结直肠癌细胞分泌牙本质涎磷蛋白通过整合素αvβ3依赖途径诱导奥沙利铂耐药

Tumor-secreted dentin sialophosphoprotein induces oxaliplatin resistance in colorectal cancer through an integrin αvβ3-dependent pathway

摘要

目的 探索牙本质涎磷蛋白（DSPP）对结直肠癌奥沙利铂治疗效果的影响，及其作用机制，评估靶向DSPP对结直肠癌的治疗疗效。 方法 将奥沙利铂耐药HCT8细胞（OxR/HCT8）、结直肠癌类器官（PDTOs）、HCT116及SW620细胞设为sgNC对照组与sgDSPP敲除组，以CCK-8实验检测敲除DSPP后细胞对奥沙利铂的敏感性；将HCT116、SW620细胞设为sgNC、sgDSPP敲除组，Caco2及HCT8细胞设为oeNC对照、oeDSPP过表达组、oeDSPP过表达+Cyclo（整合素αvβ3抑制剂）组，Western blotting验证OxR/HCT8中 DSPP的表达水平，DSPP过表达、敲除细胞株构建以及对MAPK信号通路的调控。体内实验：采用4~5周龄BALB/c-nu裸鼠构建皮下成瘤模型，随机分3组（5只/组）：Glu对照组、L-OHP（奥沙利铂）组、L-OHP+α-DSPP（DSPP单克隆抗体）联合组，验证联合治疗疗效。构建结直肠癌PDX模型，其中3例以4~5周龄NOD-SCID小鼠分4组（5~6只/组）：Glu组、α-DSPP组、L-OHP组、L-OHP+α-DSPP组，验证靶向DSPP对奥沙利铂敏感性的影响；其余2例分6组（4~6只/组），新增Cyclo组及L-OHP+Cyclo组，对比靶向DSPP与整合素αvβ3的作用差异。免疫荧光染色、Co-IP、免疫组织化学染色实验分析DSPP与整合素αvβ3相互作用；HE染色及免疫荧光实验验证类器官模型的成功构建；免疫组织化学染色分析DSPP在结直肠癌奥沙利铂治疗敏感与耐药患者中的表达强弱。 结果 免疫组织化学染色结果显示，与对奥沙利铂敏感结直肠癌患者相比（n=30），DSPP表达水平在奥沙利铂耐药患者（n=30）中显著升高（P<0.001）；OxR/HCT8细胞中DSPP表达上调，并且在OxR/HCT8细胞、CRC类器官模型、HCT116以及SW620细胞中敲除DSPP均能增加奥沙利铂敏感性；Co-IP及免疫荧光实验证实肿瘤细胞DSPP与整合素αvβ3二者间具有相互结合及共定位；免疫组织化学染色发现结直肠癌患者肿瘤组织中DSPP表达较高时，整合素αvβ3表达水平也相对较高；DSPP可以上调MAPK信号通路中ERK及P53的磷酸化水平，而整合素αvβ3抑制剂能有效逆转DSPP的这一调控作用；裸鼠及PDX模型证实靶向DSPP及整合素αvβ3可以抑制肿瘤的生长（P<0.05），减小肿瘤的重量（P<0.05），增加结直肠癌奥沙利铂疗效（P<0.05），而DSPP单克隆抗体的促进作用优于αvβ3靶向抑制剂。 结论 DSPP通过整合素αvβ3调控结直肠癌奥沙利铂耐药的新机制，确立DSPP有望成为提高晚期结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的新靶点。

Abstract

Objective To determine whether dentin sialophosphoprotein (DSPP) modulates oxaliplatin efficacy for colorectal cancer (CRC) and explore the underlying integrin αvβ3-dependent mechanism. Methods Immunohistochemistry was used to compare the expression levels of DSPP between oxaliplatin-sensitive and oxaliplatin-resistant CRC tissues. The changes in oxaliplatin sensitivity in parental and oxaliplatin-resistant CRC cell lines after DSPP knockdown or overexpression were assessed using CCK-8 assay, and Western blotting was used to evaluate the efficacy of DSPP modulation and MAPK pathway activity. The interaction between DSPP and integrin αvβ3 was examined by immunofluorescence staining, co-immuno-precipitation, and immunohistochemistry. HE and immunofluorescence staining were used to confirm the establishment of CRC organoid models. Patient-derived xenograft (PDX) and nude mouse subcutaneous xenografts were used to evaluate the in vivo effect of targeting DSPP on oxaliplatin response. Results DSPP expression was significantly elevated in oxaliplatin-resistant patients and in oxaliplatin-resistant HCT8 cells. DSPP knockout significantly increased oxaliplatin sensitivity in oxaliplatin-resistant HCT8 cells and in HCT116 and SW620 cells. Co-immunoprecipitation revealed binding between DSPP and integrin αvβ3 in tumor cells, and immunofluorescence staining demonstrated their co-localization. Immunohistochemistry showed a positive correlation between DSPP expression and integrin αvβ3 expression in CRC tissues. Western blotting indicated that DSPP upregulated the phosphorylation levels of ERK and P53 in the MAPK signaling pathway, whereas the integrin αvβ3-targeted inhibitor (Cyclo) effectively abrogated this regulatory effect. In the xenograft and PDX models, targeted inhibition of DSPP or integrin αvβ3 suppressed tumor growth and improved the efficacy of oxaliplatin, for which the anti-DSPP monoclonal antibody was more effective than integrin αvβ3-targeted inhibitor. Conclusion We identified a DSPP-integrin αvβ3 axis that mediates oxaliplatin resistance, and DSPP may serve as a therapeutic target to restore chemosensitivity in advanced CRC.

Graphical abstract

关键词

结直肠癌 / 化疗耐药 / 牙本质涎磷蛋白 / 整合素αvβ3

Key words

colorectal cancer / chemotherapy resistance / dentin sialophosphoprotein / integrin αvβ3

结直肠癌（CRC）作为一种全球性的重大健康挑战，其发病率和死亡率逐年增长，位居恶性肿瘤前列，该疾病不仅直接危及生命，更显著影响了患者的生存质量与长期预后^{［1， 2］}。据我国癌症中心统计，该病在我国的发病率位列所有恶性肿瘤的第2位，而死亡率则居于第4位^［3］。绝大多数早期CRC患者可以通过手术获得有效治疗，但约20%的患者在初次确诊时已处于转移性阶段^［4］，联合化疗成为晚期CRC患者治疗的主要手段。 FOLFOX方案——即奥沙利铂（L-OHP）联合5-氟尿嘧啶与亚叶酸钙的疗法，是目前结直肠癌的一线化疗方案，能有效延缓晚期患者的病情进展，但该方案存在显著局限性即获得性耐药，是导致治疗失败的主要原因^［5］。因此，深入研究L-OHP耐药的产生机制，寻找可用于预测疗效的生物标志物，并据此提升晚期CRC患者对化疗的敏感性，对于改善CRC患者的生存结局及长期预后具有重要意义。

牙本质涎磷蛋白（DSPP）是小整联蛋白结合配体N-连接糖蛋白（SIBLING）家族的成员之一^［6］。该家族属于分泌型蛋白，在肿瘤的多种生物学进程中扮演着关键角色^［7-10］。近年来研究发现，SIBLING家族与肿瘤化疗耐药密切相关^［11-13］。例如，已有临床试验表明，在接受辅助化疗的乳腺癌患者队列显示，骨桥蛋白（OPN）mRNA高表达的患者其无病生存期（DFS）与总生存期（OS）通常更差^{［14， 15］}；多项研究揭示了OPN在不同肿瘤中促进耐药的具体通路：OPN通过激活CD44受体、PI3K/AKT信号通路及ABC药物外排转运体的活性，促进卵巢癌细胞产生化疗耐药性^［16］；在前列腺癌中，OPN可以上调PKA信号通路促进雄激素受体靶向治疗耐药^［17］； OPN可以上调αvβ3表达激活下游FAK/AKT以及ERK信号通路，促进非小细胞肺癌细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的获得性耐药^［18］。DSPP与肿瘤的多种生物学行为相关，例如DSPP能够通过影响细胞黏附、转移、血管生成、癌细胞干性及上皮间质转化等增强口腔癌细胞的侵袭性行为^{［9， 10， 19］}。此外，DSPP还被证实作为前列腺癌的生物标志物，其表达水平与肿瘤侵袭性呈正相关^{［20， 21］}。然而，DSPP在CRC耐药中的具体作用机制，目前仍有待阐明。

本研究发现DSPP在结直肠癌L-OHP耐药患者中表达升高，并能够通过整合素αvβ3激活MAPK信号通路诱导L-OHP耐药，利用PDX小鼠模型证实靶向DSPP可以有效提高L-OHP化疗敏感性。因此，DSPP有望作为晚期CRC患者逆转L-OHP治疗耐药的新靶点。

1 资料和方法

1.1 临床CRC患者组织样本收集

本研究从南方医科大学南方医院病理科收集了60例接受过奥沙利铂化学治疗的CRC石蜡包埋组织标本，根据化疗疗效（治疗后肿瘤细胞残存量）分为敏感组（对照组）及耐药组，30例/组，并收集了患者的性别、年龄、T分期、N分期、DSPP表达高低相关数据，用于后续统计分析对比。所有临床标本的使用均获得南方医院伦理委员会批准（伦理批号：NFEC-2021-431）；本研究根据样本量功效计算的方案^［22］进行分组。

1.2 免疫组织化学染色

切片于4 ℃条件下与一抗共同孵育过夜。随后，由3名不知晓分组信息的病理学家，采用半定量计分法对染色强度进行评估^{［23， 24］}：染色评分（分值范围为0~12 分）的计算方式为染色强度得分与阳性染色细胞比例得分的乘积。染色强度的判定标准如下：无染色为0分，弱阳性染色（淡黄色）为1分，中度阳性染色（棕黄色）为 2 分，强阳性染色（棕色）为3分；阳性染色细胞比例的判定标准如下：0%为0分，1%~24%为1分，25%~49%为2分，50%~74%为3分，75%~100%为4分。抗原表达水平的分级标准为：0分为阴性（－），1~4分为弱阳性（+），6~8分为中度阳性（++），9~12分为强阳性（+++）。组织标本的染色评分判定标准为：0分（－）或1~4分（+）定义为低表达；6~8分（++）或9~12分（+++）定义为高表达。若出现评分分歧（发生率低于5%），则通过共同复核切片以达成一致。

1.3 CCK-8实验及Western blotting分析

CCK-8法用于检测细胞活力。将细胞以2×10³/孔的密度接种于96孔板，培养24 h贴壁后，换用含不同浓度药物的培养基继续培养48 h，每组重复4次。在终止培养前的指定时间点，每孔加入CCK-8试剂，孵育后波长测定吸光度A_{450 nm}。

蛋白质样品通过含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液获取，并经BCA法定量。等量蛋白质经SDS-PAGE解析后，电转至PVDF膜。该膜经5%脱脂牛奶-TBST封闭1 h，随后与特定一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，与HRP标记的二抗室温反应2 h，最终使用ECL化学发光试剂在Tanon成像系统下完成显影与信号采集。DSPP抗体（Santa cruz，1∶1000），GAPDH（CST，1∶5000）、ERK（CST，1∶1000）、p-ERK（CST，1∶1000）、P53（CST，1∶1000）、p-P53抗体 （CST，1∶1000）；αvβ3（CD51+CD61）（Bioss，ER1911-52，1∶500）。

1.4 过表达质粒载体、小向导 RNA（sgRNA）慢病毒的构建

人CRC细胞系源自美国ATCC，HCT8/L-OHP耐药株购于上海斐林生物科技有限公司。所有细胞均经定期STR鉴定与支原体检测。CRC细胞以含10% FBS的RPMI 1640培养基培养，HEK-293FT细胞则以含10% FBS的DMEM培养基培养，培养环境均为37 ℃、5% CO₂。针对目的基因的小向导RNA通过在线工具设计，并由武汉淼灵生物有限公司合成，sgRNA引物序列为：DSPP（sgRNA，5'AATTCCGATGGGAGTCCT AG3'），病毒包装系统所需的pspax2与pmd2.g质粒亦由该公司提供；过表达质粒由苏州金唯智生物公司承建。最终的细胞转染步骤，依据Lipofectamine™ 3000转染试剂的说明书完成。

1.5 细胞及组织免疫荧光染色

免疫荧光染色：将CRC细胞接种于共聚焦培养皿培养12 h；样本（细胞或脱蜡切片）经4%多聚甲醛固定30 min及0.2% Triton X-100透化15 min后，依次进行一抗DSPP（Santa Cruz，1∶100）、Epcam（Abcam，1∶100）、αvβ3（ER1911-52，1∶100）（4 ℃过夜）和Alexa Fluor 488/594标记二抗（1∶200）（室温1 h）孵育，最后以DAPI复染细胞核10 min。所有图像使用奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜获取。

1.6 免疫共沉淀（Co-IP）实验

收集细胞样品，随后使用裂解缓冲液对细胞沉淀进行裂解，向裂解上清液中分别加入DSPP、αvβ3或正常IgG抗体，4 ℃过夜孵育，加入Protein A/G PLUS-Agarose琼脂糖珠混匀4 ℃孵育2 h，用提前加好 PMSF的PBS缓冲液进行洗涤，重复3~5 次，用含PMSF的PBS 缓冲液洗涤琼脂糖珠3~5次。最后，向琼脂糖珠中加入1×loading buffer，100 ℃煮沸10 min。离心后收集上清液，于-80 ℃保存备用。

1.7 裸鼠皮下成瘤及病人来源肿瘤异种移植（PDX）模型构建

裸鼠皮下成瘤模型：肿瘤细胞接种前，使用15 cm²培养皿进行扩增，待细胞密度达到80%~90%时，经消化收集，于4 ℃、900 r/min条件下离心，所得细胞沉淀使用高压灭菌的PBS重悬备用。选取4~5周龄雄性BALB/c-nu鼠，固定后暴露其右侧大腿背部皮肤，并用75%乙醇消毒。随后在该部位皮下缓慢接种100~150 μL细胞悬液（含5×10⁶细胞）。当皮下移植瘤体积达到80~150 mm³ （长×宽×宽/2）时，根据肿瘤体积和裸鼠体质量，采用分层随机法将裸鼠分为3组，每组5只，分别为Glu对照组、L-OHP组、L-OHP+α-DSPP联合组；腹腔注射α-DSPP剂量为300 ng/kg，1次/3 d给药，L-OHP剂量为20 mg/kg，1次/3 d给药，连续给药5次。

PDX模型：CRC新鲜组织样本于术后30 min内获取，并立即置于含有冰浴无菌RPMI 1640培养基的容器中。随后，将组织修剪成约3 mm³的小块，在无菌条件下植入4~5周龄雄性NOD-SCID小鼠的腹部皮下（每只小鼠植入2~3块）。待P0代移植瘤生长至约1500 mm³时，将其取出并同样处理成小块，通过连续传代（P1至P3）进行扩增。当P3代肿瘤体积达到100~200 mm³时，将荷瘤小鼠随机分配至各实验组。本研究所涉及的全部动物实验操作均在SPF级环境中完成。本文动物实验经南方医科大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准（伦理批号：SMUL202310034）；本研究根据样本量功效计算方案^［22］及预实验数据进行样本量设定，每个测试采用4~6只小鼠/组。

1.8 结直肠癌患者来源肿瘤类器官（PDTOs）构建及基因编辑

采用 Gentle Cell 解离试剂对结直肠腺癌患者的新鲜组织进行机械破碎，经70 µm滤网过滤后，将滤得样本与基质胶混合并接种至24孔板，每2 d更换培养液，使用类器官解离液进行消化传代，传代周期为7~14 d。随后对PDTOs进行基因编辑：将病毒颗粒重悬于含8 µg/mL Polybrene的类器官培养液，与类器官共孵育4 h后包埋于基质胶，并在含10 µmol/L Y-27632的培养基中培养。病毒感染约48 h后，使用含2 µg/mL嘌呤霉素的培养基连续筛选7 d。当24孔板中PDTOs密度达80%~90%时，弃去培养液，加入1 mL预冷4%多聚甲醛固定1 h，将类器官轻柔转移至15 mL离心管，用含0.1% BSA的预冷PBS溶液孵育10 min，以2%~5%熔融琼脂糖沉淀PDTOs形成琼脂糖块，经脱水透明处理后进行石蜡包埋，最终制备3 µm石蜡切片用于后续实验。

1.9 统计学分析

所有数据均使用IBM SPSS 20和GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差表示。两样本均值的比较，若满足正态分布、方差齐，则采用两独立样本T检验 （Student's t-test），若方差不齐，则采用近似T检验；两组以上样本均值比较，采用单因素方差分析，若方差齐采用LSD-T检验，若方差不齐则采用Dunnett's T₃ 检验；当P<0.05 时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DSPP表达与CRC奥沙利铂化疗耐药相关

免疫组织化学染色结果显示与对照组（n=30）相比，DSPP表达水平在L-OHP耐药患者（n=30）中显著升高（P<0.001，图1A、B），并根据患者的性别、年龄、T分期、N分期、DSPP表达高低绘制基线特征表，结果提示CRC患者的T分期在L-OHP耐药患者中显著高于敏感患者（P<0.001，表1）；CCK药敏试验检测HCT8/L-OHP耐药细胞（OxR/HCT8）与对照细胞（NC/HCT8）对L-OHP的敏感性，奥沙利铂在对照组中诱导细胞半数死亡浓度（IC₅₀）为8.575 μg/mL，而在OxR/HCT8细胞中IC₅₀浓度为70.77 μg/mL（图1C）；Western blotting结果显示DSPP蛋白表达水平在OxR/HCT8细胞中高表达（图1D）；在OxR/HCT8细胞中敲除DSPP后（图1E），奥沙利铂在敲除细胞中的IC₅₀浓度降为36.51 μg/mL（图1F）。

2.2 DSPP促进结直肠癌类器官及细胞系对L-OHP耐药

收集新鲜结直肠癌样本构建CRC肿瘤类器官（PDTOs）模型，HE及IHC实验证实类器官组织保留了肿瘤的相关形态学及基因特性（图2A），对PDTOs进行DSPP基因编辑，免疫荧光检测证实DSPP敲除CRC PDTOs的成功构建（图2B）；CCK-8药敏试验结果显示，L-OHP在CRC PDTOs对照组中IC₅₀浓度为89.92 μg/mL，而在sgDSPP/PDTOs中降为36.41 μg/mL（图2C）；在HCT116、SW620细胞系中分别敲除DSPP后（图2D），L-OHP在HCT116及SW620细胞sgNC组中IC₅₀浓度分别为102.8 μg/mL、34.43 μg/mL，而在sgDSPP细胞中IC₅₀浓度分别为46.21 μg/mL、17.46 μg/mL（图2E）。

2.3 靶向DSPP增强L-OHP在裸鼠皮下移植模型及PDX模型中的疗效

裸鼠皮下瘤模型中使用奥沙利铂处理组（L-OHP）小鼠肿瘤质量较对照组（Glu）显著减轻（P<0.001，图3A、B），并能够抑制肿瘤生长（P<0.001，图3C）；而奥沙利铂联合DSPP单克隆抗体治疗组（L-OHP+α-DSPP），小鼠肿瘤质量进一步减轻（P<0.001，图3A、B），肿瘤生长进一步被抑制（P<0.001，图3C），靶向DSPP治疗可以增强CRC对L-OHP治疗的敏感性。构建CRC-PDX 模型（图3D），在DSPP高表达CRC-PDX模型中（图3E、G），与Glu组，使用L-OHP组以及DSPP单克隆抗体组（α-DSPP）治疗组均可以减缓CRC肿瘤的生长，减小肿瘤质量（P<0.005，图3F、H），而奥沙利铂联合DSPP单克隆抗体组（L-OHP+α-DSPP）肿瘤生长进一步减缓，肿瘤质量进一步减小（P<0.001，图3F、H），在DSPP表达较低CRC-PDX模型中，DSPP单克隆抗体没有显著效果（P>0.05，图3I、J）。

2.4 DSPP与整合素αvβ3相互作用激活MAPK信号通路

Co-IP分析结果显示DSPP抗体能与αvβ3蛋白相互结合，而αvβ3抗体也能与DSPP蛋白相互结合（图4A）；免疫荧光技术分析结果显示肿瘤细胞DSPP与αvβ3在CRC细胞及组织样本中存在共定位（图4B、C）；免疫组织化学染色分析结果显示DSPP表达较高CRC患者肿瘤组织样本中，整合素αvβ3表达也相对较高（图4D）；Western blotting实验证实DSPP可以调控MAPK信号通路，激活下游ERK及P53的磷酸化（图 4E）；整合素αvβ3靶向抑制剂Cyclo可有效逆转DSPP介导的ERK及P53磷酸化上调作用（图4F）。

2.5 PDX模型证实靶向DSPP、整合素αvβ3增强结直肠癌对L-OHP敏感性

PDX 模型对比分析DSPP单克隆抗体（α-DSPP）与整合素αvβ3抑制剂（Cyclo）的疗效差异（图5A），结果显示L-OHP组、DSPP单克隆抗体组（α-DSPP）及整合素αvβ3 抑制剂组（Cyclo）均可以抑制肿瘤生长速率（P<0.05，图5C、F），减小肿瘤质量（P<0.05，图5D、G），而DSPP单克隆抗体与整合素αvβ3靶向抑制剂分别与L-OHP联合用药（L-OHP+α-DSPP、L-OHP+Cyclo）时，均可以增加L-OHP的治疗疗效，其中DSPP单克隆抗体的促进作用优于整合素αvβ3抑制剂（P<0.05，图5B~G）。此外DSPP单克隆抗体与整合素αvβ3抑制剂对小鼠体质量没有较明显的改变（P>0.05，图5H），并且用药前后各组织脏器镜下组织学形态也未出现较大改变（P>0.05，图5I）。

3 讨论

CRC是全球常见的消化道恶性肿瘤之一^{［1， 2］}，在临床治疗中，L-OHP应用于不可切除的晚期结直肠癌患者的治疗，是一线化疗方案之一^{［25， 26］}，但其化疗耐药往往导致疗效不佳、肿瘤复发及转移^{［5， 27］}。小整联蛋白结合N－连接糖蛋白（SIBLING）家族包括牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨涎蛋白（IBSP）、骨桥素（OPN/SPP1）、牙本质基质蛋白1（DMP1）及细胞外基质磷酸化糖蛋白^［6］，该家族成员与肿瘤侵袭转移^{［9， 10， 28］}、化疗耐药^［11］及细胞凋亡^［29］等发生均密切相关。本研究检测了30例对L-OHP敏感与30例对L-OHP耐药的CRC患者肿瘤样本，首次发现DSPP在L-OHP耐药的CRC患者中的表达水平明显升高，这提示DSPP可能是CRC患者对L-OHP产生耐药的重要靶分子。随后在细胞水平探究了DSPP对CRC细胞L-OHP敏感性的调控作用，在L-OHP耐药的HCT8细胞中检测到DSPP的表达水平显著升高，而敲除L-OHP 耐药HCT8细胞中DSPP后，可显著增加其对L-OHP的敏感性；同样在CRC类器官模型PDTOs以及结直肠癌细胞株中均证实敲除DSPP后可以增加细胞对L-OHP的敏感性。以上数据均提示，DSPP的高表达与CRC患者对L-OHP产生耐药密切相关，研究其诱导CRC对L-OHP产生耐药的功能及具体机制具有一定的临床价值。

本研究首先通过在裸鼠体内移植CRC细胞系，初步证实了靶向DSPP的单克隆抗体能增强L-OHP敏感性。人源肿瘤异种移植模型能有效预测个体化治疗效果，现已成为癌症转化研究中理想的临床前评估工具^{［30， 31］}。为此，本研究利用PDX模型对靶向DSPP单克隆抗体展开了进一步评价。在CRC-PDX模型中，研究结果显示，在DSPP高表达的CRC模型中，DSPP单克隆抗体不仅能够单独抑制肿瘤生长，还显著增强了L-OHP的敏感性；相比之下，在DSPP低表达的CRC模型中，该抗体则未表现出明显的抑瘤效果，也无法提高肿瘤对L-OHP的敏感性。

本研究首次通过Co-IP和激光共聚焦免疫荧光实验，在CRC细胞及临床组织样本中均发现DSPP可以与肿瘤细胞表面αvβ3相互结合。SIBLING家族是一类具有可溶性RGD基序的小整合素结合配体，能够结合整合素或CD44等细胞表面受体，激活下游激酶与转录因子通路调控肿瘤进展，该家族成员可通过其含有的RGD基序特异性结合整合素αvβ3，诱导肿瘤化疗耐药^［6］。既往研究证实，骨桥蛋白（OPN）通过上调整合素αvβ3的表达水平，激活其下游的FAK/AKT/ERK信号通路，进而促进非小细胞肺癌细胞增殖，最终介导非小细胞肺癌对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的获得性耐药^［18］；肝癌中OPN通过CD44/αvβ3-PI3K/Akt通路及αvβ3-自噬-FOXO3a轴诱导顺铂、表柔比星等药物耐药^{［32， 33］}；因此DSPP可能是通过整合素αvβ3激活下游通路调控CRC对L-OHP耐药。整合素信号通路包括 Ras、FAK、MAPK等，其中MAPK信号通路的异常激活是诱导CRC对L-OHP产生耐药性的重要机制之一，例如MAPK信号通路通过RFNG之间的串扰介导CRC中的L-OHP耐药性^［34］，GCLM通过MAPK/GCLM/NF-κB轴促进铂类化疗耐药^［35］。本研究证实DSPP可以激活CRC肿瘤细胞MAPK通路中ERK及P53磷酸化水平，而整合素抑制剂Cyclo处理过表达DSPP细胞株后，能够有效逆转这一效应，提示DSPP通过靶向整合素αvβ3介导ERK及P53磷酸化，进而调控CRC对L-OHP耐药。在PDX模型中增设了整合素抑制剂Cyclo单药处理组及其联合治疗组，证实在DSPP高表达的CRC移植瘤中，无论是DSPP单克隆抗体还是整合素抑制剂，均能有效抑制肿瘤生长、增强L-OHP治疗敏感性，其中抗DSPP单克隆抗体治疗组在这些效应上均表现出比整合素抑制剂组更为显著的优势。

综上所述，本研究首次明确了DSPP是诱导CRC奥沙利铂耐药的重要生物学标志物，其在奥沙利铂耐药的CRC临床样本及细胞株中均显著高表达，进一步通过研究DSPP调控L-OHP耐药的潜在机制，发现DSPP通过αvβ3/MAPK信号通路诱导L-OHP耐药，最终通过构建PDX模型验证靶向DSPP可以有效抑制肿瘤生长、增强L-OHP的治疗敏感性。本研究为进一步开发DSPP作为CRC奥沙利铂耐药相关的诊断指标、治疗靶点奠定了重要基础。

参考文献

[1] Siegel RL, Kratzer TB, Giaquinto AN, et al. Cancer statistics, 2025[J]. CA A Cancer J Clin, 2025, 75(1): 10-45. doi：10.3322/caac.21871

[2] Filho AM, Laversanne M, Ferlay J, et al. The GLOBOCAN 2022 cancer estimates: Data sources, methods, and a snapshot of the cancer burden worldwide[J]. Int J Cancer, 2025, 156(7): 1336-46. doi：10.1002/ijc.35278

[3] Han BF, Zheng RS, Zeng HM, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022[J]. J Natl Cancer Cent, 2024, 4(1): 47-53. doi：10.1016/j.jncc.2024.01.006

[4] Ciardiello F, Ciardiello D, Martini G, et al. Clinical management of metastatic colorectal cancer in the era of precision medicine[J]. CA Cancer J Clin, 2022, 72(4): 372-401. doi：10.3322/caac.21728

[5] Van Cutsem E, Cervantes A, Adam R, et al. ESMO consensus guidelines for the management of patients with metastatic colorectal cancer[J]. Ann Oncol, 2016, 27(8): 1386-422.

[6] Bellahcène A, Castronovo V, Ogbureke KUE, et al. Small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins (SIBLINGs): multifunctional proteins in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2008, 8(3): 212-26. doi：10.1038/nrc2345

[7] Fan SC, Gao HS, Sun LZ, et al. Knockdown of DSPP inhibits the migration and invasion of glioma cells[J]. Pathol Res Pract, 2018, 214(12): 2025-30. doi：10.1016/j.prp.2018.09.024

[8] Gu Y, Taifour T, Bui T, et al. Osteopontin is a therapeutic target that drives breast cancer recurrence[J]. Nat Commun, 2024, 15(1): 9174. doi：10.1038/s41467-024-53023-9

[9] Aseervatham J, Ogbureke KUE. Effects of DSPP and MMP20 silencing on adhesion, metastasis, angiogenesis, and epithelial-mesenchymal transition proteins in oral squamous cell carcinoma cells[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(13): 4734. doi：10.3390/ijms21134734

[10] Nikitakis NG, Gkouveris I, Aseervatham J, et al. DSPP-MMP20 gene silencing downregulates cancer stem cell markers in human oral cancer cells[J]. Cell Mol Biol Lett, 2018, 23: 30. doi：10.1186/s11658-018-0096-y

[11] Liu D, Luo M, Hu J, et al. Osteopontin enhances cisplatin resistance of human A549 lung cancer cells via stimulating the PI3K signaling pathway and upregulating ERCC1 expression[J]. Transl Cancer Res, 2020, 9(5): 3258-65. doi：10.21037/tcr.2020.03.60

[12] Panda VK, Mishra B, Nath AN, et al. Osteopontin: a key multifaceted regulator in tumor progression and immunomodulation[J]. Biomedicines, 2024, 12(7): 1527. doi：10.3390/biomedicines12071527

[13] Qin YC, Yan X, Yuan XL, et al. Osteopontin promotes gastric cancer progression via phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway[J]. World J Gastrointest Oncol, 2023, 15(9): 1544-55. doi：10.4251/wjgo.v15.i9.1544

[14] Gu M, Zheng XY. Osteopontin and vasculogenic mimicry formation are associated with response to neoadjuvant chemotherapy in advanced breast cancer[J]. OncoTargets Ther, 2017, 10: 4121-7. doi：10.2147/ott.s129414

[15] Göthlin Eremo A, Lagergren K, Othman L, et al. Evaluation of SPP1/osteopontin expression as predictor of recurrence in tamoxifen treated breast cancer[J]. Sci Rep, 2020, 10(1): 1451. doi：10.1038/s41598-020-58323-w

[16] Qian J, LeSavage BL, Hubka KM, et al. Cancer-associated mesothelial cells promote ovarian cancer chemoresistance through paracrine osteopontin signaling[J]. J Clin Invest, 2021, 131(16): e146186. doi：10.1172/jci146186

[17] Sanchis P, Sabater A, Lechuga J, et al. PKA-driven SPP1 activation as a novel mechanism connecting the bone microenvironment to prostate cancer progression[J]. Oncogene, 2025, 44(38): 3568-79. doi：10.1038/s41388-025-03511-z

[18] Fu YL, Zhang Y, Lei Z, et al. Abnormally activated OPN/integrin αVβ3/FAK signalling is responsible for EGFR-TKI resistance in EGFR mutant non-small-cell lung cancer[J]. J Hematol Oncol, 2020, 13(1): 169. doi：10.1186/s13045-020-01009-7

[19] Gkouveris I, Nikitakis NG, Aseervatham J, et al. The tumorigenic role of DSPP and its potential regulation of the unfolded protein response and ER stress in oral cancer cells[J]. Int J Oncol, 2018, 53(4): 1743-51. doi：10.3892/ijo.2018.4484

[20] Faraji SN, Nejatollahi F, Tamaddon AM, et al. Generation and characterization of a specific single-chain antibody against DSPP as a prostate cancer biomarker: Involvement of bioinformatics-based design of novel epitopes[J]. Int Immunopharmacol, 2019, 69: 217-24. doi：10.1016/j.intimp.2019.01.016

[21] Chaplet M, Waltregny D, Detry C, et al. Expression of dentin sialophosphoprotein in human prostate cancer and its correlation with tumor aggressiveness[J]. Int J Cancer, 2006, 118(4): 850-6. doi：10.1002/ijc.21442

[22] Mascha EJ, Vetter TR. Significance, errors, power, and sample size: the blocking and tackling of statistics: erratum[J]. Anesth Analg, 2018, 126(4): 1429. doi：10.1213/ane.0000000000002887

[23] Zhong Y, Long T, Gu CS, et al. MYH9-dependent polarization of ATG9B promotes colorectal cancer metastasis by accelerating focal adhesion assembly[J]. Cell Death Differ, 2021, 28(12): 3251-69. doi：10.1038/s41418-021-00813-z

[24] Liu CQ, Pan ZH, Chen Q, et al. Pharmacological targeting PTK6 inhibits the JAK2/STAT3 sustained stemness and reverses chemoresistance of colorectal cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2021, 40(1): 297. doi：10.1186/s13046-021-02059-6

[25] Lieu C, Kennedy EB, Bergsland E, et al. Duration of oxaliplatin-containing adjuvant therapy for stage III colon cancer: ASCO clinical practice guideline[J]. J Clin Oncol, 2019, 37(16): 1436-47. doi：10.1200/jco.19.00281

[26] Kee JX, Yau JNN, Kumar Muthuramalingam RP, et al. Colorectal cancer at the crossroads: the good, the bad, and the future of platinum-based drugs[J]. Chem Rev, 2025, 125(21): 10248-341. doi：10.1021/acs.chemrev.5c00041

[27] Liu XW, Zhang SM, An Y, et al. USP10/XAB2/ANXA2 axis promotes DNA damage repair to enhance chemoresistance to oxaliplatin in colorectal cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2025, 44(1): 94. doi：10.1186/s13046-025-03357-z

[28] Ding DB, Li WB, Ren JN, et al. SPP1(high) macrophage-induced T-cell stress promotes colon cancer liver metastasis through SPP1/CD44/PI3K/AKT signaling[J]. J Immunother Cancer, 2025, 13(10): e012330. doi：10.1136/jitc-2025-012330

[29] Zhang H, Guo M, Chen JH, et al. Osteopontin knockdown inhibits αv, β3 integrin-induced cell migration and invasion and promotes apoptosis of breast cancer cells by inducing autophagy and inactivating the PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 33(4): 991-1002. doi：10.1159/000358670

[30] Hidalgo M, Bruckheimer E, Rajeshkumar NV, et al. A pilot clinical study of treatment guided by personalized tumorgrafts in patients with advanced cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2011, 10(8): 1311-6. doi：10.1158/1535-7163.mct-11-0233

[31] Aparicio S, Hidalgo M, Kung AL. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models[J]. Nat Rev Cancer, 2015, 15(5): 311-6. doi：10.1038/nrc3944

[32] Liu GK, Fan XY, Tang M, et al. Osteopontin induces autophagy to promote chemo-resistance in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Cancer Lett, 2016, 383(2): 171-82. doi：10.1016/j.canlet.2016.09.033

[33] Ding K, Fan L, Chen SJ, et al. Overexpression of osteopontin promotes resistance to cisplatin treatment in HCC[J]. Oncol Rep, 2015, 34(6): 3297-303. doi：10.3892/or.2015.4306

[34] Di YQ, Zhang X, Wen XQ, et al. MAPK signaling-mediated RFNG phosphorylation and nuclear translocation restrain oxaliplatin-induced apoptosis and ferroptosis[J]. Adv Sci, 2024, 11(38): 2402795. doi：10.1002/advs.202402795

[35] Lin JF, Liu ZX, Chen DL, et al. Nucleus-translocated GCLM promotes chemoresistance in colorectal cancer through a moonlighting function[J]. Nat Commun, 2025, 16(1): 263. doi：10.1038/s41467-024-55568-1

基金资助

国家自然科学基金(82403601)

广州市科技计划项目(2024A04J5178)

广东省基础与应用基础研究基金(2024A1515012738)

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