槲皮素通过调控Hippo通路蛋白YAP表达抑制胃癌细胞增殖与迁移并促进其凋亡

Quercetin inhibits proliferation and migration and promotes apoptosis of gastric cancer cells by promoting phosphorylation-mediated YAP inactivation

摘要

目的 探索槲皮素调控胃癌细胞增殖、迁移与凋亡的分子机制。 方法 生物信息学分析Hippo通路蛋白YAP在胃癌和胃癌旁正常组织的表达差异和生存率。Western blotting检测各样本中YAP和磷酸化YAP（p-YAP）的表达水平。槲皮素处理胃癌细胞，CCK8检测细胞活力；敲低YAP基因和槲皮素处理胃癌细胞进行分析比较，EdU、集落形成实验检测细胞增殖，Transwell检测细胞迁移；流式细胞术检测细胞凋亡；Western blotting 和RT-qPCR检测相关基因和蛋白表达水平；免疫荧光检测蛋白定位。过表达YAP基因进行回复实验验证。 结果 YAP在胃癌组织的表达显著高于癌旁正常组织（P<0.05）；YAP的表达与胃癌患者存活率呈负相关（P<0.01）；槲皮素可明显降低胃癌细胞的存活率（P<0.01），促进MST1和LATS1蛋白表达，激活Hippo信号通路，导致YAP的磷酸化失活，核转位减少（P<0.05）；敲降YAP表达和槲皮素处理均能够明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移能力，促进细胞的凋亡（P<0.05）；过表达YAP能够明显降低槲皮素对胃癌细胞增殖、迁移能力的抑制作用和凋亡的促进作用（P<0.05）。 结论 槲皮素可促进YAP磷酸化降解抑制胃癌细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanisms by which quercetin regulates proliferation, migration, and apoptosis of gastric cancer cells. Methods Bioinformatics analysis was conducted to examine the differential expression of Hippo pathway protein yes-associated protein (YAP) between gastric cancer and normal tissues and its correlation with patient survival rates. CCK-8 assay was used to evaluate the effect of quercetin on viability of gastric cancer HGC-27 cells. The expression levels of YAP and phosphorylated YAP (p-YAP) in gastric cancer and normal gastric tissues were detected using Western blotting. In HGC-27 cells with YAP knockdown, the effects of quercetin treatment on cell proliferation, migration and apoptosis were assessed using EdU assay, colony formation assay, Transwell assay, and flow cytometry; the localization of YAP was determined using immunofluorescence staining. Rescue experiments were performed by overexpressing YAP in HGC-27 cells. Results YAP expression was markedly lower in gastric cancer tissues than in normal tissues, and its expression level was negatively correlated with patient survival rates. Quercetin significantly inhibited the survival of HGC-27 cells, promoted MST1 and LATS1 expression, and activated the Hippo signaling pathway, leading to phosphorylation-mediated inactivation of YAP, thereby reducing its nuclear translocation. Both YAP knockdown and quercetin treatment significantly suppressed proliferation and migration and promoted apoptosis of HGC-27 cells. Overexpression of YAP substantially attenuated the inhibitory effects of quercetin in HGC-27 cells. Conclusion Quercetin inhibits proliferation and migration and promotes apoptosis of gastric cancer cells by promoting phosphorylation-mediated inactivation of YAP.

Graphical abstract

关键词

槲皮素 / Hippo信号通路 / 转录共激活相关蛋白 / 磷酸化 / 胃癌

Key words

Quercetin / Hippo signaling pathway / yes-associated protein / phosphorylation / gastric cancer

胃癌是目前世界范围内极为常见的致死癌症之一，据统计，全球目前的胃癌病例数已达97万例，居癌症发病率第5位，其中死亡约66万例，占全球癌症死亡例数的6.8%，是世界第5大癌症死亡率，同时也是中国的第3大癌症死亡率^{［1， 2］}。胃癌病情的发生多由幽门螺旋杆菌感染所引起，在胃近端还常有EB病毒的感染，通过早期诊断阻止胃癌进入发展期和根治性手术仍然是胃癌治疗的关键手段，其次还包括化疗、放疗及靶向治疗等，但胃癌患者的5年生存率只有30%左右^{［3， 4］}，因此对胃癌寻找新的治疗靶点和治疗策略是至关重要的。

Hippo 通路是一种进化上保守的磷酸化依赖性信号级联，在器官大小控制、组织稳态和免疫调节中发挥着至关重要的作用^［5］。通过上游信号传导（如细胞接触、机械应力、G蛋白偶联受体信号等）激活Ste20样激酶（MST1/2）磷酸化后激活LATS1/2激酶，LATS1/2则磷酸化下游YAP蛋白的Ser127，使其产生一个结合位点，磷酸化的YAP与14-3-3蛋白结合，滞留在细胞质中，不能进入细胞核，并最终经历泛素化的降解^{［6， 7］}。相反，未磷酸化的YAP则会进入细胞核，与TEAD等转录因子结合，形成复合物来调控下游靶基因，如富半胱氨酸血管生成诱导因子61（CYR61）、结缔组织生长因子（CTGF）的转录，从而促进细胞增殖、抑制凋亡等^［8］。Hippo通路的紊乱被发现与肿瘤进展与转移相关，研究报道，Hippo通路的失活能够增强癌症干细胞（CSCs）的作用，促进肿瘤的启动和进展^［9］。此外，Hippo通路的异常表达也与上皮-间质转化（EMT）之间存在相互联系，Hippo通路关键分子可与EMT的主要调控因子Snail1和Snail2形成复合物，调控间充质干细胞的功能^{［10， 11］}。YAP作为Hippo通路的核心效应因子，在各种癌症疾病中高表达，能够影响肿瘤的发生发展、增殖、迁移和顺铂耐药性，被认为是癌症治疗的一个潜在靶点^［12-14］。我们前期的生物信息学分析表明YAP在胃癌组织中显著高表达，且与患者的生存率呈负相关，因此我们推测YAP在胃癌的发生发展中起着重要的调控作用，明确YAP在肿瘤的分子机制对于胃癌的早期发现和早期诊断具有重要意义。

槲皮素是一种天然中的黄酮类化合物，存在于多种水果和蔬菜当中，具备多种生物活性，包括抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等^［15-17］。在肿瘤方面，槲皮素可以通过干扰血管内皮生长因子VEGF的信号转导，抑制肿瘤血管形成，从而抑制癌症的发生^［18］。而在鼻咽癌中槲皮素可以抑制Hippo信号通路中YAP的表达，促进顺铂抗性，抑制了鼻咽癌细胞的增殖和迁移^［19］。但槲皮素能否通过Hippo信号通路影响胃癌增殖与凋亡的分子机制未见报道。综上，本研究拟以胃癌细胞HGC-27为研究对象，以Hippo信号通路中核心通路蛋白YAP为研究靶点，探究槲皮素影响胃癌细胞增殖、迁移与凋亡的作用及相关分子机制，为胃癌的药物临床应用提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

10%胎牛血清（Bio-Channel）、1%青霉素-链霉素（碧云天），槲皮素（Quercetin，APExBIO），兔单克隆抗体β-actin（1∶3500）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H＋L）抗体（1∶5000，武汉爱博泰克生物科技有限公司）；Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG（H＋L）抗体（1∶200），兔源一抗YAP（1∶1000）、兔源一抗磷酸化p-YAP（Ser-127）（1∶1000）、兔源一抗LATS1（1∶1000）、兔源一抗磷酸化p-LATS1（1∶1000）、兔源一抗MST1（1∶1000）、兔源一抗磷酸化p-MST1（1∶1000，武汉博士德生物工程有限公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Millipore），EdU检测试剂盒（广州锐博生物科技有限公司），jetPRIME转染试剂（上海优宁维生物科技股份有限公司），CCK8试剂、凋亡试剂盒（苏州优逸兰迪生物科技有限公司），Transwell小室（Corning）；结晶紫染色液（北京兰杰柯科技有限公司），Trizol总RNA提取试剂盒、ECL化学发光液（上海圣尔生物科技有限公司）、逆转录及qPCR检测试剂盒（苏州近岸蛋白质科技有限公司）。

1.2 主要仪器

细胞培养箱（effendorf）；超净工作台（上海三发科技有限公司）；低温高速离心机（山东百欧医疗科技有限公司）；电泳仪、转膜槽、荧光定量PCR仪（Bio-rad）；荧光倒置显微镜（Olympus）；共聚焦显微镜（Abberior）；全自动酶标仪（Therm）；化学发光成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.3 细胞培养

HGC-27胃癌细胞（中国科学院细胞库）用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640完全培养基，置于细胞箱中37 ℃，5% CO₂条件下培养。

1.4 胃癌组织和胃癌旁正常组织

人胃癌组织和胃癌旁正常组织由皖南医学院弋矶山医院胃肠外科获赠，研究经皖南医学院医学伦理委员会批准［伦理批号：（2023）伦审第（122）号］。TCGA数据库分析胃癌组织与正常组织中YAP的差异表达以及与患者存活之间的关系。

1.5 CCK8检测细胞活力

HGC-27细胞按2000个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后用不同浓度的槲皮素（0~70 μmol/L，DMSO稀释）处理细胞24 h后加入CCK8工作液10 μL/孔，置于37 ℃，5% CO₂条件下反应2 h，在酶标仪450 nm波长处检测每孔A值，由计算公式细胞活力（%）=（A_加药组-A_空白组）/（A_0加药组-A_空白组）×100%。

1.6 RT-qPCR检测YAP、CYR61、CTGF和LATS1 mRNA的表达水平

设计YAP、CYR61、CYR61、LATS1和GAPDH的上下游引物，引物由合肥通用公司合成，序列如表1所示。提取胃癌细胞HGC-27的总RNA，逆转录合成cDNA后按qPCR检测试剂盒说明书进行操作，扩增程序如下：首先95 ℃预变性30 s，随后进行循环扩增，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环，2^-△△CT法进行结果分析。

1.7 Western blotting检测蛋白表达水平

细胞蛋白 按需处理好的HGC-27细胞弃去培养基，用预冷的PBS清洗3遍后加入含有PMSF的RIPA裂解液，4 ℃摇床下裂解30 min，细胞刮轻轻刮下细胞于1.5 mL离心管中。组织蛋白 将胃癌组织置于冰上剪成20 mg于1.5 mL离心管中，加入500 μL的裂解液和研磨珠，4 ℃条件下研磨4 min，冰上裂解30 min，取出研磨珠。细胞/组织蛋白在4 ℃，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，用BCA检测蛋白浓度，加入2×Loading buffer混匀，100 ℃加热10 min。取等量蛋白进行SDS-PAGE，将电泳后的蛋白转移至PVDF膜上，用含5%的脱脂奶粉封闭1 h，1×TBST清洗3遍，相关Hippo通路蛋白一抗按1∶1000比例稀释后4 ℃孵育过夜。次日1×TBST清洗3遍，用对应二抗以1∶5000比例稀释后室温孵育2 h，1×TBST清洗3遍后加入化学发光液于化学成像系统下进行发光检测，Image J软件进行灰度值分析。

1.8 细胞转染

HGC-27细胞接种于6孔板，待细胞密度介于30%~50%进行siYAP/pCMV-GFP-YAP转染。转染前先将siYAP/pCMV-GFP-YAP置于冰上解冻，浓度为20 μmol/L的siYAP以5 μL/孔，加入10 μL jetPRIME转染试剂进行转染。浓度为1 μg/μL的pCMV-GFP-YAP以2 μL/孔，加入5 μL jetPRIME转染试剂进行转染。置于37 ℃，5% CO₂条件下培养24 h，荧光显微镜（Olympus）观察荧光表达量。槲皮素处理pCMV-GFP-YAP转染组24 h。

1.9 EdU、集落形成实验检测细胞的增殖能力

EdU 按需处理好的HGC-27细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后，槲皮素以0~50 μmol/L浓度梯度处理细胞24 h后进行EdU实验。实验操作按EdU试剂盒说明书进行，荧光显微镜观察并拍照。Image J统计EdU阳性细胞（红色荧光）与DAPI染色细胞（蓝色荧光）数量，计算EdU阳性细胞在总细胞中所占的比值。集落形成 按需处理好的HGC-27细胞按1000个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，槲皮素以0~50 μmol/L浓度梯度处理细胞，每隔3 d更换1次药物培养基，待孔中能明显看到白色集落后，用0.1%结晶紫试剂进行染色15 min，PBS清洗3遍，数码相机对每孔细胞拍照。

1.10 Transwell实验检测细胞的迁移能力

按需处理的细胞进行消化后用无血清含槲皮素的培养基进行重悬，取细胞悬液200 μL接种于Transwell小室，将小室浸润24孔板内500 μL含20%胎牛血清的完全培养基中，置于37 ℃，5% CO₂条件下培养24 h。取出小室，弃培养基后用PBS清洗，放入0.1%结晶紫试剂中染色15 min，PBS清洗3遍后用棉签轻轻擦拭小室上层细胞，显微镜下观察并拍照。

1.11 流式细胞术检测细胞的凋亡

将生长状态良好的细胞种于6孔板中，待细胞贴壁后，按需处理细胞，置于37 ℃，5% CO₂条件下培养24 h进行凋亡检测试验。实验操作按凋亡试剂盒说明书进行，流式细胞仪进行信号检测。根据散点分布，统计四个象限以内，活细胞、机械坏死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例。

1.12 免疫荧光检测YAP蛋白定位

细胞以2000/孔种于共聚焦小皿中，待细胞贴壁后用槲皮素以50 μmol/L处理细胞24 h。弃培养基后，4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS清洗3遍，3%-BSA试剂封闭2 h后，YAP抗体以1∶100的稀释浓度4 ℃孵育过夜。次日PBS清洗3遍后用Alexa Fluo r 555荧光二抗以1∶200比例稀释后常温避光孵育2 h，PBS清洗3遍后共聚焦显微镜下进行观察拍照。

1.13 统计学分析

所有数据均用均数±标准差表示，通过SPSS 25.0软件进行数据分析，Student's t检验进行两组之间的比较，使用单因素方差分析进行多组间比较，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett's T₃法，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 YAP在胃癌组织的表达水平及YAP表达在胃癌患者存活率的关系

TCGA数据库分析发现YAP在胃癌组中的表达水平显著高于癌旁正常组（P<0.05），且YAP高表达患者的存活率显著降低（P<0.05）。检测胃癌组织和癌旁正常组织的YAP和p-YAP蛋白表达显示，胃癌组织中YAP的表达量显著高于癌旁正常组织，p-YAP的表达量显著低于癌旁正常组织（P<0.01，图1）。

2.2 敲降YAP表达对细胞增殖、迁移和凋亡的影响

Western blotting结果显示YAP敲低细胞系构建成功（P<0.001），qPCR结果显示YAP敲低后其下游基因CYR61和CTGF的表达显著降低（P<0.01）。相较于对照组，YAP敲低组的EdU阳性细胞比例显著降低（P<0.01）；细胞集落数目显著低于减少（P<0.01）；细胞迁移数量显著下降（P<0.01）；细胞凋亡数量则显著增多（P<0.05，图2）。

2.3 槲皮素对胃癌细胞活力的影响

本研究以HGC-27为研究对象，槲皮素按0~70 μmol/L梯度递增浓度作用细胞24 h，结果显示，细胞活力被明显抑制，其中60 μmol/L以上浓度细胞抑制性差异较大，故选取浓度为≤50 μmol/L的槲皮素处理细胞（P<0.01，图3）。

2.4 槲皮素处理对细胞增殖、迁移和凋亡的影响

细胞功能实验结果显示，随着槲皮素浓度的增加，EdU阳性细胞比例显著降低（P<0.05），细胞集落数目显著减少（P<0.05，图4），细胞迁移数量显著下降（P<0.01），细胞凋亡数量则显著增多（P<0.05，图5），而且结果均呈槲皮素浓度梯度依赖性变化。

2.5 槲皮素处理对Hippo信号通路蛋白表达的影响

Western blotting结果显示在0~50 μmol/L梯度浓度内，MST1和LATS1的蛋白表达量随槲皮素浓度梯度升高而显著增加，YAP的蛋白表达则显著降低（P<0.01）。选取槲皮素浓度为50 μmol/L处理的细胞检测不同时间段蛋白的表达量，结果显示，槲皮素作用24 h内MST1、LATS1和p-YAP的表达量逐渐上升（P<0.05）。RT-qPCR实验分析mRNA表达的结果显示，相较于对照组，槲皮素浓度为50 μmol/L细胞中LATS1和YAP的mRNA表达量则没有显著性差异（P＞0.05），但YAP下游靶基因CYR61和CTGF的mRNA表达量显著降低（P<0.05）。免疫荧光实验检测YAP在槲皮素浓度50 μmol/L处理下核质的表达量差异，结果显示，相较于细胞质，YAP在核内的表达量下降明显（P<0.05，图6）

2.6 过表达YAP对槲皮素作用细胞效果的影响

HGC-27细胞进行YAP过表达后选取槲皮素作用浓度为50 μmol/L条件下的细胞进行回复实验。Western blotting结果显示YAP过表达细胞系构建成功（P<0.05）。RT-qPCR实验分析50 μmol/L槲皮素作用YAP过表达细胞后下游靶基因CYR61和CTGF的mRNA表达量，结果显示，相较于Control+Que组，oe-YAP+Que组的CYR61和CTGF mRNA表达量均显著上升（P<0.01，图7）。细胞功能实验结果显示，对比Control+Que组，oe-YAP+Que组EdU阳性细胞比例显著增高（P<0.05），集落形成数目显著增多（P<0.05），细胞迁移数量显著增加（P<0.05），细胞凋亡数量显著减少（P<0.05，图8）。

3 讨论

胃癌是全球极为常见的消化道恶性肿瘤疾病之一，具有高发病率和高死亡率^［20］。Hippo信号通路中的核心蛋白YAP，作为转录共激活因子，在细胞核内通过与TEAD蛋白家族结合形成转录复合物，诱导靶基因转录，促进肿瘤的进展^［21］。以往的研究发现，在胃癌早期病变组织当中，YAP的异常活化会导致癌细胞的增殖，从而加速肿瘤的扩散和转移^{［22， 23］}。为了进一步分析YAP表达在胃癌发生发展的影响，以及相关的预后生存分析，本研究在TCGA数据库中分析出胃癌组织相较于胃正常组织中，YAP呈现显著高表达，且YAP的高表达与患者的存活率呈现明显负相关。在此基础上，本研究还通过提取胃癌病人术后切除的新鲜肿瘤组织及癌旁正常组织，通过提取组织蛋白，检测出YAP在胃癌组织中呈明显的高表达水平，YAP的磷酸化水平在胃癌组织中则呈低表达状态。针对这一结果，本研究对胃癌细胞内YAP基因进行敲降，通过EdU、Transwell和流式细胞术检测出细胞的增殖和迁移能力明显被抑制，其凋亡数量显著上升，提示YAP在胃癌的发生发展中起到重要的调控作用。

越来越多的研究表明，槲皮素具有多途径、多靶点的抗肿瘤作用，可抑制包括肺癌、胃癌、食管癌、肝癌等多种肿瘤疾病的进展^［24-26］。胃癌作为消化道恶性肿瘤，血管生成为胃癌细胞的增殖、转移和侵袭提供氧气和养料^{［27， 28］}，槲皮素通过下调血管内皮生长因子VEGF和基质金属蛋白酶MMPs，能够抑制肿瘤血管的形成，切断肿瘤细胞的营养途径^{［29， 30］}。本研究应用不同浓度的槲皮素作用于胃癌细胞HGC-27，检测出槲皮素对胃癌细胞活力具有显著的抑制作用。挑选出0-50 μmol/L浓度梯度作用于胃癌细胞24 h，结果显示出随着槲皮素浓度的增加，细胞的增殖能力和迁移能力被显著抑制，且细胞凋亡数量也明显增多，提示槲皮素在体外能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移与凋亡。

尽管已有研究证明在膀胱癌、乳腺癌、鼻咽癌中槲皮素可通过Hippo通路抑制肿瘤的发生^{［19， 31， 32］}，靶向Hippo通路介导的肿瘤抑制是多种肿瘤治疗的重要策略^［6］，但目前槲皮素是否通过Hippo-YAP通路影响胃癌细胞的增殖、迁移与凋亡尚不清楚。因此，本研究以槲皮素处理胃癌细胞HGC-27，提取总RNA和蛋白，对Hippo中的关键因子进行转录和翻译水平的含量和定位检测，结果显示尽管在mRNA水平上槲皮素对LATS1和YAP的表达没有明显的作用，但在蛋白表达水平却显著增加了MST1和LATS1的表达，促进Hippo信号通路的开启，激活YAP的磷酸化，导致YAP蛋白的降解，同时影响了YAP的核定位，YAP入核减少，抑制了下游靶基因血管生成诱导的相关因子CYR61与CTGF的表达，进而抑制胃癌细胞的增殖和迁移，促进胃癌细胞的凋亡。

为进一步证明槲皮素通过抑制YAP入核表达发挥抑癌作用，本研究对在胃癌细胞中对YAP进行过表达回复实验验证。结果显示在YAP过表达的情况下槲皮素作用胃癌细胞HGC-27逆转了槲皮素对CYR61和CTGF的mRNA表达抑制，而且胃癌细胞增殖和迁移的抑制作用被减弱，细胞的凋亡数量也相对减少。该结果验证了槲皮素通过抑制YAP表达从而抑制了胃癌的发生发展。本实验还存在一些不足之处。缺少动物实验进一步验证槲皮素在体内抑制胃癌的发生发展，后续将补充小鼠实验对所得结果进一步验证。

总之，本研究发现YAP在胃癌中呈现高表达，敲降YAP后能够抑制胃癌细胞HGC-27的增殖和迁移能力，促进细胞的凋亡。同时验证槲皮素可促进Hippo信号通路的开启，上调了MST1和LATS1的表达并促进其磷酸化，进而调控YAP的磷酸化降解，抑制YAP入核定位和下游靶基因血管生成诱导的相关因子CYR61与CTGF的转录，从而抑制了胃癌的发生发展。这一发现为研究Hippo信号通路在胃癌发生发展的潜在分子机制提供一个新的认识，为胃癌的药物临床诊疗提供一个新的视角和靶点。

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基金资助

癌症转化医学安徽省重点实验室开放课题(KFKT202303)

中青年教师培养行动项目(JWFX2024027)

国家级大学生创新创业训练计划项目(202310368011)

安徽省大学生创新创业训练计划项目(S202310368031)

安徽省大学生创新创业训练计划项目(S202410368040)

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