新鲜培养基，连续培养14 d以上以诱导鼻粘膜类器官分化成熟。
1.2.2 EBV制备和滴度检测
将携带重组EBV的Akata细胞培养于含5%胎牛血清、800 μg/mL G418的RPMI 1640培养基中，该细胞由中山大学肿瘤研究中心赠送，其中GFP和G418抗性基因插入EBV基因组BXLF1区域。基于Xia等
［18］的方法进行EBV制备及定量。以2×10
6/mL密度重悬Akata细胞，加入0.8 %羊抗人IgG抗体37 ℃下诱导6 h，1200 r/min离心3 min，更换新鲜培养基继续培养5 d，收集上清经0.45 μm滤膜过滤得到EBV悬液。用Amicon® Ultra超滤管（100 000 MWCO）在4 ℃下以4000
g离心30 min，得到EBV浓缩液，分装后-80 ℃储存备用。对于EBV浓缩液的滴度检测，按试剂商说明，使用细胞基因组DNA提取试剂盒提取Namalwa细胞DNA，该细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，每个细胞基因组整合了2个EBV拷贝，可作为EBV定量的标准品，经计算2 copies/6.6 pg DNA；使用血液DNA提取试剂盒提取EBV浓缩液DNA后，按试剂商说明使用Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix进行荧光定量，其中EBV BamHI-W Taqman探针序列为5'-FAM-CACACACTACACACA CCCACCCGTCTC-TAMRA-3'；通过标准曲线可计算得浓缩液中EBV滴度，以便后续实验稀释至适当滴度。
1.2.3 EBV感染鼻粘膜类器官
收集类器官，通过细胞计数仪进行计数，调整细胞浓度，将细胞密度调整为3×106/mL，取100 μL/孔接种至低吸附24孔板，用RPMI 1640将EBV浓缩液分别稀释为MOI=250、MOI=2500的工作液，100 μL/孔添加至类器官悬液中，37 ℃培养24 h，离心，用PBS清洗2次以去除未结合病毒，继续培养72 h。
1.2.4 类器官RNA提取和RT-qPCR
收集类器官沉淀，用PBS清洗2次，按试剂商说明，使用细胞总RNA提取试剂盒（Goodnie）提取类器官RNA，使用FastKing cDNA 第一链合成试剂盒将其逆转录获得cDNA，使用Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix进行荧光定量分析，以GAPDH为内参基因。相关引物均由擎科生物科技公司合成，引物序列见
表3。
1.2.5 类器官石蜡切片免疫荧光
离心收集类器官沉淀，4%甲醛固定6 h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋制备石蜡切片。将石蜡切片脱蜡、水化后，转移至PBS溶液中清洗3次，5 min/次，将切片放入盛有沸腾EDTA修复液的高压锅中，高压冒气3 min后自来水冷却取出；组化笔画圈，滴加血清封闭液（10%山羊血清+0.5%TritonX-100）室温孵育1 h后，滴加相应一抗4 ℃过夜。次日，室温复温30 min，移入PBS清洗3次，5 min/次，滴加荧光二抗工作液室温孵育2 h，PBS清洗3次，5 min/次，DAPI染核5 min，PBS清洗3次，5 min/次，滴加防荧光淬灭剂封片，盖上盖玻片，通过EVOSm7000荧光成像仪进行分析。
1.2.6 石蜡切片免疫组化
离心收集类器官沉淀，4 %甲醛固定6 h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋制备石蜡切片。将石蜡切片脱蜡、水化后，转移至PBS溶液中清洗3次，5 min/次，将切片放入盛有沸腾EDTA修复液的高压锅中，高压冒气3 min后自来水冷却取出。3%过氧化氢溶液浸泡10 min，PBS清洗3次，5 min/次。组化笔画圈，滴加血清封闭液（10%山羊血清+0.5%TritonX-100）室温孵育1 h后，滴加相应一抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，5 min/次。滴加即用型HRP标记羊抗兔/小鼠二抗室温孵育30 min，PBS清洗3次，5 min/次。DAB工作液显色2 min，流水冲洗10 min。移入苏木素溶液染核5 min，流水冲洗返蓝。镜下观察细胞核染色程度，用1%盐酸酒精分化数秒，流水冲洗。玻片吹干后滴加中性树脂，盖上盖玻片，通过相差显微镜拍摄图片进行分析。
1.3 统计学分析
实验所获得的数据均进行3次重复验证，使用 GraphPad Prism 9.5进行统计学分析，符合正态分布的计量资料数据表示为均数±标准差。两组实验数据比较采用t检验；多组比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 鼻粘膜类器官的无基质胶动态悬浮培养
按照上述培养体系将鼻粘膜组织剪切消化后，细胞在含有R-spondin-1、Noggin、A83-01等组分的类器官扩增培养基中快速形成细胞团并持续生长，动态悬浮培养的剪切力使类器官倾向形成薄壁空心泡状结构，直径可扩增至100 μm以上（
图1A，
图2A）。根据后续实验需求，在恰当的时候将培养基更换为呼吸道上皮分化培养基，每3 d换液1次，连续培养14 d以上，以诱导分化为成熟的鼻粘膜类器官，显微镜下可见分化过程中类器官管壁逐渐增厚形成近实心结构，分化后期类器官表面有摆动的纤毛（
图1B，
图2A）。
2.2 鼻粘膜类器官模型的鉴定
免疫荧光结果显示，未分化的鼻粘膜类器官表达上皮基底干细胞标志物CK5、CK14、p63（
图3A）；而分化的鼻粘膜类器官表达基底细胞（CK5）、粘液细胞（MUC5AC）、纤毛细胞（βtubulin IV）标志物，且类器官基底侧在内，纤毛面朝外（
图3 B），这将有助于病毒从纤毛面进入类器官。免疫组化结果表明分化的鼻粘膜类器官具有与人体鼻粘膜相似的组织学特征，主要包含基底细胞（P63）、粘液细胞（MUC5AC）、纤毛细胞（FOXJ-1）（
图4）。此外，在培养过程中，分化鼻粘膜类器官保留了基底膜成分Collagen IV（
图2 B），其具有结构支撑、细胞连接等功能。
2.3 鼻粘膜类器官EBV感染模型的建立
通过RT-qPCR检测已知的EBV上皮感染受体基因转录水平（
图5A），结果显示分化鼻粘膜类器官NRP1、NMHC-IIA基因表达显著上调（
P<0.001），提示它可能比未分化的鼻粘膜类器官更容易被EBV感染。而免疫荧光检测结果显示，分化鼻粘膜类器官表达EBV上皮感染受体NMHC-IIA、EPHA2、NRP1（
图5B）。对不同病毒暴露载量的测试发现，随着MOI值的提高，类器官中EBV核抗原基因EBNA1、病毒DNA聚合酶基因BALF5的表达水平升高，说明病毒暴露载量和鼻粘膜类器官中病毒复制水平呈正相关（
图6A）。与未分化的类器官相比，在MOI=2500感染条件下，分化的鼻粘膜类器官中EBNA1表达水平更高（
图6B），提示其支持更高水平的病毒复制（
P<0.001）。通过EBNA1免疫荧光检测进一步确认，未分化和分化的鼻粘膜类器官均能被EBV感染（
图6C、D）。
3 讨论
EBV是一种γ疱疹病毒，人群对其普遍易感，病毒通常通过口咽黏膜侵入、在B细胞中建立潜伏感染而终身携带，并可能在特定条件下再活化，造成巨大的疾病负担
［19］。近年对鼻咽拭子样本和鼻粘膜组织中EBV的检测结果提示，EBV是人鼻粘膜、鼻咽部的常见微生物
［20］。多年来，EBV与鼻咽癌的关系受到广泛关注并已有大量研究
［21］，但EBV与正常鼻粘膜上皮的相互作用及其致病机制研究尚有大量空白，我们迫切需要一个适当的体外模型以研究EBV在鼻粘膜中的感染行为。
既往研究中，鼻粘膜上皮EBV感染体外模型主要为2D细胞系
［22］，此类模型缺乏正常人体鼻粘膜上皮的组织学结构和生理功能，且体外感染困难，通常在极高的病毒滴度下也难以实现理想的感染
［23］。鉴于类器官这一新兴技术在病毒研究领域的成功应用，我们首次尝试将人鼻粘膜类器官用于构建EBV体外感染模型。
然而，我们以往培养鼻粘膜类器官所用的基质胶包埋法存在许多不足之处。基质胶是从富含细胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出的可溶性基底膜制备物，其主要成分包含层粘连蛋白，Ⅳ型胶原、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，还含有丰富的生长因子如TGF-β、EGF、FGF等，可为类器官生长提供结构支持和一定的营养，是类器官培养中最常用的材料
［24］。但基质胶的批次差异和复杂性导致了实验中的不确定性和重复性不佳，动物来源引入的异种污染物也限制了该培养体系中培养物的治疗潜力，其高昂的价格也大大增加了研究的成本
［25］。为了解决这些问题，近年来研究者们开发了无需基质胶的悬浮培养法，目前已成功应用于肠道
［26］、肾脏
［27］、肝
［28］、支气管
［29］等类器官培养。本研究表明，在无基质胶的动态悬浮培养体系中，鼻粘膜类器官能够成功扩增并分化为含基底细胞、粘液细胞、纤毛细胞的多细胞培养物。而且，我们在该模型中检测到基底膜重要成分Ⅳ型胶原蛋白的存在，提示了即使没有添加基质胶这一类外源性基底膜模拟物，类器官本身也能形成基底膜以支持自身生长和维持结构完整，推测这是无基质胶培养法得以实现的重要因素。此外，与基质胶包埋法相比，该培养方法有利于营养物质和氧气的均匀分布，从而保持类器官活性；且避免了基质胶消化困难、残留，易于收获细胞，使病毒容易接近类器官表面
［30］。
接着，本研究在鼻粘膜类器官中检测到已知的EBV感染上皮细胞相关受体NMHC-ⅡA、NRP1、EPHA2的表达，它们与病毒膜蛋白相互作用，参与病毒的吸附、结合、膜融合等过程，共同介导EBV进入上皮细胞
［31］。通过体外感染实验发现，与未分化的类器官相比，分化的鼻粘膜类器官中有更高的病毒复制水平，原因可能是分化类器官中病毒感染受体表达水平更高，这有利于病毒进入细胞；另外，有研究表明在口咽上皮器官型培养物中，与基底层中EBV的有限复制相比，基底上层中EBV的复制更活跃
［32］，涉及特定分化相关转录因子对立即早期基因（BZLF 1和BRLF 1）启动子的激活
［33］，这也可能是分化的鼻粘膜类器官中有更高病毒复制水平的原因。
综上，本研究通过无基质胶的动态悬浮培养法建立的鼻粘膜类器官模型，具有高仿生和人源化特征，并证明了该模型用于模拟EBV感染的可行性，有望为EBV相关上皮性疾病的致病机制探索、抗病毒药物高通量筛选、疫苗开发提供了一个更真实的平台。在未来的研究中，我们将对该模型与目前常用的2D细胞模型进行对比分析，以进一步揭示类器官模型在病毒研究领域的独特优势，并以此为起点深度探索EBV引起的鼻粘膜病理变化和应用价值。
广东省粤港澳大湾区国际科技创新中心建设粤澳科技合作联合创新领域(2022A0505020021)
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