基于“抗氧化-炎症-色素沉着轴”优化白芍的提取工艺与美白功效评价

Optimized extraction of active components of Paeonia lactiflora and their antioxidant, anti-inflammatory and pigmentation-reducing effects for skin whitening

摘要

目的 优化白芍提取工艺，建立白芍提取物（BST）多指标含量检测方法，并初步探讨其对小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）的酪氨酸酶（TYR）活性抑制作用和对人永生化表皮细胞（HaCaT）中ROS水平的降低作用，并对BST对体内小鼠模型治疗效果进行评估。 方法 以分子对接手段确定潜在TYR抑制剂成分为没食子酸、甘草苷及芍药苷；采用高效液相色谱法（HPLC）建立BST液相图谱，测定3种潜在TYR抑制剂的含量，并进行方法学验证；通过熵权法计算3种潜在TYR抑制剂的含量、TYR抑制活性及DPPH及自由基清除能力的综合评分作为响应值，采用单因素结合响应面分析法考察溶剂配比、液料比、提取时间以及粉碎目数等因素对BST提取工艺的影响，以确定最优提取工艺；通过设置黑色素-酪氨酸酶B16F10细胞实验空白组（正常培养）、模型组（α-MSH处理）、给药组（α-MSH +BST）、Hacat细胞体外抗氧化活性试验空白组［正常培养，模型组双氧水（H₂O₂）处理）、给药组（H₂O₂+BST处理）以验证作用机制。通过UVB辐射暴露系统建立小鼠黑色素瘤模型，BST（100、150、200 mg/kg）给予0.2 mL的混悬液灌胃，结合观察实验动物背部皮肤状态、Fontana-Masson银染色结果以及检测血清样本中参与调控黑色素生成、转运或代谢及抗炎相关细胞因子水平指标综合评估BST体内美白作用效果。 结果 分子对接结果显示BST中潜在TYR抑制剂与TYR蛋白结构的残基存在相互作用关系，建立了BST潜在TYR抑制剂的HPLC含量测定方法，方法学验证表明该方法稳定可行；单因素-响应面实验表明BST最优提取工艺为提取溶剂50%乙醇，液料比1∶15，提取时间1h，粉碎目数20目；BST对DPPH自由基以及羟自由基具有直接清除作用，能显著减少细胞中黑色素的形成并提高B16细胞内TYR蛋白的相对含量并降低HaCat细胞中ROS水平，并在体内通过抑制TYR与TNF-α （P<0.01）直接抑制黑色素合成关键酶与间接抗炎的双重美白机制，双向调节色素代谢，有效逆转UVB诱导的皮肤光老化及色素沉着。 结论 基于单因素响应面法优化的BST提取工艺稳定可靠、预测性良好，药理分析研究表明BST的美白作用可能是通过抑制TYR活性和调节氧化应激和炎症通路的双向调节机制而实现的。

Abstract

Objective To optimize the extraction process of the active components of Radix Paeoniae Alba and assess the antioxidant, anti-inflammatory and pigmentation-reducing effects of Radix Paeoniae Alba extract (BST). Methods Molecular docking identified gallic acid, liquiritin, and paeoniflorin as potential tyrosinase inhibitors, and their contents in BST were determined with high-performance liquid chromatography (HPLC). Based on the contents of the 3 inhibitors, their tyrosinase-inhibiting activity, and DPPH radical scavenging capacity calculated using entropy weight method, the extraction conditions were optimized for solvent ratio, liquid-to-solid ratio, extraction time, and particle size. The inhibitory effects of BST on tyrosinase activity and melanin were assessed in α‑MSH-treated B16F10 cells, and its effect on reactive oxygen species (ROS) production was evaluated in H₂O₂-treated HaCaT cells. In a mouse model of melanogenesis induced by UVB radiation, the effect of BST gavage (100, 150, and 200 mg/kg) were evaluated by assessing skin conditions of the mice, Fontana-Masson staining, and detecting serum levels of cytokines related to melanogenesis, melanosome transport, metabolism, and inflammation. Results The optimized parameters for BST extraction included 50% ethanol, liquid-to-solid ratio of 15:1, extraction time of 1 h, and 20-mesh particle size. BST exhibited strong free radical-scavenging activity and significantly reduced melanogenesis and increased tyrosinase protein in B16 cells, and lowered ROS production in HaCaT cells. In the mouse models of melanogenesis, BST significantly suppressed the melanogenic enzymes and inflammatory responses by reducing the levels of tyrosinase and TNF-α, thereby effectively reversed UVB-induced photoaging and hyperpigmentation. Conclusion The optimized BST extraction process is stable and predictable. BST shows good skin-whitening effect, which is mediated possibly by inhibiting tyrosinase activity and modulating oxidative stress and inflammatory pathways.

Graphical abstract

关键词

白芍提取物 / 单因素-响应面法 / B16细胞 / Hacat细胞 / 抗氧化 / 美白

Key words

white peony extract / univariate-response surface method / B16 cells / Hacat cells / antioxidant effect / skin whitening

中药及中药复方在护肤领域的应用历史悠久，为中药养颜提供了药物选择、用药配伍等方面的基础支持^［1］。白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，始载于《神农本草经》，主要成分包括单萜及其苷类、三萜及其苷类、黄酮类、鞣质类等^［2］。其中鞣酸类成分没食子酸具有良好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒并可改善糖尿病症状等^［3］；甘草苷作为其中的重要的单体活性成分，具有保护心脏系统、抗氧化和抗炎等多种药理作用^［4］；芍药苷为白芍的主要药效物质基础，现代药理研究显示具有抗氧化、保肝、抗炎、抗纤维化、免疫调节、保护心肌细胞等功效^［5］。

酪氨酸酶是黑色素合成过程中的关键酶，其活性的降低可以有效减少黑色素的生成，从而达到美白的效果^［6］。氧化应激不仅会增加酪氨酸酶的活性，从而促进黑色素的生成^［7］，且自由基积累会破坏皮肤细胞的正常功能，干扰黑色素的正常分解，使其沉积^［8］。因此，酪氨酸酶和自由基的抑制率是评价美白活性的关键指标^［9］。

白芍已被研究证明具有潜在的美白、滋补养颜等功效，尤其在护肤产品中的应用逐渐增多^［10］。其粗提物对酪氨酸酶具有较好的抑制作用^［11］，可清除自由基，减少氧化应激对皮肤细胞的损伤^［12］，并减少炎症反应，防止炎症后色素沉着^［13］。然而，白芍有效成分的活性因提取方法不同而有所差异，以往研究主要集中在提取含量上，而部分忽略了提取工艺对活性的影响^［14］。

本研究阐述白芍提取方法及工艺优化，并通过分子对接手段构建了BST通过抑制TYR发挥美白功能的分子调控机制，确定了没食子酸、甘草苷及芍药苷为稳定结合TYR的化合物，作为潜在的TYR抑制剂。以单因素试验结合响应面法，将3种潜在的TYR抑制剂含量以及TYR抑制活性、DPPH自由基清除能力作为指标优化白芍的提取工艺，结合体外抗氧化实验、细胞实验和体内动物实验，挖掘并验证其美白、抗氧化、抗炎等多种适用于安全、有效应用于美白类中药产品的功效，以期为其在化妆品中的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器

LC-2010A HT高效液相色谱仪（中国岛津企业管理）；酶标仪 （tecan austria gmbh）；AB265 S十万分之一分析天平（METTLER TOLEDO）；电子天平（奥豪斯仪器）；KQ 250B型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器）；HH6数显恒温水浴锅（江苏金坛市佳美仪器）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器）；DZTW电子调温电热套（北京市光明医疗仪器）。

1.1.2 试药与试剂

甘草苷标准品（批号：111610-201607）、芍药苷标准品（批号：B21148）及没食子酸标准品（批号：B20851）（上海源叶生物科技，纯度均≥98%）；色谱级甲醇及色谱级乙腈（Fisher Chemical）；TYR（批号：9002-10-2，百克赛斯生物科技）；DPPH试剂（批号：1898-66-4）、抗坏血酸试剂（批号：50-81-7）（北京索莱宝）；色谱级磷酸（Macklin）；娃哈哈矿泉水。

1.2 实验方法

1.2.1 中药白芍的活性成分和作用机制信息

1.2.1.1　样品处理

将购买的白芍药材进行彻底清洗后，于烘箱50 ℃下烘干处理，粉碎，过100目筛，装自封袋备用。

1.2.1.2　白芍提取物中药质量标志物（Q-Marker）的确立

根据《中国药典》2020年版中白芍饮片所含可测性指标成分，结合肖垚垚等^［15］的研究基础，选择BST中没食子酸、甘草苷及芍药苷可作为其具有美白活性的Q-Marker用于提高工艺稳健性和产品质量可控性^［16］。

1.2.1.3　TYR与Q-Marker的分子对接验证

从 PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库中下载TYR晶体结构，同时在TCMSP数据库中获得化合物结构的mol2格式，使用 AutoDock Tools 1.5.6软件对蛋白及小分子进行去水加氢等预处理，保存为 PDBQT格式。利用AutoDock Vina 1.1.2对配体小分子与受体蛋白进行分子对接，对接次数为9次，得到TYR蛋白和小分子化合物的结合能，将得到的结果中每个化合物结合能最小的一种构像，再使用PyMOL 2.5.1软件对实验结果进行作图、分析。

1.2.2 高效液相色谱法定量方法建立

1.2.2.1　色谱条件

采用纳谱分析大连江申 Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序为：具体梯度洗脱程序为：0~5 min：95%→85% A （5%→15% B）；40~50 min：75%→65% A （25%→35% B）；60 min：95% A （5% B），流速为1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长230 nm；柱温为35 ℃，理论塔板数不低于6000。

1.2.2.2　对照品及供试品溶液的制备

参照2020版《中国药典》白芍项下对照品溶液制备对照品溶液^［17］。

参照2020版《中国药典》白芍项下供试品溶液制备BST溶液^［17］。

1.2.2.3　方法学考察

分别配制没食子酸（240.0 μg/mL）、芍药苷（240.0 μg/mL）及甘草苷（80.0 μg/mL），分别用甲醇将其稀释成对照品溶液的10%、50%、80%、100%、150%倍质量浓度，以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），分别绘制标准曲线得到回归方程。

配制混合对照品溶液，连续进样6次，进行精密度实验；配制供试品溶液，取6份分别在0、2、4、6、8、10、12、24、48 h进样分析，进行稳定性实验；另取6份，连续进样进行重复性实验；另取6份在其中加入适量对照品，进样分析进行加样回收率实验。上述实验均按照“1.2.2.1”项下色谱条件下测定。

1.2.3 单因素实验

以白芍药材为对象，采取控制单一变量法，依次考察溶剂配比：水，40%、50%、60%、70%、80%乙醇；液料比：5、10、15、20、25；提取时间：0.5、1、1.5、2 h；粉碎目数：全片、20目、40目、60目，以没食子酸、甘草苷及芍药苷的含量及TYR抑制活性、DPPH自由基清除能力为指标，通过熵权法计算各成分的权重系数，并计算综合评分。

1.2.4 响应面实验优化

熵权法是一种客观赋权方法，根据各指标数据的分散程度，利用信息熵计算出各指标的熵权，通过修正得到较为客观的指标权重^［18］。权重系数=该成分含量的均值/各化合物含量的均值之和，综合评分即为各化合物权重系数与各化合物含量的乘积^［19］。通过熵权法确定各指标性成分权重，其权重越高，在综合评价中所起作用也越大^［20］。

BST指标性成分的权重计算结果显示，在综合评价体系中，TYR抑制活性与DPPH自由基清除能力两项药效指标的权重均占25%，共同构成了评价标准。在3种被测成分中，没食子酸的含量最高，为19.332%，其次为芍药苷和甘草苷，含量分别为15.467%和15.201%。

权重计算结果确立选用没食子酸含量（Y₁）、甘草苷含量（Y₂）、芍药苷（Y₃）及TYR抑制活性（Y₄）、DPPH自由基清除能力（Y₅）为评价指标，综合评分=（Q₁Y₁/Y_{1 max}+ Q₂Y₂/Y_{2 max}+Q₃Y₃/Y_{3 max}+Q₄Y₄/Y_{4 max}+Q₅Y₅/Y_{5 max}+Q₆Y₆/Y_{6 max}）/100。

1.2.5 响应面实验优化分析

依据单因素试验结果与响应面实验设计原理，以指标性成分含量及TYR抑制活性、DPPH自由基清除能力的综合评分作为评价指标，选择溶剂配比（A）、液料比（B）、提取时间（C）、粉碎目数（D）4个因素进行响应面优化设计，以综合评分为响应值，采用四因素三水平的响应面设计法进行分析。实验数据以Design-Expert 13软件进行方差处理。模型的确定系数接近1，该方程与实际情况拟合很好^［21］，较好地反映了综合评分与溶剂配比、液料比、提取时间和粉碎目数的关系，因此，所得的回归方程能较好的预测综合评分随各参数的变化规律^［22］

1.2.6 验证实验

按照最优工艺条件进行3次验证实验，并进行含量测定。

1.2.7 BST的制备

分别称取白芍药材，粉碎后过20目筛，加入10倍量50%乙醇回流提取两次，1 h/次，合并提取液，浓缩干燥，得白芍最优工艺法提取物。

1.2.8 TYR抑制率测定

将BST用磷酸（PBS）缓冲溶液配制成适宜浓度的溶液。在离心管中依次加入0.5 mL待测溶液、0.5 mL PBS 缓冲液（pH=6.80）、0.5 mL 0.05 mg/mL（25 U/mL）TYR溶液以及0.5 mL 0.5 mg/mL L-酪氨酸，TYR催化反应体系见表1。37 ℃水浴30 min后，迅速将各管反应溶液移入96孔板中。以曲酸为阳性对照，以PBS为空白对照，并测量吸光度A_{475 nm}。

TYR抑制率（%）=[(C-C_{\mathrm{0}})-(T-T_{\mathrm{0}})]/(C-C_{\mathrm{0}})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

其中，C₀：PBS缓冲溶液代替样品溶液和L-酪氨酸溶液的吸光度，C：以PBS缓冲溶液代替样品溶液的吸光度，T₀：以PBS缓冲溶液代替L-酪氨酸溶液的吸光度，T：样品溶液的吸光度。

1.2.9 体外抗氧化实验

1.2.9.1　白芍提取物DPPH自由基清除能力

取96孔板，每孔加入100 μL不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）供试品样品甲醇溶液，100 μL DPPH（0. 04 mg/mL）溶液，每个样品平行3次实验，于暗室反应30 min，在517 nm处测定吸光度值A₁；以100 μL甲醇代替DPPH溶液作为样品对照组，测定吸光度值A₂；以100 μL甲醇代替样品液作为空白对照组，测定吸光度值A₀，以VC作为对照实验。按下式计算DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率（%）=(A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{1}}+A_{\mathrm{2}})/A_{\mathrm{0}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.9.2　白芍提取物羟自由基清除能力测定

采用水杨酸法测定对·OH的作用。取96孔板，每孔依次加入50 μL不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）供试品样品甲醇溶液、50 μL FeSO₄（6 mmol/L）溶液、50 μL H₂O₂（6 mmol/L）溶液，于37℃保温10 min后加入50μL水杨酸（6 mmol/L）溶液，每个样品平行3次实验，37℃保温30 min后于510 nm处测定吸光度值A₁。以50 μL蒸馏水代替样品液，按照上述流程测定吸光度值A₀；以50 μL蒸馏水代替H₂O₂溶液，测定吸光度值A₂；以VC作为对照实验。按下式计算·OH自由基的清除率：

·OH（%）=(A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{1}}+A_{\mathrm{2}})/A_{\mathrm{0}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.10 B16F10细胞实验

1.2.10.1　细胞培养与分组

小鼠黑色素瘤B16F10细胞， 培养于含体积分数为10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养液中， 置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养至对数生长期，用含EDTA的胰酶消化传代培养。实验分为不做处理的空白组、α-促黑激素（α-MSH）处理组、BST用3‰DMSO溶解作为储备溶液，使用DMEM培养液稀释为30、40、50 μg/mL为低、中、高组。

1.2.10.2　B16F10细胞黑色素-酪氨酸酶荧光染色分析

以1.2.10.1中模型组条件充分诱导酪氨酸酶表达，选用50 μg/mL BST进行治疗并不做处理的空白组作为阴性对照。按照抗体说明书进行染色实验。在洗涤和孵育过程中，应确保细胞始终被液体覆盖，避免干燥，染色结束后应尽快观察，以获得最佳荧光效果。实验结束后使用Cy3/DsRed通道（激发光波长~550 nm，发射光波长~570 nm）观察酪氨酸酶显示为红色。

1.2.10.3　细胞TYR活性测定

取对数生长期B16 F10细胞，以1×10⁴/孔接种于24孔培养板上，过夜贴壁，每孔更换含100 nmol/L α-MSH的培养液，与细胞共同孵育48 h后吸弃培养液，并以不同浓度BST处理48 h，每个浓度3个复孔。在施用时间之后，用PBS （pH 1/4 7.2）洗涤细胞2次，收集各组细胞，离心后弃上清，细胞沉淀与含有600 μL 1%Triton X-100的PBS混合，-80 ℃冷冻后解冻，以13000 r/min离心30 min裂解细胞，取上清液100 μL加入到96孔板中，并与100 μL 1 mg/mL 左旋多巴（L-DOPA）溶液混合，37 ℃下孵育2h，立即测定吸光度A_{475 nm}。

1.2.10.4 细胞黑色素含量测定

取对数生长的B16 F10细胞，以1×10⁴/孔接种于24孔培养板上，过夜贴壁。每孔更换含100 nmol/L α-MSH的培养液，与细胞共同孵育48 h后吸弃培养液，并以不同浓度BST处理48 h，每个浓度3个复孔。施用时间后，PBS （pH 1/4 7.2）洗涤细胞2次，收集各组细胞，离心后弃上清，细胞沉淀与含有600 μL 1%Triton X-100的PBS混合，-80 ℃冷冻后解冻，以13000 r/min离心30 min裂解细胞，除去上清液，并将含有10%二甲基亚砜（DMSO）的1 mol/L NaOH（600 μL）加入细胞颗粒中。然后在80 ℃下反应2 h，使细胞中的黑色素充分裂解，测定吸光度A_{405 nm}。

1.2.11 HaCaT细胞实验

1.2.11.1　细胞培养

人永生化表皮细胞HaCaT细胞， 培养于含体积分数为10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养液中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养至对数生长期，用含EDTA的胰酶消化传代培养。实验分为不做处理的空白组、双氧水（H₂O₂）处理组、BST用3‰DMSO溶解作为储备溶液，使用DMEM培养液稀释为5、10和20 μg/mL为低、中、高组。

1.2.11.2　HaCaT细胞中ROS水平的测定

选取对数生长期的HaCaT细胞接种于6孔板内，2.5×10⁵/孔，过夜贴壁培养，600 mmol/L H₂O₂造模并分组处理后，每孔加入终浓度10 μmol/L的DCFH-DA荧光探针，37 ℃避光反应20 min后吸去探针，用预冷的PBS洗涤细胞，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，荧光倒置显微镜下于488 nm激发波长、525 nm发射波长记录细胞中ROS荧光水平。

1.2.12 体内动物实验实验

1.2.12.1　实验动物培养及分组

6周龄雄性C57BL/6小鼠购自辽宁长胜生物科技公司，饲养于温湿度适宜、12 h光暗周期环境中，自由摄食饮水，适应1周后随机分4组（8只/组），实验遵循长春中医药大学动物实验指南（伦理批号：KNU-2021-0025）。采用含BST（100、150、200 mg/Kg）和熊果苷（300 mg/kg）作为阳性对照组给予0.2 mL的混悬液灌胃。实验前，先对小鼠背部3 cm×3 cm区域脱毛，预处理3 d（治疗组以不同浓度BST及熊果苷混悬液灌胃，空白对照组和模型对照组以相同剂量0.9%生理盐水灌胃，1次/d）。第4~30天，2 d/次给药30 min后在UVB暴露室接受313 nm、590 μW/cm²辐射40 min。于第31天安乐死小鼠，并取背部皮肤及相关组织进行指标性实验测定。

1.2.12.2　实验动物背部皮肤状态

为系统评价BST药剂的治疗作用，将实验动物随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照药熊果苷组及BST低、中、高剂量组，8只/组。通过标准化宏观评分系统评估皮肤状态，包括：红斑、水肿、粗糙度及皱纹形成及黑色素沉积情况程度。实验终点取背部皮肤组织，经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后制备切片，结合Fontana-Masson银染色，定量分析黑色素沉积情况并测量表皮厚度及观察组织病理学改变。

1.2.12.3　Fontana-Masson银染色

该方法的原理基于黑色素的还原性，在碱性条件下，氨银溶液中的二氨银络离子［Ag（NH3）2Ag（NH3​）2​⁺］被黑色素还原成金属银颗粒。这些不溶性的黑色金属银颗粒沉积在黑色素所在的位置，从而使黑色素呈现黑色或黑褐色。小鼠皮肤背部组织经Fontana-Masson银染色严格依照经典组织化学流程进行，旨在特异性显示组织切片中的黑色素。石蜡切片经脱蜡至水后，使用临用前现配的氨银溶液（由5%硝酸银与浓氨水反应生成）于暗处浸染30~60 min。随后，切片经蒸馏水冲洗，并转入5%硫代硫酸钠溶液定影1~2 min以去除未反应的银盐。为提供细胞结构对比，采用核固红染液进行复染，使细胞核呈红色。最后，切片经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，并以中性树胶封固于显微镜下观察。

1.2.12.4　ELISA检测

治疗后第31天通过眼球取血法采集血液样本。离心处理后，测定血清中皮肤细样本中，参与调控黑色素生成、转运或代谢及抗炎相关细胞因子水平指标，包括TNF-α和Tyr。

1.3 统计学分析

所有定量数据以均数±标准差表示（n≥3）。RSM优化采用Design-Expert软件（第13版）进行分析。体内小鼠模型数据的统计学显著性，通过单因素方差分析（ANOVA）结合检验与模型对照组进行比较确定。所有统计分析均采用GraphPad Prism软件（版本9.5.1）完成。当P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分子对接实验结果

利用分子对接手段将TYR蛋白与受体化合物结合（表2），甘草苷、芍药苷及甘草苷配体小分子与TYR蛋白结构的残基存在较强的相互作用；化合物没食子酸对TYR蛋白结构的残基存在较弱的相互作用（图1）。

2.2 方法学考察结果

分别绘制没食子酸、甘草苷及芍药苷标准曲线得到线性回归方程，根据所得线性相关系数（R²），精密度、48 h稳定性、重复性和加样回收率的RSD值，表明3个Q-Marker在所选浓度范围内呈线性关系，供试品溶液能够在48 h内稳定，并且实验用仪器精密度良好，该含量分析方法准确可靠（表3）。

2.3 3个Q-Marker的液相图谱分析

BST液相结果（图2-A）显示，3个Q-Marker 没食子酸、芍药苷及甘草苷在此条件中均能达到良好的分离，分离度均大于1.5，并与单一对照品色谱峰（图2-B没食子酸、图2-C芍药苷、图2-D甘草苷）对应，可以有效地对目标提取物进行甄别，能够准确地进行含量检测。

2.4 单因素实验结果

5个指标性的综合评分受4个因素的影响较为明显。综合评分随着4个因素的变化先升高后降低，分别于乙醇分数50%、液料比1∶15、提取时间为1 h粉碎目数为20目时达到最大值（图3）。

2.5 响应面实验优化分析结果

2.5.1 Box-Benhnke试验设计与结果

结合单因素实验结果，选择溶剂配比为40%、50%、60% 3个水平、液料比为10、15、20三个水平、提取时间0.5、1、1.5 h 3个水平、粉碎目数全片、20目、40目3个水平进行响应面优化设计。因素水平表见表4，响应面设计方案及结果见表5。

将所得实验数据进行多元回归拟合，得到二元多项回归方程为：Y=100-4.57×A-9.88×B-26.53×C+3.26D+0.7×AB+2.13×AC+2.42×AD+3.4BC+2.55×BD-0.6×CD-17.24×A2-20.44×B2-38.93×C2-32.7D2，为了检验方程的有效性，对综合评分的数学模型进行了方差分析，由表可知，当综合评分为响应值时，该二次方程模型极显著（F=55.26，P<0.0001）。

由响应面方差分析可知，方程一次项A、B、C，方程二次项A2、B2、C2、D2对综合评分的影响达到极显著水平（P<0.01）；方程一次项D对综合评分的影响达到显著水平（P<0.05），根据F值可知，各因素对综合评分影响的大小顺序为：提取时间（C）>液料比（B）>溶剂配比（A）>粉碎目数（D）。综合以上各参数表明该实验方法可靠，各因素水平间设计合理，因此可用该回归模型代替实验真实地对结果进行分析。

2.5.2 响应曲面分析

响应面3D图走势越陡峭，等高线形状越接近椭圆，则两因素交互作用影响越显著^［20］。由图4可知，AB、AC、AD、BC、BD、CD交互作用在感官评分响应面3D图上均存在极大值，AC、BC、CD间交互作用的响应面3D图坡度趋势相对于其余因素更为陡峭，说明因素C曲面较陡峭，提示它对响应值有显著影响，其次是B、A、D，与方差分析结果一致。

2.6 验证实验

在上述响应面模型分析的基础上，对得到的二次回归方程求解，预测最优工艺条件为提取溶剂配比（A）48.625%，液料比（B）15.332，提取时间（C）0.986 h、粉碎目数19.688目。为方便实际操作，将验证条件修正为溶剂配比50%，液料比1：15，提取时间1 h，粉碎目数20目。按响应面优化的提取工艺重复3次实验，RSD为2.0%，表明提取工艺稳定可行。

2.7 TYR抑制活性测定

选用目前常用的具有较强TYR抑制活性的曲酸作为阳性对照，TYR抑制活性测定结果如图5所示。结果表明在浓度为8 mg/mL 的最优工艺提取法所得BST样品溶液对TYR双酚酶活性产生了明显的抑制作用，随样品质量浓度的增加，抑制作用显著增强，在浓度为14 mg/mL时达到了峰值，此时抑制率已达90.88%），证实其具有强效的TYR抑制能力。

2.8 体外抗氧化活性试验药效学结果

2.8.1 BST的DPPH自由基清除能力测定

在质量浓度0.2~1.0 mg/mL范围内，VC标准品对DPPH自由基的清除能力随浓度增加缓慢增加，质量浓度为1.2 mg/mL时，清除率最大可达到96.32%，为相同浓度VC相应数值的100.18%（图6A）。

2.8.2 BST羟自由基清除能力测定

在0.2~1.2 mg/mL剂量范围内，BST清除羟自由基的能力呈剂量依赖关系。由结果可知，BST质量浓度为0.2 mg/mL时清除率仅37.89%，当浓度为1.2 mg/mL时接近90.04%，为相同浓度VC相应数值的93.00%，与VC组比较无显著差异，显示出了较好的羟自由基清除活性（图6B）。

2.9 B16 F10体外细胞实验结果

2.9.1 B16 F10细胞生长状态观察

与模型组比较，BST组作用48 h后细胞黑色素明显减少（图7）。

2.9.2 B16 F10细胞黑色素-酪氨酸酶荧光染色结果

对照组细胞质内可见微弱的红色荧光或无特异性荧光。α-MSH实验组细胞质内可见强烈的红色颗粒状或弥散状荧光信号，这些信号通常位于黑色素小体所在的区域，证明了α-MSH成功激活了其下游信号通路，上调了酪氨酸酶的表达水平。与α-MSH模型组相比，共培养测试50 μg/mL BST后，红色荧光强度的显著降低（图8）。

2.9.3 BST对细胞TYR抑制活性测定

与空白组比较，随着BST最优工艺提取法所得提取物质量浓度上升，黑色素细胞活力明显降低，酪氨酸酶活性抑制率逐渐升高，呈现良好的剂量依赖性，且优于BST水煎法提取物作用效果（P<0.01，图9A）。

2.9.4 BST对细胞黑色素含量抑制能力测定

BST的细胞黑色素含量抑制能力测定结果趋势与TYR抑制活性相同，BST最优工艺提取法所得提取物在相同质量浓度时相较于BST水煎法提取物对降低黑色素细胞的细胞活力作用更大（P<0.01，图9B）。

2.10 HaCat细胞实验结果

2.10.1 HaCaT细胞中ROS水平分析

和空白组比较，模型组HaCat 细胞中ROS水平增加；和模型组比较，随着BST剂量增加，HaCat细胞中ROS水平逐渐降低（图10）。

2.11 体内动物实验结果

2.11.1 实验动物背部皮肤状态

经特定剂量与周期的中波紫外线（UVB）暴露室标准化造模构建的实验动物皮肤光损伤模型后，实验动物背部靶区皮肤可呈现出一系列急性和/或慢性损伤的典型病理学改变。 靶区皮肤可出现明显的红斑与水肿，皮肤表现为显著的炎症反应包括增厚与粗糙，表面可见明显的皱纹失去正常光泽与弹性，并形成黑色素沉积。与模型对照组相比，阳性药熊果苷组与BST中、高剂量治疗组均表现出显著的皮肤状况改善，特别是高剂量组，能够有效改善UVB诱导的皮肤宏观损伤，逆转表皮异常增生，并显著促进真皮胶原的合成与沉积，恢复皮肤结构，皮肤粗糙度显著降低，弹性显著恢复，接近正常对照组水平。治疗效果呈现出明确的剂量依赖性，高剂量组在多数指标上显示出优于低剂量组的疗效，且其疗效与阳性对照药熊果苷相当或在某些方面更优（图11）。

2.11.2 Fontana-Masson银染色分析

与正常皮肤组织相比，模型组动物真皮层蓝色的胶原纤维染色区域变薄、着色变浅且结构松散， 真皮浅层及血管周围可见以淋巴细胞、组织细胞为主，偶见中性粒细胞的混合性炎性细胞浸润，伴随棘层肥厚、角化不全、炎性细胞浸润血管扩张与充血以及胶原降解，直观地证实了UVB诱导的细胞外基质重塑。而黑色素则表现为表皮内沉积和真皮内沉积以色素失禁表现的黑色素颗粒从受损的基底细胞或黑色素细胞中脱落，被真皮浅层的巨噬细胞所吞噬。这些充满黑色素的巨噬细胞被称为噬黑色素细胞，在Masson染色中可见其胞浆内充满粗大的棕黑色颗粒。

阳性药熊果苷组显示出明显的胶原再生，BST治疗组治疗效果呈现剂量依赖性效应，随着给药剂量的增加，真皮层胶原纤维的密度和厚度均显著增加，纤维排列更为规整。表皮厚度显著减小，组织结构趋于正常化。与模型对照组相比，治疗组表皮内黑色素颗粒密度降低，真皮内噬黑色素细胞数量减少或消失（图12）。

2.11.3 ELISA检测结果

与模型组相比，样品能剂量依赖性地显著抑制细胞内TYR的蛋白表达，并有效降低炎症因子TNF-α的释放（P<0.01，图13）。

3 讨论

白芍因其显著的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的作用^［23］，已被广泛应用于美白产品中^［24］。其主要成分芍药苷具有多种药理作用，能够有效减少黑色素的生成，从而达到美白效果^［25］。这些研究为白芍在美白护肤产品中的应用提供了科学依据。

TYR是一种金属氧化还原酶，在生物体内可羟基化L-酪氨酸和3，4-二羟基苯丙氨酸为左旋多巴和多巴醌^［26］，进而于黑素体中合成、储存和运输黑色素^［27］。现代临床治疗经验证明，TYR 活性的调节是用于美白肤色、减轻色素沉着病症的最常用策略^［28］。常见的TYR抑制剂如来源于真菌的曲酸、人工合成的氢醌等，有效但具有细胞毒性大，皮肤炎症刺激较强等副作用^［29］。与之相比，在美白护肤方面，中药具有成分安全、作用温和、多成分、副作用小等优势^［30］。BST源于天然药物成分，其多通路协同作用的特点使其在较低浓度下即可实现高效美白，同时其温和的特性大大降低了致敏风险，尤其适用于敏感性肌肤和长期护理。然而白芍中具有美白疗效的有效成分受提取工艺影响显著，因此，建立以没食子酸、甘草苷及芍药苷3种潜在美白活性成分等标志性成分含量为核心的质量标准体系至关重要。

活性氧（ROS）型自由基和炎症等兼性色素沉着因素通过削弱修复机制加剧皮肤老化，导致色素沉着进而影响皮肤颜色变化^［31］。在高浓度下，ROS通过激活p53蛋白导致DNA损伤并触发黑色素形成^［32］。高效、安全、稳定的天然抗氧化剂能有效清除自由基，减缓皮肤衰老并减轻慢性损伤，对光老化、光癌变或色素沉着等症状起重要作用^［33］。

BST因其抗氧化特性，被广泛应用于美白和抗衰老化妆品中。夏颖等^［34］对BST及其有效成分进行抗氧化活性的研究，实验结果表明，与阳性对照Vc相比，白芍粗提物具有较强的抗氧化活性，且在一定的范围内，浓度越大抗氧化能力越强，其抗氧化作用与浓度呈量效关系。秦亚东等^［35］筛选白芍多糖抑制酪氨酸酶活性成分，首次从中分离得到PRPS40-1、PRPS60-1、PRPS60-2， 并对三者进行酪氨酸酶活性抑制试验，发现它们均体现出一定抑酶活性， 并且有明显协同作用。张建国等^［36］以白术和白芍为原料进行研究，制备了中药美白面膜，并验证了其美白功效，当面膜浓度为0.13 g/mL时，酪氨酸酶的清除率高达69.53%，具有抗紫外线、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性能力作用和美白效果。

因此，基于美白功效对BST药效关系的分析，本研究通过对没食子酸、甘草苷及芍药苷3种潜在美白活性成分以及TYR抑制活性、DPPH自由基清除能力为综合评分作为指标对BST美白提取物提取工艺进行分析，经过单因素和Box-Behnken响应面法得出美白提取物的最优提取工艺条件为：溶剂配比50%，液料比1∶15，提取时间1 h，粉碎目数20目。同时，在最优实验条件下验证，制得的BST含量稳定、均匀，响应面实验优选所得的提取工艺稳定可行，表明该工艺优化较大程度提高了BST中有效成分的得率，为BST中美白提取物的高效提取以及药效学研究提供了基础。结合分子对接手段探究美白作用机制，以体外抗氧化活性和细胞实验为验证，结合体内动物实验，综合药理学分析研究表面表明BST可通过抑制TYR活性和调节氧化应激和炎症多通路协同效应，达到抗氧化、抗炎从而达到美白的目的，为美白养颜的新药开发提供参考依据。

展望未来，白芍在皮肤美白领域的前景广阔。一方面，可以将其与其他天然美白成分进行科学复配，探索协同增效作用，开发出功效更全面的美白配方。另一方面，鉴于白芍在中医理论中兼具养血调经、柔肝止痛的功效，其在内调外养、通过改善机体内部环境（如肝郁血虚所致的面色萎黄）来实现整体美白的“妆药同源”理念，值得进行更深层次的跨学科研究。

参考文献

[1] 康 乐, 黎锦帮, 田 硕, 等. 中药养颜学的内涵与外延[J]. 时珍国医国药, 2024, 35(13): 3026-9.

[2] 鄢 贵, 龚普阳, 张复中, 等. 基于CiteSpace和VOSviewer的白芍研究现状及研究热点可视化分析[J]. 中草药, 2024, 55(11): 3805-15.

[3] 刁家鑫, 郑琪潼, 陈孟尧, 等. 白芍中鞣酸类成分的药理作用及作用机制[J]. 中国中药杂志, 2025, 50(6): 1471-83.

[4] 张 艳, 孙菡阳, 廖小婷, 等. 甘草苷调节丙酮酸激酶M2改善过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞功能障碍[J]. 微循环学杂志, 2024, 34(4): 19-23, 31.

[5] 刘湘花, 李 姗, 赵方言, 等. 基于网络药理学、分子对接及实验验证探讨芍药苷治疗非酒精性脂肪肝病抗炎作用机制[J]. 天然产物研究与开发, 2025, 37(2): 337-45.

[6] 汪 婕. 银杏叶中抑制黑色素合成活性成分及其部分抑制机制的研究[D]. 成都: 西南交通大学, 2023.

[7] 彭海月, 汪 婷, 李国瑞, 等. 黑色素的合成及小分子对其功能的调控[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(11): 3357-66.

[8] 付文才. 基于抗氧化剂清除活性氧自由基的生物体黑色素抑制机制研究[D]. 广州: 广州大学, 2022.

[9] Cannizzo ES, Clement CC, Sahu R, et al. Oxidative stress, inflamm-aging and immunosenescence[J]. J Proteomics, 2011, 74(11): 2313-23. doi：10.1016/j.jprot.2011.06.005

[10] 崔 虹, 朱佳茜, 冯秋芳, 等. 中药白芍化学成分及生物活性研究进展[J]. 海峡药学, 2017, 29(9): 1-5.

[11] 唐子溦, 王 艳, 叶小花, 等. “四白” 中药复方醇提液的安全性及护肤作用研究[J]. 中药新药与临床药理, 2023, 34(9): 1219-26.

[12] 杨林芳, 赵肖灵, 江世宾, 等. 白芍总苷对H₂O₂诱导下黑色素细胞的保护及作用机制[J]. 天津师范大学学报: 自然科学版, 2024, 44(5): 30-5.

[13] 刘 芬, 詹文红. 白芍总苷体外抗氧化活性研究[J]. 现代药物与临床, 2015, 30(2): 132-5.

[14] 原梦瑶, 康淑荷, 崔璐娟, 等. 红芪多糖超声提取工艺优化及抗氧化、美白和吸湿保湿活性[J]. 精细化工, 2025, 42(3): 577-86.

[15] 肖垚垚, 王 贝, 沈 宇, 等.经典美白复方“白芍提取物”质量标志物的预测分析[J]. 中国现代中药, 2023, 2: 447-54.

[16] 王逸飞, 朱振宇, 吴志生, 等. QbD理念的中药缓控释制剂的设计与研发研究[J]. 中国中药杂志, 2019, 44(20): 4317-21.

[17] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典-一部: 2020年版[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020.

[18] 张喜利, 梁慧慧, 刘文龙. 新伤湿敷液醇提工艺优化[J]. 中成药, 2023, 45(12): 4071-5.

[19] 栗焕焕, 毛营营, 张国琴, 等. 响应面分析法优化吴茱萸提取工艺及多指标定量指纹图谱研究[J]. 中华中医药杂志, 2020, 35(11): 5716-20.

[20] 刘龙云, 王晓权, 孙 松, 等. Box-Behnken响应面法结合熵权法优化三黄洗剂提取工艺[J]. 长春师范大学学报, 2023(12): 76-86.

[21] Sun SQ, Wang YJ, Xu W, et al. Optimizing ultrasound-assisted extraction of prodigiosin by response surface methodology[J]. Prep Biochem Biotechnol, 2015, 45(2): 101-8. doi：10.1080/10826068.2013.877029

[22] 张亚梅, 韩鸿萍, 宋道光. 响应面法优化暗紫贝母流浸膏提取工艺及其质量评价[J]. 天然产物研究与开发, 2024, 36(9): 1554-63.

[23] 苏琪辉, 王 婧, 雒荣荣, 等. 基于代谢组学与网络药理学研究四黑方对斑马鱼黑色素的作用机制[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2024, 29(9): 988-1001.

[24] 贾俊芳, 孟德新, 李淑霞, 等. 古方三白汤不同溶剂提取物美白作用比较研究[J]. 2022(11): 234-6.

[25] 马梓育, 陆 洋. 基于网络药理学与细胞实验的三白汤治疗皮肤色素沉着机制探究与初证[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2021, 23(7): 2153-69.

[26] 方婧杰, 陈 建, 陈雅娟, 等. 曲酸提取工艺优化及其对酪氨酸酶抑制作用的分子机制[J]. 食品与机械, 2023, 39(12): 9-17.

[27] Qu YW, Zhan Q, Du SB, et al. Catalysis-based specific detection and inhibition of tyrosinase and their application[J]. J Pharm Anal, 2020, 10(5): 414-25. doi：10.1016/j.jpha.2020.07.004

[28] Qian WH, Liu WY, Zhu D, et al. Natural skin-whitening compounds for the treatment of melanogenesis (Review)[J]. Exp Ther Med, 2020, 20(1): 173-85. doi：10.3892/etm.2020.8687

[29] 马馨桐. 桔梗美白活性物质研究[D]. 长春: 长春中医药大学, 2021.

[30] 耿 莉, 张守亮, 王杰琼, 等. 中医药治疗皮肤色素沉着的研究进展[J]. 时珍国医国药, 2023, 34(7): 1711-4.

[31] Zaid AN, Al Ramahi R. Depigmentation and anti-aging treatment by natural molecules[J]. Curr Pharm Des, 2019, 25(20): 2292-312. doi：10.2174/1381612825666190703153730

[32] 朱芷葳, 蓝吴涛, 马悦悦, 等. 大蒜素对小鼠黑色素瘤B16F10细胞体外增殖和迁移能力的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(3): 831-8.

[33] 夏 颖, 殷志爽, 石 晨, 等. 白芍提取物及其有效成分抗氧化活性的研究[J]. 首都医科大学学报, 2013, 34(1): 120-5.

[34] 秦亚东, 周娟娟, 汪荣斌. 白芍多糖抑制酪氨酸酶活性成分的筛选[J]. 中成药, 2018, 40(12): 2755-8.

[35] 张建国, 马宁珠, 王振霖, 等. 白术与白芍美白面膜的制备及美白作用初步研究[J]. 中国美容医学, 2023, 32(7): 69-74.

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