树豆酮酸A衍生物XJ-60通过抑制SP1/TGF-β/Smad3信号轴改善非酒精性脂肪肝病小鼠的肝纤维化

Cajanonic acid A derivative XJ-60 improves liver fibrosis in mice with non-alcoholic fatty liver disease by inhibiting the SP1/TGF-β/Smad3 signaling axis

摘要

目的 探讨树豆酮酸A衍生物XJ-60是否可通过抑制SP1/TGF-β/Smad3信号通路发挥改善非酒精性脂肪肝肝纤维化的作用。 方法 体内实验：12只db/db小鼠采用完全随机设计分成非酒精性脂肪肝模型组（NAFLD组）和给药组（XJ-60组），6只/组；db/m小鼠为正常对照组（NC组），6只/组，XJ-60组给予XJ-60 50 mg/（kg/d）灌胃给药。HE、油红O染色和组织上清液丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）判断NAFLD成模情况；免疫组织化学染色观察肝组织中特异性蛋白1（Sp1）、纤连蛋白（FN）的表达部位，Western blotting观察肝组织中Sp1、上皮细胞向间充质细胞转分化（EMT）、细胞外基质（ECM）相关指标的表达情况；ELISA检测肝组织中白介素-6（IL-6）的表达；Sp1与钙黏蛋白（E-ca）和Sp1与α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）进行相关性分析。体外实验：采用CCK8法筛选XJ-60治疗NAFLD的有效浓度；AML12细胞分为正常对照组（NC组），NAFLD模型组（PO组）采用游离脂肪酸刺激复制模型； 溶剂对照组（PO+DMSO组）在PO组的基础上加入与XJ-60相同剂量的DMSO作对照； 药物治疗组（PO+XJ-60组）加入游离脂肪酸后加入不同浓度梯度的XJ-60。油红O染色观察各组肝细胞脂滴沉积情况；Western blotting和Real-time qPCR检测各组SP1、转化生长因子-β（TGF-β）、Smad3、p-Smad3、EMT、ECM相关指标的表达情况；免疫荧光染色观察SP1、p-Smad3定位情况；并通过敲低SP1验证TGF-β/Smad3信号轴在NAFLD中的作用。 结果 体内实验结果表明XJ-60可降低db/db小鼠甘油三酯和总胆固醇（P<0.05）；模型组HE、油红O染色以及ALT、AST提示存在肝细胞损伤且肝脏脂滴沉积模型复制成功（P<0.05）；NAFLD组小鼠肝脏已出现炎性 细胞浸润和纤维化表型，XJ-60组有所改善；XJ-60组IL-6降低（P<0.05）；FN、SP1分别在细胞质和细胞核中表达增多；相关性分析结果提示Sp1和E-ca呈负相关和α-SMA呈正相关（P<0.05）。体外实验中XJ-60治疗NAFLD最佳浓度为10 μmol/L（P<0.01），且PO组AML12细胞中的脂滴沉积增多，XJ-60组脂滴沉积减少（P<0.01）；与PO组相比，XJ-60治疗后ECM和EMT相关指标mRNA水平和蛋白水平表达均降低（P<0.05），SP1、TGF-β、p-Smad3蛋白表达水平降低（P<0.05）。敲低SP1可显著降低TGF-β、p-Smad3和ECM的表达（P<0.05）。 结论 XJ-60在db/db小鼠NAFLD肝脏中发挥的抗纤维化作用及改善脂滴沉积的作用机制可能是通过抑制SP1的表达从而抑制TGF-β/Smad3信号通路致纤维化作用，减少下游细胞外基质的分泌和沉积。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of XJ-60, a derivative of cajanonic acid A, for alleviating liver fibrosis in mice with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods Twelve db/db mice were randomized equally into NAFLD model group and XJ-60 treatment group with daily gavage of 50 mg/kg XJ-60, with 6 db/m mice serving as the control group. Successful modeling of NAFLD was validated using HE and Oil Red O staining and by measuring ALT and AST levels of the mice. Immunohistochemistry was used for detecting hepatic expressions of specific protein 1 (SP1) and fibronectin (FN); the changes in hepatic expressions of epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers, extracellular matrix (ECM) markers, and IL-6 were detected using Western blotting and ELISA. In AML12 cells induced with free fatty acids (FFA), the effect of XJ-60 on expressions of SP1, transforming growth factor-β (TGF-β), Smad3/p-Smad3, and the markers of EMT and ECM were analyzed. SP1 knockdown experiment was performed to validate the role of TGF‑β/Smad3 signaling axis in NAFLD. Results XJ-60 treatment significantly reduced serum lipid levels, improved liver histology, and lowered hepatic IL-6 expression in db/db mice. The expression level of SP1 was positively correlated with α-SMA and negatively with E-ca expression. In AML12 cells, XJ-60 treatment at 10 μmol/L significantly reduced FFA-induced lipid accumulation and downregulated cellular expressions of SP1, TGF-β, p-Smad3, and the EMT and ECM markers; SP1 knockdown obviously inhibited the expression levels of TGF-β, Smad3 and ECM markers. Conclusion XJ-60 ameliorates liver fibrosis and steatosis in mice with NAFLD possibly through SP1-mediated inhibition of the TGF‑β/Smad3 pathway to reduce ECM deposition.

Graphical abstract

关键词

非酒精性脂肪肝 / 特异性蛋白1 / 转化生长因子-β / Smad3蛋白 / 树豆酮酸A衍生物

Key words

non-alcoholic fatty liver disease / specific protein 1 / transforming growth factor‑β / Smad3 protein / cajanonic acid A derivative

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是全球最常见的慢性肝病，可促进约25%的成年人发展为肝纤维化、肝硬化和肝癌^［1］。预计到2030年，NAFLD相关肝硬化及其并发症将增加2~3倍^［2］。NAFLD包括从单纯脂肪变性到非酒精性脂肪肝炎的疾病谱，特征是炎症和纤维化^［3］。肝星状细胞（HSCs）在肝损伤中被激活，通过上皮-间质转化（EMT）转化为肌成纤维细胞，产生大量细胞外基质（ECM）^［4］。EMT在组织纤维化和癌症中起重要作用，其特征是上皮细胞失去极性并获得间质表型^［5］。EMT及ECM沉积与降解失衡是NAFLD发展为肝纤维化和肝癌的关键机制，但其具体机制尚不明确，研究其发生发展机制具有重要意义。

研究表明，转化生长因子-β（TGF-β）是促进HSCs活化和ECM组装及重塑的关键调节剂，在NAFLD中发挥着至关重要的作用^{［6， 7］}。Smads蛋白是TGF-β信号通路传导过程中的受体后信使蛋白^［8］。TGF-β/Smad3 信号通路的激活可导致 HSCs 活化以及 ECM 积聚，从而促进纤维化发生^［9］，提示特异性干预TGF-β/Smad3 信号可能对抑制NAFLD肝纤维化具有一定的治疗价值。特异性蛋白1（SP1）是Sp/Kruppel样因子家族的锌指转录因子，参与细胞周期、凋亡和血管生成等过程^［10］。研究表明，SP1在肾脏和心脏纤维化中通过影响EMT促进纤维化^{［11， 12］}。糖尿病性白内障模型中，抑制SP1可阻断EMT^［13］，提示SP1可能是纤维化治疗的潜在靶点。然而，SP1/TGF-β/Smad3通路在NAFLD中的具体机制尚未明确，本研究将进一步探讨该通路在NAFLD纤维化的发生发展中的作用机制如何。

NAFLD迄今缺乏特效治疗药物，现阶段防治策略仍以调整生活方式与膳食结构优化为主^［14］。相关研究表明胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种肠促胰岛素激素，可调节饱腹感、胃排空和血糖控制，然而尽管其对非酒精性脂肪肝炎改善显著，但却未观察到其对纤维化具有显著逆转^［15］。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ激动剂吡格列酮具有改善血糖控制、优化血脂谱、降低动脉粥样硬化性心血管疾病风险等，但对于既往存在心功能不全的患者可能引发液体潴留和心脏失代偿风险，同时可能增加骨折概率^{［16， 17］}。在此背景下，天然药物多靶点协同作用的治疗优势凸显。树豆酮酸A（CAA）是树豆提取的二苯乙烯衍生物，具有降血糖、改善葡萄糖耐受和减轻体质量的作用^［18］。但其在抗纤维化治疗方面的相关研究较少。XJ-60是CAA的衍生物，其结构改制的核心目标在于提高生物利用度或靶向性，目前尚未有相关研究阐明其治疗潜力，它是否也具有或优于母体CAA的功效尚属未知。因此我们拟探究其在NAFLD中的潜在治疗作用如何及可能的药物靶点，并探究XJ-60对NAFLD抗纤维化的作用机制是否是通过SP1/TGF-β/Smad3信号通路的激活发挥下游效应，为XJ-60的进一步研究提供一定的理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

清洁级健康雄性6 周龄db/m小鼠6 只及6 周龄db/db小鼠12只，品系名称为BKS.Cg-m+/+Leprdb/J （db/+），基因型为Leprdb/J （db/db），购自江苏集萃药康生物科技有限公司，动物实验已通过伦理审批（伦理批号：2400717），小鼠肝细胞AML12（美国ATCC细胞库）。

1.1.2 主要试剂

树豆酮酸A（CAA）和树豆酮酸A衍生物（XJ-60）由贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心制备提供。血糖、甘油三酯、胆固醇、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）组织上清液测定试剂盒（南京建成公司）；免疫组织化学SP两步法检测试剂（中杉金桥生物公司）；RIPA强裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗稀释液及Tween-20（苏州碧云天生物有限公司）；油酸（OA）购自阿拉丁；棕榈酸（PA， MCE）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜及What-man 3MM滤纸（Millipore）；0.1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）（普诺赛公司）、牛血清白蛋白（BSA）、CCK8溶液（APExBIO）、油红O染色试剂盒（索莱宝）、十二烷基硫酸钠（SDS）、30%丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸、Tris碱、DEPC水、Tris-HCl（pH 6.8）、Tris-HCl（pH 7.5）、Tris-HCl（pH 8.8）及二硫苏糖醇（DTT）（索莱宝生物有限公司）；蛋白酶磷酸酶抑制剂&PMSF（上海康成生物有限公司）；脱脂奶粉（伊利）；Smart-ECL发光试剂盒（碧云天）；1×PBS（常州天地人和生物科技有限公司）；Tizol Regent（ambion）；Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（翌圣生物科技有限公司）；蛋白marker（索莱宝）。

1.1.3 主要抗体和引物

一抗：钙黏蛋白（E-ca）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体均购自Proteintech；Ⅳ型胶原蛋白（Col-Ⅳ）、抗纤维连接蛋白（FN）（Abcam）；SP1抗体（Affinty）；Smad3抗体（Abcam）；p-Smad3抗体（CST）；TGF-β（ZENBIO）；抗GAPDH抗体（武汉普美克技术有限公司）。二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（武汉普美克有限公司；荧光二抗FITC（APExBIO）。引物：SP1、FN、Col-Ⅳ、E-ca、α-SMA、TGF-β引物（上海生物工程公司）

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理

所有小鼠适应性喂养1 周，db/db小鼠采用完全随机设计分成模型组（NAFLD组，n=6）和给药组（XJ-60组，n=6），设同期db/m小鼠为正常对照组（NC组，n=6）。XJ-60组予以XJ-60 50 mg·kg^-1·d^-1）灌胃给药8周治疗。所有小鼠以无菌饲料喂养，自由饮食，8 周后处死。

1.2.2 生化指标检测

小鼠处死前空腹4~6 h，戊巴比妥钠麻醉后眼球取血，4000 r/min离心15 min，置于-20 ℃冰箱保存。根据葡萄糖氧化酶法、COD-PAP法、GPO-PAP酶法分别测血糖、胆固醇、甘油三酯等生化指标。

1.2.3 细胞培养与干预

AML12小鼠肝细胞株在DMEM/F12培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）。细胞在37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。细胞传代时，在生长密度达 80%左右时进行。为诱导 AML12 细胞表现出 NAFLD 的典型特征，使用 250 μmol/L PA和500 μmol/L OA配制成游离脂肪酸（FFA） 混合物（终浓度750 μmol/L）。AML12 细胞在此 FFA混合物中孵育48 h，以建立 NAFLD 细胞模型。AML12细胞分为正常对照组（NC组）用含5%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，NAFLD模型组（PO组）用含750 μmol/L FFA和5%胎牛血清的培养基培养48 h，溶剂对照组（PO+DMSO组）在PO组的基础上加入与药物治疗组相同剂量的DMSO干预48 h，XJ-60药物治疗组（PO+XJ-60组）在PO组的基础上加入一定剂量的XJ-60干预48 h。在AML12细胞中转染SP1敲低质粒，设置阴性对照Negtive（Neg）组，转染6 h后，更换含FFA的培养基继续培养48 h之后提取细胞总RNA和总蛋白，通过Real-time qPCR和Western blotting检测SP1及其下游基因（如TGF-β、Smad3等）的RNA及蛋白表达水平的变化。

1.2.4 CCK-8法筛选药物XJ-60作用于NAFLD的最适浓度

CCK-8 实验时设置6个分组，具体包括：正常对照组（NC组），作为实验的基准，未对AML12细胞进行任何额外的处理或干预，通过与此组的比较，可以准确评估其他实验条件对AML12细胞生物学行为的影响；NAFLD模型组（PO组），通过在富含FFA的培养基中培养AML12 细胞，构建NAFLD的细胞模型，旨在探究FFA对AML12细胞功能及存活的影响；PO+XJ-60（10 μmol/L）组；PO+XJ-60（20 μmol/L）组；PO+XJ-60（30 μmol/L）组；PO+XJ-60（40 μmol/L）组；PO+XJ-60（50 μmol/L）组；PO+XJ-60（60 μmol/L）组；在构建的NAFLD 模型基础上，AML12 细胞在被含有10、20、30、40、50、60 μmol/L浓度的XJ-60的含药FFA中培养，此分组旨在探究不同浓度的XJ-60对NAFLD模型细胞的潜在治疗效果。细胞按照密度1×10⁴/孔接种于96孔板中，并在37 ℃、5% CO₂的条件下孵育以促进细胞贴壁生长。待细胞贴壁后，更换含有FFA的培养基，并加入不同浓度的XJ-60，每组设6个复孔。继续培养48 h后，向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，并在37°C培养箱继续孵育1~2 h。CCK-8 溶液能够被活细胞中的脱氢酶还原，产生黄色的甲兰色素，其吸光度与活细胞数成正比，通过测量 450 nm 波长下的吸光度，可以间接反映细胞的存活率。细胞存活率的计算基于以下公式：细胞存活率 = ［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%。其中，As为实验孔吸光度（含细胞、培养基、CCK8溶液和药物溶液），Ac为对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物），Ab为空白孔吸光度（含培养基、 CCK-8 溶液，不含细胞、药物），实验数据通过计算每组的平均吸光度和相应的细胞存活率来分析。

1.2.5 细胞免疫荧光染色检测SP1、p-Smad3的表达

经12孔板爬片处理后的细胞，4%多聚甲醛固定后，用0.1% Triton X-100透化10 min，5% BSA室温封闭1 h。分别加入一抗SP1和p-Smad3（均以1∶200稀释），4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后，加入荧光标记的二抗，室温避光孵育1 h。DAPI染核5 min，封片后于荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6 细胞和组织油红O染色

均按照索莱宝染色试剂盒操作步骤操作。

1.2.7 肝组织HE染色

小鼠处死后立即取少部分肝组织用4%多聚甲醛溶液中固定48 h，用石蜡包埋后再切片，厚度一般约为4 μm。染色时要先将片子下行后再依次放入二甲苯溶液和梯度乙醇溶液、水和苏木精染液中，再放进水中分色，流水冲洗，晾干后用伊红染色，水洗后进入梯度乙醇溶液，然后放入二甲苯，中性树脂封片，最后显微镜下观察。

1.2.8 微板法检测肝组织上清液ALT、AST含量

将新鲜肝组织用无菌生理盐水研磨后，2500 r/min离心10 min，取得组织上清，按照试剂盒说明书操作，96孔板分别做标准孔、空白对照孔以及样本孔，分别加入待测试剂，酶标仪检测A_{450 nm}，通过与标准孔的比值计算得ALT、AST。

1.2.9 ELISA检测肝组织上清液炎症因子IL-6含量

肝组织上清液按照ELISA试剂盒说明书详细操作，标准品做梯度稀释获得标准曲线，其余各孔加入样品，酶标仪检测A_{450 nm}，最后用测得的标准曲线定量炎症因子IL-6浓度。

1.2.10 免疫组织化学染色检测Sp1、FN表达

采用SP二步法，将组织切片行脱蜡、水化、微波炉加热进行抗原修复；30 mL/L H₂O₂去离子水孵育，一抗SP1（1∶200）、FN（1∶400），4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后，加相应二抗孵育，DAB显色，自来水充分冲洗、复染、脱水、封片，光镜下观察并拍照。

1.2.11 Real-time qPCR检测NAFLD中各指标mRNA含量

Trizol法提取肝组织和肝细胞RNA。测其浓度并进行逆转录获得cDNA，按照荧光定量试剂盒配制反应体系后，于荧光定量PCR仪中扩增检测。结果以GAPDH为内参照，目的基因相对含量采用2- ^ΔΔCt 法计算并进行统计分析。引物由上海生物工程公司合成，序列如表1。

1.2.12 Western blotting检测肝组织和肝细胞中EMT和ECM相关蛋白及SP1、TGF-β、Smad3、p-Smad3的表达水平

根据BCA试剂盒说明书进行操作，检测组织和细胞上清中蛋白的浓度，并加入5x蛋白上样缓冲液稀释，100 ℃煮沸15 min获得细胞上样蛋白。制作不同浓度聚丙烯酰胺凝胶，经蛋白上样、电泳、转膜、封闭、洗涤、加入GAPDH（1∶5000）、SP1（1∶1000）、TGF-β（1∶1000）、p-Smad3（1∶2000）、Smad3（1∶2000）、FN（1∶2000）、Col-Ⅳ（1∶2000）、E-ca（1∶1000）、α-SMA（1∶1000）抗体于4 ℃孵育过夜。次日取出，洗涤后加二抗孵育；使用增强化学发光法显色、曝光获得目的条带，经统计软件分析后得到灰度值进行统计分析。

1.2.13 统计学分析

使用SPSS 25.0 软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示。多组间数据的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 XJ-60对各组小鼠生化指标的影响

6周龄的db/db小鼠适应性饲养1周，腹腔给药8周后，血糖仍旧高于正常水平（P<0.05，图1A）；与NC组相比，NAFLD组小鼠甘油三酯、总胆固醇均有明显升高（P<0.05，图1A），提示db/db小鼠脂肪代谢异常；经过XJ-60治疗后，小鼠血清中的甘油三酯、胆固醇水平相比较NAFLD组均有明显下降趋势（P<0.05，图1A）。肝组织上清液中ALT、AST测定结果可见NAFLD组ALT、AST表达量均比NC组高，用药治疗后有所改善（P<0.05，图1B）。

2.2 肝组织病理形态学变化

HE染色结果显示（图2A），NC组内可见完整肝细胞及细胞核，细胞胞质呈均匀红染，胞核的大小形态均正常，核质淡染，肝小叶完整且清晰，肝细胞排列整齐，围绕着中央静脉的肝细胞无变性和坏死且呈放射状排列；而NAFLD组可见由脂肪积累所引起的空泡样变，胞浆色淡染且疏松，肝小叶破坏严重，肝细胞紊乱排列，细胞间隙较明显；用药后细胞胞核较完整，胞质清晰，细胞间隙改善。肝组织油红O染色可见NAFLD组存在大量脂滴沉积，用药后脂滴沉积减少（图2B）。

2.3 XJ-60处理降低NAFLD组炎症因子IL-6表达

与NC组相比，NAFLD组IL-6含量增加（P<0.05），用药后减低（P<0.05），提示用药后炎症有所改善（图3）。

2.4 XJ-60对NAFLD Sp1、FN变化的影响

Western blotting结果（图4A）显示与NC组比较，NAFLD组中Sp1、FN蛋白表达增多（P<0.05），经XJ-60治疗后二者蛋白表达水平均有所降低（P<0.05）。与NC组比较，NAFLD模型组Sp1和FN mRNA的表达水平有所升高（P<0.05，图4C），经XJ-60治疗后下降（P<0.05）。免疫组织化学染色结果显示（图4D）：与NC组相比，NAFLD组中的FN蛋白在细胞间质中表达增加，Sp1蛋白在细胞核中表达增加，用药后有所下降。

2.5 XJ-60对NAFLD纤维化、EMT相关指标变化的影响

Western blotting结果显示（图5A）与 NC组比较，NAFLD模型组Col-Ⅳ表达增高（P<0.05），表明NAFLD模型组ECM大量沉积，经XJ-60治疗后有所降低（P<0.05）。与NC组相比，NAFLD模型组α-SMA表达增多、E-ca表达减少（P<0.05），用药后α-SMA表达减少、E-ca表达增加（P<0.05）。

2.6 Sp1与EMT指标表达的相关性分析

Spearman秩相关性分析（表2）显示：Sp1和α-SMA表达呈显著正相关，相关系数为0.777（P<0.01）；Sp1和E-ca表达呈显著负相关，相关系数为0.767（P<0.01）。

2.7 CCK8筛选XJ-60作用于AML12细胞最适浓度

图6A结果显示XJ-60药物浓度在10 μmol/L以内与NC组无明显差别，对细胞活性无显著毒性（P>0.05）。然而，当浓度超过10 μmol/L时，则呈现出明显的细胞毒性。之后在FFA干预条件下（图6B），比较NC组、PO组、PO+XJ-60 （10、20、30、40、50、60 μmol/L）处理组对 AML12 细胞活性的影响，与NC组相比，PO组细胞活性显著降低。在6个含XJ-60的处理组中，10 μmol/L XJ-60组与PO组相比，细胞活性恢复效果最为显著（P<0.01），表明10 μmol/L的XJ-60是改善FFA诱导的NAFLD 细胞模型活性的最适浓度。基于上述结果，后续实验将选用药物浓度为10 μmol/L的XJ-60对NAFLD细胞模型进行深入的机制研究，以期探究XJ-60改善NAFLD的具体分子机制。

2.8 细胞油红O染色观察XJ-60对FFA诱导的AML12细胞中脂滴积累疗效

细胞油红O染色结果显示，NC组AML12细胞中未见脂滴积累，染色较浅；PO组细胞中脂滴显著增多，染色深且密集，NC组与PO组之间存在显著差异（P<0.01）。XJ-60组细胞中脂滴数量明显减少，染色强度显著低于PO组（P<0.01）。

2.9 XJ-60可下调FFA诱导的AML12细胞中SP1、TGF-β、p-Smad3的表达

Western blotting结果（图8A）显示与NC组比较，PO组中SP1、TGF-β、p-Smad3蛋白表达增多（P<0.05），经XJ-60干预后三者蛋白表达水平均有所降低（P<0.05）。Real-time PCR结果（图8C）显示与NC组比较，PO组SP1、TGF-β和p-Smad3 mRNA的表达水平有所升高（P<0.05），经XJ-60治疗后下降（P<0.05）。免疫荧光染色结果（图8D、E）显示，PO组中SP1和p-Smad3的免疫荧光染色增强，表明该通路在PO组中可能被激活。加入XJ-60后，SP1和p-Smad3的染色强度显著减弱。

2.10 FFA联合敲低SP1可下调TGF-β、p-Smad3以及ECM相关指标表达

在FFA干预条件下敲低SP1后，Western blotting结果（图9A）显示TGF-β、p-Smad3及ECM相关指标FN和Col-Ⅳ的蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。同时，Real-time qPCR结果（图9C）进一步证实，TGF-β、FN及Col-Ⅳ的mRNA表达水平也呈现一致的下调趋势（P<0.05）。

2.11 XJ-60对FFA诱导的AML12中各蛋白的表达影响

Western blotting结果（图10A）显示：与NC组相比，PO组中α-SMA的蛋白表达显著上调（P<0.01），而E-ca的蛋白表达显著下调（P<0.01），提示NAFLD模型组中发生了EMT；此外，与NC组相比，PO组中FN和Col-Ⅳ的蛋白表达显著升高（P<0.01），经XJ-60干预后，FN、Col-Ⅳ和α-SMA的蛋白表达水平明显降低（P<0.01），E-ca的蛋白表达显著升高（P<0.01）。Real-time qPCR结果显示各组各指标mRNA水平（图10C）与Western blotting蛋白变化一致。

2.12 XJ-60与CAA对NAFLD纤维化的治疗效果比较

Western blotting实验（图11A）评估并比较CAA及XJ-60对纤维化相关蛋白表达水平的影响， XJ-60处理组中纤维化标志蛋白FN、Col-Ⅳ、α-SMA的表达水平显著低于CAA处理组（P<0.01）。

3 讨论

NAFLD的发病机制十分复杂，其中与胰岛素抵抗，氧化应激，内质网应激，炎症，纤维化等因素有关^［19］，其作为全球慢性肝病的主要类型，目前尚未开发出针对全疾病谱系的获批药物。奥贝胆酸虽能改善NAFLD特定阶段纤维化，但因瘙痒和高剂量风险未获FDA批准^［20］。非诺贝特可缓解NAFLD脂代谢，但临床试验表明，它在降低血清甘油三酯的同时，增加了肝脏体积和脂肪，作用复杂^［21］。基于上述临床需求，本研究旨在开发源自天然产物的NAFLD靶向治疗剂。树豆酮酸A是一种从豆科植物树豆中提取的药物，作为一种具有显著降血糖和降血脂作用的天然化合物^［22］，近年来在糖尿病和肥胖症的治疗中展现出广泛的应用前景，可开发为医治糖尿病或肥胖症的药物或保健食品^［23］。有研究发现，树豆酮酸A能有效抑制前脂肪细胞的成脂分化并且减少肝小叶内的肝细胞变性坏死^［24］。也有研究结果显示树豆酮酸A可有效减轻db/db小鼠非酒精性脂肪性肝损伤，改善糖脂代谢紊乱，抑制脂质过度沉积进而减轻肝纤维化^［25］。但目前关于CAA衍生物XJ-60的系统性研究仍未见报道，本研究采用db/db小鼠自发性NAFLD模型，与对照组相比，模型小鼠的血糖、血脂及转氨酶（ALT/AST）水平显著升高，肝组织出现脂质和胶原过量沉积，并表现出肝损伤与纤维化的典型病理特征。而XJ-60干预能够显著降低NAFLD血糖、总胆固醇、甘油三酯以及组织上清液中的ALT和AST水平，抑制肝组织内脂质沉积，提示XJ-60可以减轻NAFLD的血糖血脂水平和逆转肝损伤。体外实验根据相关研究^［26］中的方法采用750 μmol/L FFA（PA∶OA=2∶1）干预AML12细胞构建NAFLD体外模型，研究结果显示油红O染色定量分析中PO处理组细胞内可见大量脂滴积累，证实模型构建成功。另外在对肝纤维化治疗效果中，XJ-60在降低FN、Col-Ⅳ及α-SMA表达方面的作用优于其母体化合物CAA，本研究证明该衍生物经改构后不仅保留了母体的生物活性，更在抗EMT及抗纤维化方面展现出更强的药理效能。另外，在NAFLD的发生发展中，炎症是最重要的病理生理过程之一。IL-6的水平随着NAFLD的进展而升高，且含量已被证明与 NAFLD 的严重程度相关，还会诱导肝细胞发生脂质过氧化和铁死亡^［27］。在本研究中，XJ-60干预后IL-6水平下降，发挥抗炎作用，进一步研究结果发现XJ-60可有效下调纤维化相关蛋白FN、Col-Ⅳ以及间质转化标志物α-SMA在转录与蛋白水平的表达，并同时上调上皮标志物E-ca的表达，提示XJ-60可延缓NAFLD病程向纤维化的发展且其可能的机制是通过抑制肝细胞上皮-间质转化进程，进而阻遏细胞外基质的异常沉积和NAFLD纤维化发展。

有研究发现SP1可调节上皮-间质转化并且可通过转录激活E-ca表达来调节EMT过程^［28］。Xie等^［29］的研究发现SP1过表达不仅逆转了相关抑制剂对DKD-EMT的治疗作用，还加剧了EMT相关因子的表达。Song等^［30］的研究检测了Sp1在HepG2细胞和HFD饲养小鼠肝脏中的高表达，且其在甘油三酯分泌增加中起着至关重要的作用。最近的研究发现天然药物丹酚酸B通过抑制SP1与P16/P21的结合，抑制SASP因子的释放，抑制巨噬细胞和AT2细胞的细胞衰老，进而抑制肺成纤维细胞的活化^［31］。以上研究表明SP1可能是天然药物治疗纤维化的潜在靶点，但其在NAFLD中纤维化的调控作用尚不明确。在本研究结果中，NAFLD组ECM异常沉积与EMT过程被显著激活，同时肝组织中转录因子SP1表达显著上调。相关性分析进一步表明，SP1与间质标志物α-SMA的表达呈正相关，而与上皮标志物E-ca的表达呈负相关，提示SP1可能通过调控EMT进程参与NAFLD纤维化的发展。在机制层面，XJ-60干预后纤维化表型明显改善，且伴随着SP1表达的下降，我们猜测XJ-60可能通过抑制SP1的转录活性，进而下调其下游EMT相关靶基因的表达，并抑制ECM组分的合成与沉积，最终延缓肝纤维化的进程。这一发现为阐释SP1在NAFLD纤维化中的调控作用及XJ-60的分子机制提供了新的实验依据。

现有研究证实，TGF-β/Smad3信号通路是纤维化进程中的核心调控轴，也是天然产物抗纤维化作用的重要靶标。例如，表没食子儿茶素没食子酸酯抑制TGF-β/Smad3信号通路，减轻肾纤维化^［32］。果胶通过抑制Smad3和TGF-β/Smad3信号通路减轻肾纤维化^［33］。芪参颗粒通过调节TGF-β /Smad3和GSK-3β通路减轻心肌纤维化^［34］。结合本研究结果，XJ-60可显著性降低TGF-β、磷酸化Smad3的表达，说明其抗纤维化作用与抑制TGF-β/Smad3信号通路的致纤维化效应密切相关。而SP1作为TGF-β信号转导的增强因子，可能通过调控TGF-β的转录表达，放大其促纤维化效应，且可能通过结合TGF-β的增强子区域直接驱动其转录，促进TGF-β的表达，进而促进血管生成^［35］。本研究通过SP1敲低实验证实，SP1的下调导致TGF-β在mRNA和蛋白水平均显著降低，表明SP1对TGF-β的调控具有转录依赖性。TGF-β作为肝纤维化的核心驱动因子，其表达下调可直接抑制Smad3的磷酸化激活，阻断下游促纤维化信号的级联放大效应^［36］，本研究结果与其一致。另有研究报道，SP1可能通过间接调控TGF-β的转录表达，促进TGF-β受体的激活，进而通过Smad2/3的C末端磷酸化传递信号，驱动纤维化进程^［37］。在本研究中敲低SP1后磷酸化Smad3水平显著降低，而总Smad3蛋白未发生明显变化，提示SP1主要是促进Smad3的磷酸化激活而非其蛋白稳定性。已有研究表明，TGF-β/Smad3信号通路能够直接调控ECM相关基因的转录，而抑制该通路可显著减轻ECM的沉积^［38］。我们敲低SP1后ECM相关成分FN、Col-Ⅳ mRNA水平和蛋白水平均表达降低，证明敲低SP1可能通过调控TGF-β/Smad3信号通路的激活进而发挥抗纤维化的作用。结合XJ-60可下调SP1、TGF-β、磷酸化Smad3的表达水平实验结果，提示XJ-60抗肝纤维化的分子机制可能是通过抑制SP1的表达，削弱其对TGF-β转录的驱动作用，进而减少TGF-β的合成与分泌，抑制Smad3的磷酸化及下游ECM相关基因的转录激活，最终阻遏肝纤维化进程。

综上所述，XJ-60可在db/db小鼠肝脏中发挥抗炎抗纤维化抗脂滴沉积的作用机制可能是通过抑制SP1/TGF-β/Smad3信号通路的激活从而影响下游IL-6炎症介质的释放及细胞外基质增多来发挥作用的。本研究立足于SP1作为TGF-β/Smad3信号轴的上游调控因子，通过驱动TGF-β的转录表达及Smad3的磷酸化激活，协同促进ECM的沉积和肝纤维化的进展，提示SP1可能作为XJ-60的直接药物靶点发挥在NAFLD中抗纤维化的作用。这一发现不仅深化了对XJ-60在肝纤维化中作用机制的理解，也为进一步明确XJ-60作为NAFLD的潜在治疗药物提供了一定的实验依据。

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