利奈唑胺联用血必净通过抑制Hla-NLRP3通路减轻MRSA肺炎小鼠的炎症损伤

Xuebijing Injection in synergy with linezolid alleviates inflammatory injury in mice with MRSA pneumonia by inhibiting the Hla-NLRP3 pathway

摘要

目的 探讨利奈唑胺（LZD）联用血必净对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染引起的小鼠肺炎的协同保护作用及作用机制。 方法 通过气管滴注MRSA菌液构建肺炎小鼠模型。将60只SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为6组（n=10）：对照组、模型组、血必净单药组（13 mL·kg^-1·d^-1）、LZD单药组（80 mg·kg^-1 ·d^-1）、血必净+LZD低剂量组（血必净 6.5 mL·kg^-1·d^-1+LZD 80 mg·kg^-1 ·d^-1）及血必净+LZD高剂量组（血必净 13 mL·kg^-1·d^-1+LZD 80 mg·kg^-1 ·d^-1）。通过体外抑菌实验和溶血活性实验检测血必净和LZD对MRSA的最小抑菌浓度（MIC）及对MRSA生长曲线及溶血活性的影响。通过HE染色观察肺组织病理学改变，ELISA法检测肺匀浆中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量。qPCR实验检测MRSA Hla、NLRP3、Caspase-1和ASC的mRNA水平。Western blotting实验分析MRSA Hla、NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达。免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达量。 结果 LZD联用血必净可提高MRSA肺炎小鼠的生存率，降低MRSA肺炎小鼠的肺组织炎症细胞浸润及肺损伤评分（P<0.01）；LZD联用血必净降低MRSA肺炎小鼠肺匀浆的IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量（P<0.05），并抑制小鼠肺组织MRSA Hla、NLRP3、Caspase-1和ASC的mRNA水平和蛋白的表达（P<0.05）。血必净对MRSA无抑菌活性，且对MRSA的增殖无抑制作用，但可在体内外抑制MRSA分泌α-溶血素（Hla），进而通过NLRP3相关通路作用抑制炎症反应，而LZD无此作用。 结论 LZD与血必净联用可增强其改善MRSA肺炎的药效，其机制可能为血必净可通过抑制α-溶血素分泌进而降低NLRP3介导的炎症反应。

Abstract

Objective To evaluate the synergistic protective effect of linezolid (LZD) combined with Xuebijing Injection (XBJ, a traditional Chinese medicine injection) against pneumonia caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in mice and explore the underlying mechanism. Methods Fifty C57BL/6J mice with pneumonia induced by tracheal instillation of MRSA were randomized equally into model group, low- and high-dose XBJ treatment groups (13 and 80 mg·kg^-1·d^-1, respectively), and combined treatment groups with low- and high-dose XBJ (6.5 and 13 mL·kg^-1·d^-1, respectively) and LZD (80 mg·kg^-1 ·d^-1), with 10 PBS-treated mice as the normal control group. The minimum inhibitory concentration (MIC) of XBJ and LZD against MRSA and their effects on bacterial growth and hemolytic activity were assessed in vitro. After the treatments, lung pathologies of the mice were observed with HE staining, and IL-6, TNF-α, IL-1β, and IL-18 levels in lung homogenate were measured using ELISA; the mRNA and protein expressions of Hla, NLRP3, caspase-1, and ASC were detected using qPCR and Western blotting, and pulmonary expressions of NLRP3, caspase-1, and ASC were examined with immunohistochemistry. Results The combined treatment with LZD and XBJ significantly improved survival rates of the mouse models, reduced inflammatory cell infiltration and lung injury scores, decreased the levels of IL-6, TNF-α, IL-1β, and IL-18, and downregulated mRNA and protein expressions of Hla, NLRP3, caspase-1, and ASC. XBJ alone showed no antibacterial activity against MRSA but inhibited α-hemolysin (Hla) secretion both in vitro and in vivo to suppress NLRP3-mediated inflammation, while LZD did not produce this effect. Conclusion LZD combined with XBJ produces enhanced efficacy for improving MRSA pneumonia possibly due to XBJ-induced inhibition of NLRP3-mediated inflammatory response via inhibiting α-hemolysin secretion.

Graphical abstract

关键词

血必净注射液 / 利奈唑胺 / MRSA / 肺炎 / NLRP3炎症小体 / α-溶血素

Key words

Xuebijing Injection / linezolid / methicillin-resistant staphylococcus aureus / pneumonia / NLRP3 inflammasome / α-hemolysin

金黄色葡萄球菌，俗称金葡菌，作为常见食源性致病菌广泛定植于皮肤黏膜及开放性创面^［1］。金葡菌感染可引发脓毒症、坏死性肺炎等高致死性并发症，致死风险随感染扩散显著增加^［2］。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）作为呼吸道的条件致病菌，会导致组织损伤，严重影响肺部功能^［3］。流行病学研究显示，全球13%~74%的金黄色葡萄球菌感染由MRSA引起，其导致的肺炎病死率高达30%~50%^{［4， 5］}。2023年我国细菌耐药监测数据进一步揭示，MRSA检出率已攀升至29.1%，防控形势日益严峻^［6］。传统抗生素疗法因耐药性限制疗效欠佳，而新型抗菌药物研发滞后，促使研究者转向针对MRSA致病机制的替代策略。

血必净注射液（XBJ）以经典方剂血府逐瘀汤为组方基础，由红花、赤芍、川芎、当归及丹参组成的中药复方制剂^［7］。新冠肺炎疫情防控期间，XBJ作为“三药三方”核心方案之一，临床数据显示其肺部严重感染指数改善率高于对照组44.4%，提高患者生存率9.8%，显著改善患者预后^［8］。利奈唑胺（LZD）为恶唑烷酮类合成抗生素，具有较强的渗透性，可准确快速地通过肺部多层细胞到达病灶，临床用于治疗MRSA感染性肺炎、皮肤软组织感染等疾病^{［9， 10］}。临床研究显示，LZD联用XBJ治疗重症肺炎较单用LZD可提升临床疗效，联合治疗组的总有效率高于LZD单药组^［11］。研究还观察到，联合治疗能缩短患者症状缓解时间，并将细菌清除率从66.67%提高至84.78%^［12］。这些数据共同表明，LZD与XBJ之间存在显著的协同增效作用^［13］。然而，现有研究主要聚焦于两药联用的临床疗效改善，关于其具体协同作用机制尚缺乏相关研究报道。本研究旨在解析LZD联用XBJ拮抗MRSA肺炎的协同作用机制，为临床联合策略提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60只SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量18±2 g（动物质量合格证号：110324241101822513），购自斯贝福生物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2024-0001］。实验小鼠饲养条件为12 h∶12 h光暗交替，室温25±2 ℃，相对湿度（55±5）%。所有实验方案经河南中医药大学第二附属医院实验动物福利伦理审查委员会审查批准（伦理批号：PZ-HNSZYY-2024-050）。实验动物样本量通过资源方程法确定^［14］。

1.1.2 药物

血必净注射液（天津红日药业有限公司，10 mL/支），使用生理盐水配制浓度为6.5 mL/kg（联用低剂量组）和13 mL/kg（联用高剂量组）的溶液。LZD葡萄糖注射液（斯沃®/Zyvox®，300 mL/0.6 g）用生理盐水配制浓度为80 mg/mL的溶液。

1.1.3 试剂

二甲苯、石蜡、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；盐酸乙醇分化液、返蓝液、HE染液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；多聚甲醛（上海麦克林生化科技有限公司）；IL-6 ELISA试剂盒（BD Bioscience）；TNF-α ELISA试剂盒（武汉三鹰生物技术有限公司）；IL-1β ELISA试剂盒（伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；IL-18 ELISA试剂盒（河南艾方生物科技有限公司）；QIAzol Lysis Reagent （Qiagen）；DEPC-Treated Water （Ambion）；HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 、ChamQTM Universal SYBR® qPCR Master Mix （Vazyme）；RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、PMSF、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（碧云天生物技术有限公司）；一步法 PAGE凝胶快速制备试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（雅酶生物）；兔IgG-免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（博士德生物工程有限公司）；Hla抗体（Sigma）；NLRP3抗体、ASC抗体、Caspase-1抗体（湖南艾方生物科技有限公司）；GAPDH抗体、Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary抗体（Proteintech）；qPCR引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.4 仪器

恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；精密恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；全波长酶标仪、高速台式冷冻离心机、Multiskan MK3 酶标仪（Thermo）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；旋转石蜡切片机（赛默飞世尔仪器有限公司）；生物组织摊烤片机（湖北省孝感市亚光医用有限公司）、生物组织包埋机（湖北省亚光医用电子技术有限公司）；正置光学显微镜（ZEISS）、实时荧光定量PCR仪（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 体外抑菌实验

1.2.1.1　最小抑菌浓度实验

采用美国国家临床实验室标准化委员会推荐的肉汤微量稀释法测定XBJ对MRSA菌株的MIC。将MRSA菌置于LB液体培养基过夜培养（37 ℃，180 r/min），吸取菌液用麦氏比浊仪测定细菌浊度（麦氏浊度单位：MCF），以无菌生理盐水为空白对照（0 MCF），使用无菌生理盐水将菌悬液稀释调整为0.5 MCF（约1×10⁸ CFU/mL），使用LB液体培养基将菌悬液再次稀释至1×10⁶ CFU/mL，用于后续实验。用MH培养基采用倍比稀释的方法稀释XBJ母液与LZD母液，XBJ母液稀释倍数范围为2~1024倍（浓度为500~0.98 μL/mL），LZD溶液最终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL。在96孔板中设置10组药物组，1组阳性对照组（100 μL无加药菌液），1组阴性对照组（100 μL MH培养基），每组设置3个平行孔。在药物组及阳性对照组中加入工作菌液，100 μL/孔，阴性对照组中每孔加入等量MH培养基。同时在96孔板四周填加无菌PBS，防止干燥。将96孔板放置于37 ℃培养箱培养24 h后观察实验结果。肉眼观察细菌生长情况和液体浊度，抑制细菌生长的XBJ溶液与LZD溶液的最低浓度即为对MRSA的MIC值。

1.2.1.2　XBJ和LZD对MRSA的时间-杀菌曲线

根据方法1.2.1.1中方法配置浓度为1×10⁶ CFU/mL的MRSA菌液，将其平均分为5组，分别加入XBJ母液，以梯度稀释XBJ。同样的，将LZD稀释为1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC（16~2 μg/mL），将锥形瓶放入恒温摇床中37 ℃振荡培养，分别在2、4、6、8、10、12、24 h时取各瓶中菌液1 mL，测量不同浓度XBJ下的菌液的A_{600 nm}值，每次测完后将锥形瓶放回摇床中继续培养。

1.2.1.3　MRSA溶血活性测定

取无菌PBS 875 μL、无菌脱纤维兔血25 μL、分别加入含不同浓度XBJ和LZD的MRSA菌液上清100 μL，配成总体积1 mL体系。以0 μg/mL为阳性对照组，以无菌PBS代替MRSA菌液上清为阴性对照组，放入37 ℃恒温培养箱培养2 h，离心后取上清，观察上清液是否发生溶血反应，并将上清液转移至96孔板中，使用多功能酶标仪检测A_{543 nm}值，上述实验重复3次。

1.2.1.4　qPCR实验

培养MRSA菌液浓度至A_{600 nm}=0.3，分成5组。每组分别加入XBJ母液以梯度稀释XBJ，培养到菌悬液达到A_{600 nm}=2.5，且各瓶菌悬液的A值均匀一致。收集菌液离心、弃上清，加入1 mL Qiazol混匀并裂解，根据RNA提取试剂盒说明书提取各组RNA，测定RNA样品浓度及纯度，并逆转录为cDNA，逆转录条件为50 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，4 ℃至+∞。随后进行qPCR检测。根据公式计算出mRNA的相对表达量，其公式为F=2^-∆∆CT。∆∆CT=（测试组目的基因平均CT-测试组内参基因平均CT）-（对照组目的基因平均CT-对照组内参基因平均CT）。引物信息见表1。

1.2.2 动物实验

1.2.2.1　MRSA肺炎小鼠模型的建立

将60只SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为6组（n=10）：对照组、模型组、XBJ单药组（13 mL·kg^-1·d^-1）、LZD单药组（80 mg·kg^-1·d^-1）、XBJ+LZD低剂量组（XBJ 6.5 mL·kg^-1·d^-1+LZD 80 mg·kg^-1·d^-1）及XBJ+LZD高剂量组（XBJ 13 mL·kg^-1·d^-1+LZD 80 mg·kg^-1·d^-1）。除对照组外，其余各组通过气管滴注30 μL MRSA菌液（1×10¹⁰ CFU/mL）建立肺炎模型，对照组同期滴注等体积无菌PBS。造模24 h后，XBJ单药组腹腔注射13 mL/kg，LZD单药组腹腔注射80 mg/kg，XBJ+LZD低剂量组腹腔注射XBJ 6.5 mL/kg和LZD 80 mg/kg，XBJ+LZD高剂量组腹腔注射XBJ 13 mL/kg和LZD 80 mg/kg，给药1次/d，连续给药7 d，第7天给药结束后对小鼠进行取材。

药物剂量采用等效剂量系数换算公式计算：D_小鼠=D_人×（HI_小鼠/HI_人）×（W_小鼠/W_人）^2/3。D：剂量，HI：体型系数，W：体质量。

1.2.2.2　生存率测定

生存率实验的观察时间为7 d，每隔12 h观察小鼠的生存情况。

1.2.2.3　肺组织病理

实验动物处死后完整摘取肺脏，立即置于4 ℃ PBS中进行灌注冲洗，完成左右肺叶解剖分离。左侧肺组织10%多聚甲醛溶液（pH=7.4）固定3 d。将固定好的组织经梯度乙醇脱水（70%~100%）、二甲苯透明处理及石蜡包埋后制成4 μm厚度切片。切片进行常规HE染色后采用数字病理扫描系统随机采集样本图像，通过双盲法评估肺泡炎症程度，参照Matute-Bello建立的标准评估体系^［15］，依据炎性细胞浸润密度及肺泡结构改变程度进行量化评分（无损伤0分、轻度1分、中度2分、重度3分）。

1.2.2.4　免疫组化

采用免疫组化法检测小鼠肺组织NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达。镜检拍照：使用Image-Pro Plus 6.0专业图像采集与分析系统计算图像积分光密度值（IOD）。

1.2.2.5　肺组织IL-6、TNF-α、IL-18、IL-1β含量检测

用小鼠肺匀浆上清液为样本，根据ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-18和IL-1β含量。

1.2.2.6　qPCR实验

将小鼠肺组织按照1∶9的比例加入适量裂解液后，参照1.2.1.4 qPCR实验步骤检测NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达量。引物信息见表1。

1.2.2.7　Western blotting

称取肺组织进行研磨，加入含蛋白磷酸酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解，提取肺组织中的总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE分离目的蛋白、转膜、封闭等步骤后，孵育一抗（稀释比例为Hla 1∶5000、NLRP3 1∶1000、ASC 1∶1000、Caspase-1 1∶1000、GAPDH 1∶1000）4 ℃过夜，洗膜后室温敷二抗（1∶2000）1 h，用ECL发光液显影后，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer 软件）分析PVDF膜中的目标蛋白的光密度值。

1.2.3 统计学分析

实验数据采用IBM SPSS 27.0统计软件进行统计分析。使用Graphpad Prism 9.5作图，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LZD联合XBJ对MRSA小鼠的保护作用

2.1.1 对MRSA肺炎小鼠生存率的影响

与对照组相比，模型组小鼠感染MRSA后存活率降低；与模型组小鼠感染MRSA后第7天相比，各给药组小鼠的生存率均有不同程度的提高，其中两药联用高剂量组改善小鼠死亡率效果最明显。模型组小鼠在感染后第1天即出现死亡，XBJ单药组首次死亡时间推迟至第2天，LZD单药组推迟至第3天，XBJ+LZD低剂量组延至第3天，XBJ+LZD高剂量组无死亡（图1）。

2.1.2 对MRSA肺炎小鼠肺组织病理的影响

HE染色结果显示，与对照组比，模型组小鼠肺泡结构破坏明显，肺泡腔塌陷，肺泡壁断裂融合，可见炎症细胞浸润及条索样瘢痕改。与模型组比，给药组肺泡结构有不同程度的改善，炎症细胞浸润减轻，虽然有不同程度炎症浸润，但较模型组均有所减轻（图2A）。与对照组相比，模型组小鼠HE评分均升高（P<0.001）。给药干预后，与模型组相比，各干预组病理评分均有不同程度下降，XBJ单药组、LZD单药组病理评分有下降趋势但差异无统计学意义，XBJ+LZD低、高剂量组HE病理评分均下降（P<0.01，图2B）。

2.1.3 LZD联用XBJ抑制MRSA肺炎小鼠肺炎症因子表达

与对照组相比，模型组小鼠肺匀浆IL-6和TNF-α含量均升高（P<0.01）。与模型组比较，XBJ组小鼠肺匀浆IL-6和TNF-α含量均下降（P<0.01），LZD组小鼠肺匀浆IL-6含量下降（P<0.01），XBJ+LZD低、高剂量组小鼠肺匀浆IL-6和TNF-α的含量均下降（P<0.05）。与XBJ组比较，XBJ+LZD低、高剂量组小鼠肺匀浆IL-6含量均下降（P<0.05，图2C）。

2.2 LZD联用XBJ抗MRSA肺炎作用机制

2.2.1 MRSA抑菌能力评价

在1/1024~1/2倍（0.98~500 μL/mL） XBJ的96孔板内液体均浑浊，XBJ对MRSA没有直接抑菌作用。LZD浓度为16 μg/mL时，96孔板内培养基呈现透亮澄清，与阴性对照（200 μL LB培养基）相比没有明显差别，LZD对MRSA的MIC为16 μg/mL（图3A）。

2.2.2 对MRSA生长曲线及溶血活性的影响

与对照组（PBS处理）相比，当XBJ在稀释2~16倍（500~62.5 μL/mL）浓度范围内时，A_{600 nm}值变化与对照组差异无统计学意义，培养24 h后，MRSA菌液的A_{600 nm}值可达到2.5左右，呈现正常的生长情况。LZD对MRSA的抑菌效果呈现浓度依赖性：1×MIC（16 μg/mL）完全抑制生长，而在亚MIC浓度下，1/2×MIC（8 μg/mL）延迟细菌增殖；1/4×MIC（4 μg/mL）和1/8×MIC（2 μg/mL）抑制作用微弱，24 h A_{600 nm}分别为2.48和2.51，接近对照组的24 h A_{600 nm}=2.536。时间动态显示，0~2 h药物作用未显现，2~6 h亚MIC组A值增速随浓度降低加快，6~24 h低浓度组逐渐趋近对照组（图3B）。在0~32 μL/mL的浓度范围内，随着XBJ浓度增加，颜色逐渐由红色变成无色。溶血实验结果显示，与0 μL/mL组比，12~32 μL/mL XBJ作用下的MRSA溶血活性均下降（P<0.01）。在XBJ不同浓度（0~32 μL/mL）下，MRSA溶血活性呈现剂量依赖性下降，其溶血活性分别为100%、96.2%、95.0%、53.2%、37.0%、11.0%、7.3%、6.0%。在0~48 μg/mL的浓度下，LZD对MRSA的溶血能力无明显变化，其溶血能力分别为100%、98.3%、105.5%、125.5%、88.0%和116.6%（图3C、D）。

2.2.3 XBJ对MRSA Hla 表达及其调控基因的影响

qPCR结果显示，与未加药组相比，16、32 μL/mL XBJ组MRSA分泌的RNIII mRNA表达量降低（P<0.01）；4~32 μL/mL XBJ干预下agrA mRNA的相对表达量降低（P<0.001）；8~32 μL/mL XBJ干预下Hla mRNA的相对表达量降低（P<0.05，图4A）。Western blotting结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肺组织Hla蛋白表达水平升高（P<0.001）；与模型组比较，XBJ组、LZD组、XBJ+LZD低剂量组、XBJ+LZD高剂量组小鼠肺组织Hla蛋白表达水平均下降（P<0.001，图4B、C）。

2.2.4 LZD联用XBJ抑制MRSA肺炎小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达

免疫组化结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织切片经NLRP3、ASC、Caspase-1抗体分别染色后，阳性面积均明显增加，IOD升高（P<0.01）。与模型组比，XBJ单药组降低MRSA肺炎小鼠肺组织的NLRP3和Caspase-1 IOD水平（P<0.01），LZD单药组、XBJ+LZD低剂量组和XBJ+LZD高剂量组NLRP3、Caspase-1和ASC的IOD均降低（P<0.05），且两药联用抑制NLRP3相关蛋白表达水平明显优于单药组（图5）。

2.2.5 LZD联用XBJ抑制MRSA肺炎小鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达及mRNA表达

Western blotting结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表达水平均升高（P<0.01）。与模型组比，XBJ单药组降低了NLRP3蛋白的表达水平（P<0.05），LZD单药组NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表达水平的抑制作用无统计学意义，XBJ+LZD高剂量组可以降低MRSA肺炎小鼠肺组织的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达（P<0.05，图6A、B）。qPCR结果显示，与对照组比较，模型组NLRP3炎症小体通路蛋白NLRP3、Caspase-1和ASC mRNA表达水平升高（P<0.05）。与模型组比，各给药组降低MRSA肺炎小鼠肺组织的ASC mRNA和Caspase-1 mRNA的表达水平（P<0.05），XBJ联合LZD低、高剂量组降低NLRP3 mRNA水平（P<0.05，图6C）。

2.2.6 LZD联用XBJ抑制MRSA肺炎小鼠肺组织IL-1β和IL-18分泌

与对照组相比，模型组小鼠肺匀浆炎症细胞因子IL-1β和IL-18含量均升高（P<0.001），与模型组比较，XBJ+LZD高剂量组小鼠肺匀浆内L-1β量均下降（P<0.05），XBJ组、LZD组、XBJ+LZD低、高剂量组小鼠肺匀浆IL-18含量下降（P<0.01，图7）。进一步验证了LZD联用XBJ对Hla-NLRP3炎症小体通路及下游炎症因子的调控作用（图8）。

3 讨论

近年来，MRSA肺炎的治疗面临着巨大的挑战。XBJ作为中药现代化制剂的代表，具有“菌、毒、炎”并治的特点^［7］。LZD则通过抑制细菌蛋白质合成，发挥抗菌作用^{［16， 17］}。本研究结果表明，LZD联用XBJ可改善MRSA肺炎小鼠肺组织损伤，降低肺组织中炎症因子，并发现两药联用可能通过抑制MRSA Hla诱导的NLRP3炎症小体的激活来实现协同保护作用。

本研究参考李建生教授团队建立的经气道介入模型^［18］，选择经口气管插管法，气管滴注30 μL浓度为1×10¹⁰ CFU/mL的MRSA菌液制备肺炎小鼠模型，并给予XBJ和LZD进行干预。结果发现，模型组小鼠死亡率高于对照组，XBJ或LZD单药治疗仅部分延缓小鼠肺炎进展，而两药联用（尤其高剂量组）治疗则显著提升MRSA肺炎小鼠存活率并延长生存时间，表明两药联用具有剂量依赖性的协同保护作用。此外，MRSA肺炎小鼠肺组织肺泡壁排列紊乱、断裂、增厚，肺泡腔充斥炎性渗出现象，且肺组织中炎症因子IL-6及TNF-α均显著升高。XBJ与LZD联用干预后可显著改善肺部病理损伤，降低IL-6及TNF-α水平，减轻MRSA诱导的肺部炎症反应，且改善效果优于单药组。这些结果进一步证明了LZD与XBJ联用对MRSA肺炎小鼠的协同保护作用。

抗毒力治疗主要通过削弱病原菌毒力而不抑制病原菌生长^［19］，Hla是金葡菌毒力因子中公认致病力最强的一种^［20］，也是众多抗毒力新药开发策略中的热门毒力靶标。Hla作为由金葡菌Hla基因编码的能形成β桶形孔道的胞外毒素，是金葡菌在各种动物感染模型中的重要毒力因子，包括皮肤和软组织感染、肺炎和菌血症^{［21， 22］}。研究表明，Hla对兔红细胞具有高度溶血能力，对人类健康构成严重威胁^［23］。它不仅能破坏人体免疫系统，降低免疫力，引发感染，还能诱导细胞自噬和炎症反应^［22］。本研究体外实验发现，XBJ虽对临床分离的MRSA无抑制作用，却能抑制其溶血活性。所以合理推测XBJ可能通过抑制MRSA毒力因子Hla发挥协同作用。Hla的表达受群体感应系统特别是Agr系统的调控，当agrA达到一定浓度时，它会与P3启动子结合，进而影响RNAIII转录因子的活性，从而启动包括Hla和PVL在内的多种毒力因子的表达^［24］。与已有研究聚焦于直接靶向Hla蛋白本身或其孔道形成能力的抑制剂不同^［25］，本研究进一步评估了XBJ对Hla以及相关调控基因agrA和RNAIII基因的转录水平影响。结果显示，XBJ以剂量依赖的方式抑制Hla、agrA和RNAIII的转录水平。这提示，XBJ可能通过干扰Agr群体感应系统的上游调控（如agrA、RNAIII的表达）来间接抑制Hla的表达，其作用机制不同于多数直接作用的Hla抑制剂^［25］。LZD主要通过抑制细菌蛋白质合成发挥抗菌作用，XBJ与LZD的作用机制可能存在差异。因此，我们推测XBJ与LZD是通过抑制毒力和直接杀菌这两种不同的策略来发挥协同治疗作用。

Hla作为MRSA的主要毒力因子之一，能在红细胞、肺泡上皮细胞等多种靶细胞膜上形成七聚体跨膜孔，导致细胞内K⁺外流和活性氧产生，可激活NLRP3炎症小体^{［26， 27］}。过度激活的NLRP3炎症小体切割IL-1β和IL-18前体，释放成熟促炎细胞因子，引发过度炎症，进而产生细胞焦亡^［28］，过度细胞焦亡致大量细胞死亡，释放更多炎症介质，加重炎症与组织损伤，可能是治疗金葡菌肺炎的重要靶标途径^{［29， 30］}。本研究体内实验证实，MRSA肺炎小鼠的肺组织中NLRP3/ASC/Caspase-1通路被Hla激活，关键蛋白（Hla、NLRP3、ASC、Caspase-1）及下游细胞因子（IL-1β、IL-18）表达水平与mRNA水平均升高。LZD联用XBJ干预不仅降低了MRSA小鼠肺组织Hla、NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表达及mRNA水平，MRSA小鼠肺匀浆的IL-1β和IL-18水平也降低，且XBJ联用LZD高剂量组抑制效果优于XBJ和LZD单药组。这表明联用策略有效阻断了Hla-NLRP3炎症轴。与单纯依赖抗生素杀菌^［31］、单纯使用抗毒力药物（如Hla抑制剂^［32］）或单纯应用抗炎药物相比，LZD联用XBJ策略展现出独特的协同增效优势：LZD其抗炎效果主要源于直接抗菌作用，减少细菌负荷和Hla产生；而XBJ在无直接抑菌活性的情况下，通过在源头抑制残留或潜在耐药菌株的关键毒力因子Hla的产生，进而阻断Hla诱导的NLRP3炎症通路的过度激活。

综上所述，本研究通过体内、体外实验共同验证了LZD联用XBJ在肺炎治疗中发挥协同保护作用的可能机制，明确LZD联用XBJ可抑制MRSA Hla引起的NLRP3炎症小体激活及下游促炎细胞因子释放，减轻MRSA肺炎的过度炎症反应，从而发挥对MRSA肺炎小鼠的协同保护作用。

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