盐酸甲氟喹促进DNA修复减轻辐射诱导的肺上皮细胞损伤

Mefloquine HCl promotes DNA repair and alleviates radiation-induced lung epithelial cell injury

摘要

目的 探讨盐酸甲氟喹（MQ）对X射线照射所致肺上皮细胞DNA损伤的保护作用。 方法 实验将人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）分为空白对照组、空白对照+MQ组、单纯照射组、照射+MQ处理组；利用CCK-8实验、EdU-488实验、细胞克隆形成实验观察MQ对X射线照射后细胞增殖和放射敏感性的影响；通过流式细胞术检测不同条件处理BEAS-2B细胞的凋亡及细胞周期情况；通过细胞免疫荧光实验、彗星电泳观察MQ对BEAS-2B细胞DNA双链断裂（DSB）损伤修复的调控功能；利用Western blotting、qPCR和荧光素酶实验研究MQ调控DSB损伤修复的作用机制。 结果 CCK-8结果显示MQ 0~40 μmol/L范围内，0~10 μmol/L对BEAS-2B细胞活力无明显抑制作用。与单纯照射组相比，10 Gy照射联合不同浓度（1~10 μmol/L）处理均能增强细胞活力，且10 μmol/L时细胞活力最高，故被选取为后续实验浓度；MQ处理能提高照射后BEAS-2B细胞增殖能力（P<0.05）和克隆形成率（P<0.05），降低辐射敏感性；同时单纯照射组细胞凋亡率为（17.43±0.51）%，而照射+MQ处理组细胞凋亡率降低至（14.03±0.45）%（t=8.621，P<0.05）；细胞周期检测发现，单纯照射导致G2/M期阻滞，MQ可缓解由4Gy照射导致的细胞G2/M期阻滞（P<0.05）；彗星实验和免疫荧光实验显示，与空白对照组相比，空白对照+MQ处理组的彗星尾矩与γH2AX foci差异无统计学意义；而照射+MQ处理组的彗星尾矩（P<0.05）和γH2AX foci形成数量（P<0.01）均较单纯照射组降低，DSB修复效率提高；Western blotting 实验与qPCR实验显示，与空白对照组相比，MQ处理BEAS-2B细胞48 h后，能够促进CtIP启动子活性（P<0.05），从而在mRNA和蛋白水平上上调CtIP的表达。 结论 MQ通过上调CtIP表达，促进BEAS-2B的DSB修复能力，进而减轻辐射诱导的肺上皮细胞损伤。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of mefloquine HCl (MQ) against X-ray irradiation-induced DNA damage in lung epithelial cells. Methods Human lung epithelial cells (BEAS-2B) were divided into blank control group, irradiation group, and irradiation+MQ treatment group. The effects of MQ on cell proliferation and radiosensitivity after X-ray irradiation were assessed using CCK-8 assay, EdU-488 assay, and colony formation assay. Apoptosis and cell cycle distribution of BEAS-2B cells with different treatments were detected by flow cytometry. The effect of MQ in promoting DNA double-strand break (DSB) repair was observed using immunofluorescence staining and comet assay, and the molecule ar mechanism was explored using Western blotting, qPCR, and luciferase reporter assays. Results MQ at 0-10 μmol/L did not significantly affect BEAS-2B cell viability. Compared to the irradiated cells, treatment with 0-10 μmol/L MQ enhanced the cell viability, and the effect was the most conspicuous at 10 μmol/L. MQ treatment obviously promoted proliferation and increased clonogenic survival rate of irradiated BEAS-2B cells while reducing their radiosensitivity, and significantly lowered cell apoptosis rate following the irradiation. Cell cycle analysis revealed that MQ alleviated G2/M phase arrest induced by irradiation, and comet assay and immunofluorescence staining showed reduced comet tail moment and γH2AX foci formation in irradiation+MQ group. Western blotting and qPCR demonstrated that MQ treatment for 48 h significantly increased CtIP promoter activity and upregulated CtIP expressions at both the mRNA and protein levels. Conclusion MQ promotes DSB repair in BEAS-2B cells by upregulating CtIP expression and may thus alleviate radiation-induced lung epithelial cell injury.

Graphical abstract

关键词

盐酸甲氟喹 / 放射性肺损伤 / DNA损伤 / DNA双链断裂修复

Key words

mefloquine HCl / radiation-induced lung injury / DNA damage / DNA double-strand break repair

放射治疗（RT）是肺癌、食管癌等胸部肿瘤治疗的重要手段^{［1， 2］}，其引起的放射性肺损伤（RILI）是常见且较为严重的不良反应，也是胸部放疗的重要剂量限制因素^［3］。目前 RILI 的治疗方式以糖皮质激素及对症治疗为主^［4］，但不良反应较多，因此探索安全有效的辐射防护药物，早期干预放射性肺损伤具有重要的临床价值。RILI 的具体发病机制尚不清楚^［5］，但辐射敏感的肺泡上皮细胞损伤在RILI的发生发展过程中具有重要的推动作用^［6-8］。研究发现，肺泡上皮细胞DNA损伤可能是导致细胞衰老及肺纤维化发生的关键因素^［9］。作为最严重的DNA损伤形式，DNA双链断裂（DSB）主要通过同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两条途径进行修复。

课题组前期基于CRISPR/Cas9系统建立了针对HR和NHEJ修复的高通量检测体系，通过筛选小分子化合物库发现盐酸甲氟喹（MQ）能够显著促进HR修复^［10］。本研究以人正常肺上皮细胞BEAS-2B为研究对象，探索MQ调控DSB损伤修复对辐射诱导的肺上皮细胞损伤的保护功能及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺上皮BEAS-2B细胞（上海宏顺生物科技有限公司）。DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶（Gibco）；新生牛血清（四季青）；二甲基亚砜（DMSO， Sigma）；蛋白酶抑制剂Cocktail（MCE）；Bradford、BSA标准品（BioRad）；蛋白分子量预染marker（Thermo）；ECL显影液（Millipore）；Trizol（Invitrogen）；Trevigen's CometAssay 试剂盒（Trevigen）；反转录试剂盒（艾科瑞生物工程有限公司）；双萤光素酶报告基因检测试剂盒、青霉素-链霉素溶液、Western细胞裂解液、免疫荧光相关实验试剂、细胞周期检测试剂盒（碧云天）。引物序列（上海化工）。

1.2 方法

1.2.1 BEAS-2B细胞培养与照射条件

BEAS-2B细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、 链霉素（100 U/mL）的DMEM培养液中，置于37 ℃、5%CO₂的恒温培养箱中。将BEAS-2B细胞接种在孔板里，采用美国RadSource X线照射机照射，剂量率2 Gy/min，源靶距为20 cm，照射剂量为0、2、4、6、8、10 Gy。

1.2.2 HR检测体系

利用sgRNA定位DNA序列和Cas9蛋白定向切割特定基因序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的DSB损伤模型，导入含标记序列的外源性DNA作为“追踪标签”，参与引导HR修复^［10］。步骤如下：取合适细胞密度的HEK293T-Cas9细胞接种并培养过夜，次日转染sgAAVSI和dsDNA，4 h后将细胞消化下来以2×10⁴/孔接种至96孔板，加入不同浓度MQ进行处理。48 h后采用Chelex-100提取细胞基因组DNA，并通过qPCR测定标记序列的含量。

1.2.3 CCK-8法检测细胞活力

取对数生长期的细胞，按5000/孔接种于96孔板培养24 h，用0、0.5、1、2.5、5、10、20、40 μmol/L MQ处理，24 h后避光加入10 μL CCK-8溶液/孔，孵育1 h在酶标仪酶测量吸光度A_{450 nm}并计算细胞存活率。

1.2.4 EdU-488检测细胞增殖

取对数期细胞接种于含无菌盖玻片的6孔板培养24 h后进行药物处理。24 h后将EdU工作液加入孔中孵育2 h，PBS清洗，加入4%的多聚甲醛固定15 min、通透液孵育15 min，随后加入200 μL 新鲜配置Click反应液，均匀覆盖样品避光孵育15 min，最后加1×Hoechst33342 避光孵育10 min，PBS洗涤，进行荧光检测。

1.2.5 细胞周期

取对数生长期的细胞，分别用DMSO、10 μmol/L MQ处理细胞2 h后，予以细胞0、4 Gy X射线照射，于照射后24 h收集细胞，将细胞在75%乙醇4 ℃固定48 h，期间每天轻弹离心管底分散细胞，而后用预冷PBS洗涤细胞沉淀，加入染色液37 ℃避光温浴30 min，并于24 h内完成流式分析。

1.2.6 细胞凋亡

取对数生长期的细胞，分别用DMSO、10 μmol/L MQ处理细胞24 h后，予以细胞0、6 GyX射线照射，于照射后24 h收集细胞，加入195 μL Annexin V-FITC轻轻重悬细胞后避光加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，混匀后室温避光孵育15 min，移至流式管进行流式分析。

1.2.7 克隆形成实验

取对数生长期细胞以合适细胞密度接种于6孔板培养24 h后进行药物处理，24 h后用0.25% 胰酶消化，按照500、1000、2000、4000、8000/孔接种于6孔板中，每组设置3个副孔，24 h后进行X射线照射，剂量为0（假照）、2、4、6、8 Gy（剂量率为2 Gy/min），继续培养2周。镜下观察克隆形成长至50个左右的细胞时，用3.7%甲醛室温固定2 min，甲醇透化20 min，0.1%结晶紫溶液染色15 min后，用预冷PBS洗涤多余结晶紫，将孔板晾干拍照，并使用Image J软件对细胞计数，计算生存分数。

1.2.8 中性彗星电泳实验

分别用DMSO、10 μmol/L MQ处理细胞24 h，予以8 Gy的X射线照射，照射后1 h全部更换培养基继续培养。12 h后用预冷的PBS重悬，将细胞悬液与低熔点胶LMA garose（37 ℃）混合后滴至CometSlide^TM玻片，4 ℃冷却 10 min，浸入4 ℃裂解液 60 min、4 ℃1×TBE 缓冲液30 min。将玻片置于电泳槽内，电压99 V、电流25 A条件下进行电泳，依次浸入DNA 沉淀液、70% 乙醇各30 min，37 ℃干燥15 min。每个样品用100 μL SYBR GOLD 避光染色20 min，激光共聚焦显微镜采集图像。

1.2.9 Western blotting实验

使用含混有蛋白酶抑制剂的Western及IP细胞裂解液进行细胞裂解，Bradford测定蛋白浓度后，在SDS-PAGE凝胶中上样电泳，恒压转膜；将膜在8%脱脂奶粉的Tris盐吐温缓冲液中封闭1 h，加入一抗CtIP （1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜。次日TBST洗涤3次10 min后孵育对应种属二抗（1∶5000稀释）1 h，再次洗膜，滴加ECL工作液显影。

1.2.10 免疫荧光实验

取对数生长期细胞接种于含无菌盖玻片的6孔板培养24 h后进行药物处理。24 h后给予4 Gy照射，3 h时加入0.5% NP40（PBS）透化 20 min，3% BSA 封闭 1 h，4 ℃一抗（3% BSA）孵育过夜。次日二抗避光孵育1 h，于载玻片滴加DAPI封片，并使用共聚焦显微镜拍摄。

1.2.11 实时荧光定量PCR法

按照Trizol说明书提取总RNA并反转录成cDNA，采用SYBR染料法进行实时荧光定量PCR，qPCR引物序列如下，GAPDH_F（GGATATTGTTGCCATCAATGACC）；GAPDH_R（A GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA）；CtIP_F（CAGG AACGAATCTTAGATGCACA）；CtIP_R（GCCTGCT CTTAACCGATCTTCT），其中F： Forward primer； R： Revise primer。引物由上海生工生物合成。采用2^-ΔΔΔCt分析实验数据。

1.2.12 荧光素酶实验

取合适细胞密度的BEAS-2B细胞接种并培养过夜。在转染含有CtIP启动子区域的荧光素酶报告质粒前24 h，分别用5、10 µmol/L MQ预处理细胞。转染后48 h充分裂解细胞，以15 000×g基因检测系统测定系统测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。

1.2.13 统计学分析

采用SPSS 26.0进行统计分析，计量资料符合正态分布以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。所有实验独立重复3次。

2 结果

2.1 MQ有效促进HR修复，并减轻X射线对BEAS-2B细胞活力的抑制

在0~10 μmol/L浓度范围内，MQ对细胞活力无显著抑制作用（P>0.05，图1A），通过我们前期构建的HR检测体系发现其在10 μmol/L时能有效促进HR修复（P<0.05，图1B），因此选择MQ 10 μmol/L作为后续实验浓度。进一步实验发现，经10 Gy X射线照射24 h后，BEAS-2B细胞的存活率较对照组下降（P<0.05），而经不同浓度MQ处理的细胞表现出剂量依赖性的活力增加，其中10 μmol/L处理组的细胞活力最高（P<0.05，图1C）。

2.2 MQ对BEAS-2B细胞受照射后增殖能力的影响

照射组 EdU 阳性细胞较0 Gy照射组减少，提示X射线抑制细胞增殖；而随MQ浓度升高，阳性细胞增多（图2A、C）。此外，克隆形成实验显示，X射线照射导致细胞克隆形成率下降，而MQ处理组的克隆形成率有所提高（图2B、D）。

2.3 MQ减少X射线照射诱导的细胞凋亡与周期阻滞的影响

照射后，DMSO处理组的细胞凋亡率为（17.43±0.51）%，而MQ处理组降至（14.03±0.45）%（P<0.05，图3A、B）。同时，细胞周期检测发现，X射线照射导致G2/M期阻滞，而MQ处理组的G2期细胞比例明显减少（P<0.05，图3C）。

2.4 MQ促进X射线照射后细胞DSB修复

彗星电泳实验显示，未照射时，MQ处理组与DMSO对照组尾矩差异无统计学意义；经4Gy X射线照射8 h后，MQ处理组尾矩较对照组降低（t=6.103，P< 0.05，图4A、B）。此外，γH2AX foci检测发现，未照射时，DMSO处理组和MQ处理组均无 foci 形成，照射后1 h两组foci数量相当，但照射后6 h和24 h时，MQ处理组 foci 数目均少于对照组（t=4.109，P<0.05；t=4.623，P<0.05，图4C、D）。

2.5 MQ上调CtIP表达

Western blotting实验显示，相比空白对照组，MQ处理组的CtIP 蛋白表达量升高（P<0.05，图5A）。同时，qPCR结果显示MQ处理能够显著提高CtIP的mRNA水平（t=6.573，P<0.01；t=24.51，P<0.0001，图5B）。进一步利用放线菌素D处理，研究结果显示，MQ不影响CtIP的mRNA稳定性（图5C）。双荧光素酶报告质粒系统发现MQ处理能够增强CtIP启动子活性（图5D）。

3 讨论

RILI是胸部肿瘤放疗的常见且严重的并发症，分为放射性肺炎和放射性肺纤维化两个阶段^［11］。研究表明，辐射会导致肺泡上皮细胞DNA损伤进而引起细胞衰老及肺纤维化等一系列病理进程^［12］，而正常肺部细胞受照射后，其 DSB 的修复效率或许是决定肺损伤发生进程的核心因素^{［13， 14］}。课题组前期高通量筛选发现，抗疟药AQ和MQ^［15］可通过促进HR修复精准修复DSB，后续研究表明 AQ 通过促进SIRT1介导的Rad51募集，显著提高HR修复效率，进而抑制电离辐射诱导的皮肤成纤维细胞HFF1的细胞胁迫性早衰^［10］。因此，本研究拟探讨小分子化合物MQ对人类正常肺上皮细胞（BEAS-2B）在射线照射后的DSB修复和放射敏感性的影响。G2/M期阻滞是细胞应对辐射 DNA 损伤的重要机制^{［16， 17］}，该期的细胞放射敏感性最高^{［18， 19］}。本研究显示，与照射组相比，MQ处理后BEAS-2B细胞活力增强、G2/M期细胞比例和细胞凋亡减少，提示MQ对照射后损伤细胞的保护作用。同时，相比照射组，MQ处理显著缩短了照射后细胞的彗星尾矩并减少了γH2AX foci 数量。以上结果表明，MQ可能通过促进辐射诱导的DSB修复，缓解G2/M期阻滞和抑制凋亡，进而提高BEAS-2B细胞辐射抗性。

真核生物进化出两种主要的DSB修复机制，即NHEJ和HR^{［20， 21］}。NHEJ直接以非精确方式连接断裂的DNA末端；而HR是一种精确的修复途径，其依赖姐妹染色单体提供的完整序列信息作为模板，精准引导DSB修复，确保基因组稳定性^［22］。前期研究中我们同样发现在BLM诱导的肺上皮细胞衰老模型中，伴随着Rad51的表达降低和HR修复的显著缺失。基于前期构建的HR和NHEJ修复的高通量检测体系，我们首次发现MQ显著促进HR修复^［10］。在HR修复中，CtIP作为关键调控因子，通过与MRE11/NBS1/RAD50 复合物（MRN 复合物）相互作用识别DSB并启动5'端链切除，产生HR必需的3'端单链DNA中间体^{［23， 24］}，这是区分HR与NHEJ修复途径的首要步骤。CtIP介导的末端切除为Rad51重组酶包被单链DNA创造了条件^［25］，进而启动同源搜索和姐妹染色单体链侵入过程^［21］。其功能受多种翻译后修饰精细调控，这些修饰影响其核酸酶活性、蛋白互作及稳定性^{［26， 27］}。另外，CtIP通过促进DSB切除和ssDNA形成，进而激活ATR/Chk1信号轴，对HR修复全过程起决定性作用^［28］。遗传学证据表明，CtIP缺失会导致HR缺陷，使细胞（特别是S期细胞）对DSB诱导剂呈现超敏反应^{［29， 30］}，因此CtIP被认为是HR修复中的关键调节因子。本研究显示，MQ处理后CtIP mRNA及蛋白表达均显著上升，同时不影响CtIP mRNA的稳定性和降解速率，且CtIP启动子活性增强，表明其可能通过调控CtIP的转录，促进DNA修复，从而减轻辐射对正常肺上皮细胞的损伤，而MQ与CtIP两者间的结合位点和作用机制仍需在未来进一步证实。

综上所述，盐酸甲氟喹在转录水平上调控 CtIP，提高辐射诱导的DSB修复效率，进而减轻辐射诱导的细胞凋亡和周期阻滞，最终对正常肺上皮细胞放射性损伤起到缓解作用。本研究结果为盐酸甲氟喹在预防和治疗临床电离辐射防护提供一些理论支持，但潜在的生物毒性及临床转化价值仍需要建立动物模型进行体内实验来进行验证。

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