变应原诱导常年性变应性鼻炎患者血液中CCR3⁺粒细胞亚群活化

Allergens induce activation of blood CCR3⁺ granulocyte subsets in patients with perennial allergic rhinitis

摘要

目的 探讨变应原对变应性鼻炎（AR）患者血液CCR3⁺粒细胞亚型活化的影响。 方法 流式细胞术检测变应原对AR患者血液粒细胞群CCR3⁺CD203c^-嗜酸性粒细胞和CCR3⁺CD203c⁺嗜碱性粒细胞活化分子CD63和CD203c表达水平的影响。多重免疫荧光分析和ELISA技术分别检测志愿者血浆IL-25和TSLP的水平，并分析其与嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞数量的相关性。转录组测序AR患者血液CD16^-粒细胞，并富集分析其差异表达基因的功能和潜在机制。 结果 AR患者CCR3⁺粒细胞中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例增加（P<0.005），变应原诱导嗜碱性粒细胞的比例增加（P<0.005）。季节性AR（sAR）和常年性AR（pAR）而非皮肤点刺试验阴性的AR（nAR）患者血液粒细胞群中嗜酸性粒细胞CD63的平均荧光强度表达水平增强（P<0.005），变应原诱导pAR患者嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞CD63和CD203c平均荧光强度的表达水平增强（P<0.005）。AR患者升高的血浆IL-25和TSLP水平与增加的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量相关（均P<0.005）。皮肤点刺试验阳性AR患者CD16^-粒细胞差异表达的3999个基因在蛋白合成、能量代谢和免疫功能等方面发生了潜在变化，内吞作用、吞噬体和碳代谢等通路可能参与上述变化。 结论 本研究深化了对血液粒细胞群中CCR3⁺嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞参与皮肤点刺试验阳性AR发病机制的理解，揭示了AR治疗的潜在靶点。

Abstract

Objective To explore the effects of allergens on activation of blood CCR3⁺ granulocyte subtypes in patients with allergic rhinitis (AR). Methods Flow cytometry was used to examine the effects of allergens on CD63 and CD203c expressions on CCR3⁺CD203c^- eosinophils and CCR3⁺CD203c⁺ basophils of AR patients. Plasma levels of IL-25 and TSLP of the patients were detected with multiplex immunoassay and ELISA, respectively, and their correlations with eosinophils and basophils were analyzed. RNA-sequencing of blood CD16^- granulocytes from AR patients was performed, and enrichment analysis was used to explore the functions and potential mechanisms of the differentially expressed genes. Results The percentages of eosinophils and basophils in CCR3⁺ granulocytes increased significantly in AR patients (P<0.005), and exposure to allergens further upregulated the percentage of basophils (P<0.005). CD63 expression was significantly increased in patients with seasonal AR (sAR) and perennial AR (pAR) (P<0.005) but not in AR patients negative for skin prick test (nAR). Allergen exposures enhanced the expressions of CD63 and CD203c on eosinophils and basophils in pAR patients (P<0.005). Elevated plasma IL-25 and TSLP levels in AR patients were associated with increased eosinophil and basophil counts (P<0.005). The 3999 differentially expressed genes in CD16^- granulocytes from AR patients positive for skin prick test (SPT⁺) were involved in protein synthesis, energy metabolism and immune function and in endocytosis, phagosome and carbon metabolism pathways. Conclusion The findings in this study enrich the understanding of the roles of CCR3⁺ eosinophils and basophils in the pathogenesis of SPT⁺AR and reveal potential therapeutic targets for AR.

Graphical abstract

关键词

变应原 / 变应性鼻炎 / 嗜酸性粒细胞 / 嗜碱性粒细胞 / 活化

Key words

allergen / allergic rhinitis / basophils / eosinophil / activation

变应性鼻炎（AR）是一种常见的多种免疫细胞和细胞因子参与的病理机制复杂的过敏性疾病，其中IgE介导的免疫反应在AR发病中起重要作用：个体首次吸入变应原可诱导浆细胞产生特异性IgE，IgE随后与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的高亲和力IgE受体Iα链（FcεRIα）结合；再次暴露于相同变应原时，变应原与IgE结合，诱导嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯等炎症介质，进而诱导过敏的急性症状^［1］。同时，嗜酸性粒细胞的浸润和激活也是AR慢性炎症的重要特征之一^［2］。嗜碱性粒细胞不仅在血液单个核细胞群，还有一部分在粒细胞群^{［3， 4］}。趋化因子受体CCR3主要表达于嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞^［5-7］，与其配体CCL11等结合后介导嗜酸性粒细胞^［8］和嗜碱性粒细胞^［7］的迁移和募集。CD63是一种溶酶体相关膜蛋白，参与嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等细胞的脱颗粒过程^［9］。血细胞中CD203c仅表达于嗜碱性粒细胞^［10］，并可作为乳糖过敏患者嗜碱性粒细胞的活化标志分子^［11］。总之，CD63和CD203c的表达水平的变化可以反映嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的活化状态。近年来的研究发现上皮细胞源的天然致炎因子IL-25和胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）可通过诱导嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞增殖和活化进而在AR的炎症反应中起重要作用^{［12，13］}。其实，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞均可分泌IL-25^［14］，嗜碱性粒细胞还可分泌TSLP^［15］。

尽管已有大量研究揭示AR的病理机制^{［16，17］}，但是目前变应原对不同亚型AR患者血液粒细胞群中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞活化及转录组学表达的影响仍未开展。此外，IL-25和TSLP在不同亚型AR患者的血浆水平及其与粒细胞群中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞数量的相关性也需要进一步探讨。鉴于此，本研究旨在通过分析皮肤点刺试验（SPT）阴性的AR（nAR）、SPT阳性的季节性AR（sAR）、常年性AR（pAR）患者血液中CCR3⁺嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例及其活化状态，探讨户尘螨（DPE）和蒿草花粉（ASE）变应原对上述细胞活化的影响。同时，通过检测AR患者血浆IL-25和TSLP的水平，分析其与上述细胞数量的相关性，并通过转录组学测序进一步探讨AR患者上述细胞的基因表达谱及其潜在的生物学功能和机制。本研究将有助于深化对AR发病机制的理解，并揭示AR治疗的潜在靶点。

1 资料和方法

1.1 材料

小鼠抗人APC-CCR3单抗及其同型单抗小鼠APC-IgG2bκ、小鼠抗人PE/Cy7-CD63单抗及其同型单抗小鼠PE/Cy7-IgG1 κ、小鼠抗人PE-CD203c单抗及其同型单抗小鼠PE-IgG1 κ、人Fc受体阻断剂、人TSLP检测试剂盒、人红细胞裂解液和Zombie Aqua活细胞染料（Biolegend）；含人IL-25的多因子检测试剂盒（R&D Systems）；DPE和ASE变应原粗提液（新华联协和药业）；多形核细胞分离液（Serumwerk Bernburg AG）；抗人CD16免疫磁珠微球和分选缓冲液（Invitrogen）。

1.2 标本的采集

募集河南省人民医院（伦理批号：伦审新技术1-158号）和锦州医科大学附属第一医院（伦理批号：KY201702）过敏反应科门诊的AR急性期患者（排除行脱敏治疗、局部或全身使用激素或抗过敏药物、接受其他可能影响免疫细胞活化和细胞因子水平治疗的患者）和体检中心的体检人员，并排除患有感染、代谢和器质性疾病的志愿者。根据病史和SPT明确阳性变应原，AR亚型的诊断标准符合中国变应性鼻炎诊疗指南^［18］。本研究募集了30例健康人（HC）、14例nAR患者、16例sAR患者和29例pAR患者（表1）。与每位志愿者签署知情同意书后采集其外周静脉血，血细胞用于流式检测，血浆用于细胞因子水平检测。

1.3 方法

1.3.1 流式细胞术检测变应原对人外周血CCR3⁺粒细胞CD63和CD203c表达水平的影响

根据SPT的结果加入特异性变应原ASE或DPE（终浓度：0.1和1 μg/mL）激发30 min。终止激发后用人Fc受体阻断剂和Zombie Aqua预孵育血细胞，然后加入APC-CCR3、PE/Cy7-CD63和PE-CD203c，并做同型对照管实验，孵育后裂解红细胞。最后用流式细胞仪收集100 000个白细胞，并检测粒细胞群中CCR3⁺细胞、CCR3⁺CD203^-嗜酸性粒细胞和CCR3⁺CD203⁺嗜碱性粒细胞表达的比例，及单个嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞分别CD63和CD203c的强度（MFI）。

1.3.2 检测人血浆IL-25和TSLP的水平

基于人多因子检测试剂盒和ELISA试剂盒的说明书分别检测志愿者血浆IL-25和TSLP的水平。

1.3.3 免疫磁珠分选人血液CD16-粒细胞并进行转录组测序

多形核细胞分离液密度梯度离心法制备人外周血粒细胞，并用抗人CD16磁珠微球阴性法分选CD16^-粒细胞，流式细胞术验证该细胞是纯度为99.4%的CCR3⁺粒细胞（嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的混合物），重悬于Trizol中。批量转录组测序（参考基因组：Homo_sapiens_Ensembl_106）和分析CD16^-粒细胞各mRNA的表达水平（北京诺禾致源科技股份有限公司）。

1.4 统计学分析

GraphPad Prism 9.0处理流式和细胞因子水平数据：箱式图展示相关数据的中位数、上下四分位数、极大值和极小值，Kruskal-Wallis检验分析组间数据整体是否有差异，差异有统计学意义后用Pairwise检验进一步比较；Spearman秩相关分析细胞因子水平与细胞数量之间的相关性。R包（1.12.0）处理转录组数据。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR患者CCR3⁺粒细胞中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在白细胞中的比例增加，变应原诱导嗜碱性粒细胞比例增加

与HC相比，nAR、sAR和pAR患者血液粒细胞群（图1A）中CCR3⁺细胞（P=0.0216、P=0.0002、P<0.0001，图1B、D）、CCR3⁺CD203c^-嗜酸性粒细胞（P=0.0249、P=0.0003、P<0.0001，图1C、E）和CCR3⁺CD203c⁺嗜碱性粒细胞（P=0.0111、P<0.0001、P<0.0001，图1C、F）在白细胞中的比例增加。与nAR患者相比，sAR和pAR患者嗜碱性粒细胞的比例增加（图1C、F；P=0.0066、P=0.0019）。此外，CCR3⁺粒细胞群中嗜碱性粒细胞约占6%、嗜酸性粒细胞约占94%，且二者的比例在HC和各AR亚型患者中差异无统计学意义（P>0.05，图1C）。

ASE而非DPE变应原可诱导nAR、sAR和pAR患者血液嗜碱性粒细胞的比例增加（图1C、F；P=0.0339、P=0.0026、P=0.0416、P=0.0379、P=0.0010），但是两种变应原对上述志愿者血液粒细胞群中CCR3⁺细胞（P>0.05，图1B、D）和CCR3⁺CD203c^-嗜酸性粒细胞（P>0.05，图1C、E）的比例均无影响。

2.2 sAR和pAR患者血液粒细胞群中嗜酸性粒细胞CD63 MFI表达增强，变应原增强pAR患者嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞CD63和CD203cMFI的表达水平

与HC和nAR相比，sAR和pAR患者嗜碱性粒细胞表达CD63 MFI分别增加了32.8%和25.5%、21.8%和15.1%（图2A、C）。DPE进一步诱导pAR嗜酸性粒细胞CD63 MFI增加了16.5%（图2A、C）。尽管上述志愿者粒细胞群嗜碱性粒细胞表达CD203c MFI的水平差异无统计学意义（图2B、D），但是ASE诱导sAR患者CD203c MFI的水平增加了18.1%，ASE和DPE还分别诱导pAR患者嗜碱性粒细胞表达CD203c MFI的水平增加了28.8%和24.6%（图2B、D）。

2.3 AR患者血浆IL-25和TSLP的水平增加

nAR、sAR和pAR患者血浆IL-25的水平较HC分别增加了2.35倍、3.27倍和4.95倍（图3A）。此外，nAR、sAR和pAR患者血浆TSLP的水平较HC分别增加了4.33倍、4.51倍和4.12倍（图3B）。

2.4 AR患者IL-25和TSLP的血浆水平与粒细胞群中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量相关

nAR、sAR和pAR患者血液粒细胞群中嗜酸性粒细胞的数量较HC分别增加2.46倍、1.36倍和3.03倍（图4A）。nAR、sAR和pAR患者血液粒细胞群中嗜碱性粒细胞的数量较HC分别增加了51.3%、3.84倍和1.84倍（图4B）。nAR、sAR和pAR患者血浆IL-25和TSLP的水平与粒细胞群中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量有相关性（表2）。

2.5 转录组学显示AR患者粒细胞群中CD16^-细胞表达CCR3和CD203c，及表达变化分子的功能和潜在通路

转录组测序发现CD16^-粒细胞表达33202个基因；与HC相比，AR患者血液CD16^-粒细胞表达上调的基因有1594个、下调的基因有2405个，无显著变化的基因有29203种（图5A）。热图聚类分析显示HC和AR患者CD16^-粒细胞差异表达基因可以被显著聚类（图5B）。AR患者血液CD16^-粒细胞中CCR3和CD63 mRNA的表达水平显著增加，而CD203c的mRNA ENPP3的表达水平变化无统计学意义（表3）。

GO功能富集差异表达上调和下调的基因显示AR患者CD16^-细胞基因的表达变化主要涉及的生物学过程为核糖体生物合成，三磷酸、ATP和糖基化合物的代谢过程等；主要涉及的细胞成分为核糖体亚单位、细胞质部分、免疫球蛋白复合物和线粒体内膜等，主要涉及的分子功能为核糖体结构成分、电子运载活性、抗原结合和信号模式识别受体活性等（图5C）。

同时，KEGG信号通路富集差异表达基因显示：内吞作用、吞噬体和碳代谢等可能参与AR患者CD16^-细胞基因的表达变化（图5D）。

3 讨论

AR和过敏性哮喘是同一气道同一疾病^［19］。既往的研究发现，AR和过敏性哮喘患者血液粒细胞群CD123⁺HLA-DR^-CD203c⁺嗜碱性粒细胞的比例和数量增加^{［3， 4］}，AR患者血液嗜酸性粒细胞的数量增加^{［20， 21］}。本研究中nAR、sAR和pAR患者血液粒细胞群中CCR3⁺细胞、CCR3⁺CD203c^-嗜酸性粒细胞和CCR3⁺CD203c⁺嗜碱性粒细胞的比例和数量增加的结果支持了上述发现。鉴于嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞可通过释放一系列细胞因子和炎症介质分别在AR的早期相和晚期相炎症反应中起重要作用^［22］，我们的研究结果进一步提示嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的增殖可能在AR发病中起重要作用。此外，本研究中sAR和pAR患者血液粒细胞群中CCR3⁺CD203c⁺嗜碱性粒细胞的比例高于nAR患者和HC，这可能与长期或季节性暴露变应原诱导嗜碱性粒细胞增殖^［23］和活化^［24］有关，同时提示SPT阳性AR患者与nAR患者之间可能存在系统性免疫差异。

值得注意的是，本研究中ASE而非DPE变应原可诱导nAR、sAR和pAR患者血液粒细胞群中嗜碱性粒细胞的比例增加。鉴于鸡卵清白蛋白变应原激发可以诱导AR小鼠模型嗜碱性粒细胞前体细胞的增殖^［23］，而花粉变应原激发对sAR和sAR合并哮喘患者血液嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞前体细胞的增殖无显著影响^［25］，本研究进一步提示不同变应原在诱导AR患者血液嗜碱性粒细胞增殖中具有特异性。

本研究中sAR和pAR而非nAR患者嗜酸性粒细胞CD63MFI表达增强，尤其是，DPE变应原进一步诱导pAR患者嗜酸性粒细胞CD63 MFI的表达增强。鉴于CD63是嗜酸性粒细胞活化的标志分子^［9］，作为AR的主要效应细胞之一，活化的嗜酸性粒细胞可通过释放颗粒储存的阳离子蛋白、新合成的类花生酸类和细胞因子等参与AR^［26］，我们的研究结果进一步证实了活化的嗜酸性粒细胞参与AR，并再次提示SPT阳性AR和nAR患者之间可能存在系统性免疫差异。

此外，本研究中特异性变应原ASE和/或DPE可增强sAR和pAR而非nAR患者血液粒细胞群中CD203c MFI的表达。鉴于CD203c是嗜碱性粒细胞活化的标志分子^［11］，本研究结果提示特异性变应原可增加SPT阳性AR患者血液粒细胞群中嗜碱性粒细胞活化状态，同时提示SPT阳性AR和nAR患者之间可能存在系统性免疫差异。

本研究中nAR、sAR和pAR患者血浆IL-25和TSLP的水平升高的结果似乎支持AR患者体内IL-25 ^［27］和TSLP^［28］水平增加的报道。IL-25和TSLP作为警报素可以激活II型固有淋巴细胞和其他免疫细胞，诱导其分泌II型细胞因子，促进Th2细胞的发育和嗜酸性粒细胞的募集，而Th2细胞依赖的B细胞活化可促进与嗜碱性粒细胞稳定结合的变应原特异性IgE的产生进而参与AR等过敏性疾病^［29］。重要的是，抗IL-25和抗TSLP的抗体可能成为AR等过敏性疾病治疗的新方向^［29］。这进一步提示IL-25和TSLP是AR的生物标志物，有诊断和预后评估AR的潜能。

本研究中nAR、sAR和pAR患者血浆升高IL-25和TSLP的水平与血液中增加的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量呈均有相关性。基于哮喘患者血液嗜酸粒细胞数量增加与血清TSLP水平升高有相关性的报道^［30］，上述结果提示AR患者升高的血浆IL-25和TSLP可能部分来自嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞^{［14， 15］}，或其诱导了嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞增殖^{［12， 13］}。此外，IL-25和TSLP还可能通过促进Th2细胞的活化和细胞因子的分泌增强嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的募集和活化^{［12， 13］}，形成了正反馈环路，进一步加剧AR的炎症反应。因此，基于IL-25和TSLP的干预策略可能通过减少嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的浸润和活化，从而缓解AR。

众所周知，血液FSC-A—SSC-A^high粒细胞群由中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞构成^［31］。根据中性粒细胞表达CD16^［32］而嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞不表达CD16的特征^{［33， 34］}，本研究用CD16磁珠微球阴性选择法分选出粒细胞群中纯度高达99.4%的CCR3⁺粒细胞。鉴于本研究中各组人群血液CCR3⁺粒细胞中嗜酸性粒细胞约占94%、嗜碱性粒细胞约占6%，且二者比例无统计学差异。因此，本研究中分选的HC和AR患者血液CD16^-粒细胞可以被视为比例相近的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的混合体。

本研究中AR患者血液中CD16^-粒细胞共表达33 202个基因，其中1594个基因表达上调，2405个基因表达下调，表明AR患者血液粒细胞群中的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的基因表达水平发生了显著变化。聚类分析证实HC和AR患者的CD16^-粒细胞在基因表达谱上存在显著差异，进一步支持了粒细胞群中的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞参与AR的炎症应答。

值得注意的是，AR患者CD16^-粒细胞CCR3和CD63mRNA的表达水平显著增加。这与流式细胞术结果基本一致，验证了粒细胞群中CCR3⁺嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在AR发病中的重要作用，并进一步提示CD63在AR中作为粒细胞活化标志物的可靠性。然而，本研究中AR患者血液CD203c mRNA ENPP3表达水平无显著变化，这与本研究中其蛋白的表达水平不一致。众所周知，人血液嗜碱性粒细胞组成性表达ENPP3^{［35， 36］}，活化后CD203c蛋白表达水平在15~20 min上调至峰值^［37］，这往往涉及胞内预先存在的蛋白转位到细胞膜表面，而非从头合成。因此，本研究的上述发现提示AR患者嗜碱性粒细胞活化是一个转录后或翻译后的事件，这可能涉及细胞内储存的CD203c蛋白受到刺激后被动员并运输到细胞膜表面。此外，鞘氨醇-1磷酸受体在人嗜碱性粒细胞内转录水平和蛋白水平表达趋势不一致的报道^［38］可能支持了我们的上述研究结果。

本研究中GO功能富集分析显示，AR患者血液CD16^-粒细胞上调表达的基因主要涉及核糖体生物合成、三磷酸、ATP和糖基化代谢过程，细胞成分主要包括核糖体亚单位、细胞质部分、免疫球蛋白复合物和线粒体内膜，分子功能主要包括核糖体结构成分、电子运载活性、抗原结合和信号模式识别受体活性。既往的研究发现，细胞活化后可释放调控免疫应答的三磷酸腺苷即ATP，而CD203c是ATP水解胞外酶^［39］，免疫球蛋白IgE可与其受体FcεRIα和特异性变应原结合形成复合物^［1］。上述结果表明AR患者血液粒细胞群中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在蛋白质合成、能量代谢和免疫功能等方面发生了潜在变化。KEGG信号通路富集分析显示，内吞作用、吞噬体和碳代谢等通路可能参与AR患者CD16^-粒细胞基因的表达变化，提示过敏时可能通过调控嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的内吞和吞噬功能^{［40， 41］}，影响抗原的处理和提呈^［42］，进而调节AR免疫反应。同时，AR患者血液CD16^-粒细胞中碳代谢的改变可能提示炎症反应中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的能量需求和代谢发生变化^［43］。

然而本研究也存在一些局限性：首先，样本量有限，尤其是在转录组学分析中，小样本量可能影响结果的泛化性和统计学显著性。其次，本研究主要基于外周血样本，未直接反映鼻腔局部的免疫环境和细胞群体变化，未来需全面评估AR的系统性和局部免疫反应。此外，本研究采用横断面设计，未明确细胞群体变化和细胞因子水平的因果关系，纵向研究设计如随访患者在治疗前后或不同季节的变化可能更有助于揭示AR的动态免疫机制。最后，转录组学分析虽然揭示了CD16^-粒细胞群中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞混合群体基因的表达变化，但是功能验证实验有限且未进一步将上述细胞分离、纯化，细胞组成的混杂效应可能会干扰转录组学的结论，尚需体内、外和纯化实验进一步验证这些基因的具体功能和机制。

总之，SPT阳性AR患者血液粒细胞群中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例和数量增加，且活化增强，IL-25和TSLP水平升高并与粒细胞群嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量相关，CD16^-粒细胞在基因表达和功能上发生了显著变化。这些发现深化了人们对SPT阳性AR发病机制的理解，揭示了AR治疗的潜在靶点。

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基金资助

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