活血清解灵通过调控Sirt1-自噬信号通路减轻胆管结扎诱导的大鼠肝纤维化

Huoxue Qingjie Ling alleviates bile duct ligation-induced hepatic fibrosis in rats by regulating the Sirt1-autophagy signaling pathway

摘要

目的 探讨活血清解灵（HXQJL）通过调控沉默信息调节因子1（Sirt1）信号通路介导的自噬改善胆管结扎（BDL）诱导的肝纤维化。 方法 采用BDL处理SD大鼠，并随机分为：假手术组（Sham）、模型组（BDL）、活血清解灵低、高剂量组（HXQJL-L、HXQJL-H），Sirt1抑制剂Ex527组（EX527），活血清解灵联合Ex527组（HXQJL+EX527）。HE和天狼星红染色观察肝组织病变和胶原沉积变化；生化检测血清ALT、AST、ALP和GGT水平。RT-PCR 和Western blotting法分别检测α-SMA、FN、COL I、Atg 5、Beclin1、p62、LC3B和Sirt1 的表达。免疫荧光检测α-SMA、LC3B和Sirt1的表达。 结果 与Sham组比较，BDL组肝细胞损伤、炎细胞浸润及胶原沉积面积增多（P<0.05），血清中ALT、AST、ALP、GGT水平增加（P<0.05）。同时肝组织中α-SMA、FN、COL I、Atg 5和Beclin1表达增加， LC3B-II/I比值增加（P<0.05），而p62和Sirt1表达降低（P<0.05）。与BDL组相比，活血清解灵各剂量组肝细胞损伤、炎细胞浸润及胶原沉积面积减少（P<0.05），ALT、AST、TBA、ALP水平降低（P<0.05），肝组织中α-SMA、FN、COL I、Atg 5和Beclin1表达降低（P<0.05），LC3B-II/I比值降低，而p62和Sirt1表达增加（P<0.05）；而Ex527组肝细胞损伤、炎细胞浸润及胶原沉积面积增多（P<0.05），ALT、AST、TBA、ALP水平升高（P<0.05），肝组织中α-SMA、FN、COL I、Atg 5和Beclin1表达升高，LC3B-II/I比值升高（P<0.05），而p62和Sirt1表达降低（P<0.05）。与HXQJL-H组相比， Ex527可以阻断活血清解灵对大鼠肝组织损伤、肝功能、肝纤维化和自噬的作用。 结论 活血清解灵通过调控Sirt1-自噬信号通路对胆管结扎诱导肝纤维化具有保护作用。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of Huoxue Qingjie Ling (HXQJL) agaisnt bile duct ligation (BDL)-induced liver fibrosis in rats and the underlying mechanism. Methods SD rats were randomized into sham-operated group, BDL model group, low- and high-dose HXQJL treatment groups, Ex527 (a Sirt1 inhibitor) group (EX527), and HXQJL+Ex527 group. Liver histopathological changes and collagen deposition were observed using HE and Sirius Red staining, and serum levels of ALT, AST, ALP, and GGT of the rats were measured using biochemical assays. The expression levels of α‑SMA, FN, COL I, Atg5, Beclin1, p62, LC3B, and Sirt1 were determined by RT-PCR and Western blotting. Immunofluorescence staining was used to detect the expression of α-SMA, LC3B, and Sirt1. Results Compared with the sham-operated rats, the rats in BDL model group exhibited increased hepatocyte injury, inflammatory cell infiltration, and collagen deposition area with elevated serum levels of ALT, AST, ALP, and GGT, enhanced haptic expressions of α‑SMA, FN, COL I, Atg5, and Beclin1, an increased LC3B-II/I ratio, and lowered hepatic expressions of p62 and Sirt1. All these changes were significantly alleviated in the two HXQJL treatment groups but aggravated in EX527 treatment group. Compared with those in high-dose HXQJL group, the protective effects of HXQJL on liver tissue injury, liver function, liver fibrosis, and autophagy were obviously mitigated by treatment with Ex527. Conclusion HXQJL has protective effect against BDL-induced liver fibrosis in rats by modulating the Sirt1-autophagy signaling pathway.

Graphical abstract

肝纤维化是肝脏对长期损伤（如酒精滥用、病毒感染、代谢异常或自身免疫反应等）的病理性修复反应，以细胞外基质（ECM）在肝内异常沉积为特征。其核心机制是肝星状细胞（HSCs）从静息状态活化，转化为肌成纤维细胞样表型，大量合成胶原等ECM成分，导致肝脏正常结构破坏和瘢痕形成^［1］。自噬是将细胞自身细胞质蛋白和受损细胞器运送到溶酶体进行降解的过程，是维持细胞和机体稳态的核心分子途径之一^［2］。研究表明，自噬与HSCs活化之间存在着密切的调控关系。自噬活性的增强可为HSCs的活化过程提供必要的能量支持，在 CCl4和 TAA 诱导的小鼠肝纤维化中，HSC-特异性Atg5或Atg7基因缺失显著减轻肝纤维化的形成^［3］。值得注意的是，沉默信息调节因子1（SIRT1）作为Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶家族中高度保守且研究最为广泛的成员，主要定位于细胞核内，不仅参与调控多种细胞活动，还在自噬的调控中发挥重要作用^［4］。此外，Sirt1在肝纤维化等多种肝脏疾病的发生与进展过程中也表现出重要的调节功能^［5］。尽管现代医学对肝纤维化的发病机制，特别是HSCs活化、自噬等分子过程有了较为深入的认识，但目前仍缺乏高效且安全的临床治疗手段。在探索肝纤维化治疗策略的过程中，中医药凭借其多成分、多靶点的特点，在肝纤维化的防治中展现出独特优势。

茵陈蒿汤出自《伤寒论》，由茵陈蒿、栀子、大黄3味中药组成，具有清热利湿，保肝利胆之效，是治疗肝脏疾病的重要方剂。活血清解灵（HXQJL）是天津市南开医院吴咸中院士研制已应用于临床数十年的经验方，由茵陈蒿汤加减得来，该方由茵陈、丹参、大黄、白头翁、败酱草、炙甘草等6味中药组成。活血清解灵方中各药合用可发挥活血化瘀，利胆化湿，清热解毒之功效^［6］。肝纤维化基本病机总结为“虚损生积，正虚邪入，邪毒久留，气滞瘀络”^［7］。与肝纤维化的病机对应，中医学中的活血化瘀是治疗肝纤维化的基本治则，这与活血清解灵的功效一致。前期已有部分研究证实了其在非酒精性肝炎及胆汁淤积性肝病治疗中的潜在作用^{［6， 8］}。然而其对胆汁淤积性肝纤维化的作用及机制尚不清楚。本研究旨在评估活血清解灵对胆管结扎诱导大鼠肝纤维化的改善作用及其可能的作用机制，从而为合理开发活血清解灵作为治疗肝纤维化疾病的中药复方提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物

SD大鼠48只，7~8周龄，体质量150±200 g。动物购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK（京）2024-0003。常规饲养于动物实验中心，常规自由进食饮水，适应性饲养1周后开始实验。本实验经天津市南开医院动物伦理委员会批准（伦理批号：NKYY-DWLL-2023-177）后进行，并严格遵循动物实验3R原则。

1.2 药物与试剂

活血清解灵组成：茵陈10 g、丹参30 g、白头翁15 g、败酱草15 g、大黄10 g、甘草6 g共6味中药（四川新绿色药业）。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、天狼星红染色试剂盒（北京索莱宝）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和谷氨酰转移酶（GGT）（南京建成生物）；Triozol和反转录试剂盒（宝日医生物技术）；SYBR qPCR SupriMix plus（苏州近岸蛋白质科技）；蛋白酶抑制剂（罗氏）；磷酸酶抑制剂（MCE）；α-SMA抗体、COL 1抗体、Atg5抗体、Beclin-1抗体、p62抗体、LC3B抗体、Sirt 1抗体（CST）；Fibronectin（Abcam）；GAPDH抗体（武汉三鹰生物）。

1.3 仪器

光学显微镜、ASP 300 S自动组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机（徕卡）；KHB（ST-360）型酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；超微量核酸蛋白测定仪和7500快速实时PCR系统（赛默飞）；Mini-Protein 型垂直电泳槽和电泳仪、XRS+型凝胶化学发光成像系统（伯乐）。

1.4 方法

1.4.1 造模、分组及给药

48只雄性 SD 大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、活血清解灵低、高剂量组（7.74、15.48 g/kg），Sirt1抑制剂Ex527组，活血清解灵联合Ex527组，8只/组。根据公式计算大鼠剂量=人剂量/70 kg×6.3（大鼠转换因子）计算出人鼠等效剂量为 7.74 g/kg。此剂量为活血清解灵低剂量（HXQJL-L），活血清解灵高剂量（HXQJL-H）为15.48 g/kg。模型组（BDL）大鼠通过吸入性异氟烷麻醉，备皮消毒后，固定于动物台上，开腹，使用钝头镊轻轻游离胆管下黏膜，夹取4-0缝线穿胆管而过，并进行打结。假手术组（Sham）只开腹不结扎。自造模第7天起，HXQJL-L及HXQJL-H分别灌胃0.774 g/mL和1.548 g/mL剂量该复方，给药体积为10 mL/kg， Sham和BDL组灌胃等体积蒸馏水，1次/d，连续灌胃1周。Ex527组腹腔注射剂量5 mg/kg，2 d/次，共给药3次。活血清解灵联合Ex527组是在腹腔注射5 mg/kg Ex527，2 d/次的基础上，再以活血清解灵 15.48 g/kg灌胃1次/d，连续7 d。

1.4.2 标本采集与处理

末次灌胃治疗后，禁水禁食12 h，使用异氟烷吸入麻醉，通过腹主动脉采血并分离肝脏。肝脏用生理盐水清洗，部分肝脏组织固定10%多聚甲醛溶液中固定，用于病理分析，剩余部分储存于-80 ℃冰箱待进一步检测。

1.4.3 大鼠肝脏指数

实验开始前对所有大鼠进行初次体质量测定，麻醉后再次称量，记录体质量变化以获取基础数据。腹主动脉采血后，迅速取出肝脏并测量湿重，计算肝脏指数：肝脏指数=肝脏湿质量/实验结束时大鼠体质量。

1.4.4 肝组织苏木精-伊红（HE）染色、天狼猩红（Sirius red）染色观察肝组织病理学变化

取经固定脱水后的大鼠肝脏组织，经石蜡包埋后切片，切片厚度约为5 μm。切片放于二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）中浸泡脱蜡各10 min，分别放入100%、90%、80%、70%酒精中各5 min，然后自来水冲洗3次，5 min/次。做苏木精-伊红染色（HE）、天狼猩红染色，光镜下观察大鼠肝组织炎症与胶原沉积情况。并使用Leica LAS Image Analysis图像分析软件对天狼猩红染色的全片胶原阳性面积进行定量分析。

1.4.5 大鼠血清肝功能检测

取血清平衡至室温，严格按照试剂盒说明书检测肝功能指标 AST、ALT、ALP、GGT的含量。应用酶标仪测定AST （510 nm）、ALT（505 nm）、ALP（510 nm）、GGT（415 nm）的吸光度值，并按标准曲线计算各项指标在血清中的含量。

1.4.6 免疫荧光染色

将肝脏组织切片脱蜡至水，随后采用微波辐射法进行抗原修复。BSA封闭30 min，分别孵育一抗α-SMA（1∶1500）、LC3B（1∶200）、Sirt1（1∶200），4 ℃下孵育过夜，荧光二抗孵育1 h，DAPI染液后孵育3 min，孵育全程避光。在200倍荧光显微镜下观察肝组织中α-SMA、LC3和Sirt1的表达（阳性表达显示为绿色），并采集图像。

1.4.7 RT-qPCR检测

称取各组大鼠肝脏组织，提取总RNA并测定其浓度，取总RNA 1μg按照反转录试剂盒说明书将其反转录成cDNA。采用SYBR Green染料法进行qRT-PCR反应，反应总体系为20 μL。反应条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火1 min，共40个循环。扩增产物运用2^-ΔΔCt法计算各目的mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

1.4.8 Western blotting检测

称量各组肝脏组织40 μg左右，加入10倍体积蛋白裂解液，将组织研磨，冰上裂解30 min后，12 000 r/min，离心10 min。取上清待用。用BCA试剂盒进行蛋白含量的测定。其余上清加入上样缓冲液（loading buffer），蛋白变性后，各组取80 μg以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳。电泳结束后，转膜。转膜后，5%脱脂奶粉封闭2 h。分别加入一抗GAPDH（1∶30000）、FN（1∶2000）、COL I（1∶1000）、α-SMA（1∶1000）、Beclin-1（1∶1000）、Atg5（1∶1000）、LC3B（1∶1000）、p62（1∶1000）和Sirt1（1∶1000），4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜5次，分别加入二抗HRP标记山羊抗兔或小鼠IgG（1∶50 000），室温孵育2 h，再洗膜5次后，滴加ECL显色曝光成像。以GAPDH为内参，应用Image J软件对目的条带进行灰度分析，计算各目的蛋白的相对表达量。

1.5 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间差异使用单因素方差分析，病理评分多组间比较采用Kruskal-Wallis检验分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 活血清解灵对BDL大鼠体质量、肝脏质量和肝脏指数的影响

实验结果显示，与假手术组比较，模型组的大鼠体质量、肝脏质量和肝脏指数均升高（P<0.05）；与模型组比较，活血清解灵低、高剂量组体质量、肝脏质量和肝脏指数均较模型组下降（P<0.05），而EX527组体质量、肝脏质量和肝脏指数较模型组均升高（P<0.05）；与单独活血清解灵组比较，EX527联合活血清解灵体质量、肝脏质量和肝脏指数升高（P<0.05，表2）。

2.2 活血清解灵对BDL大鼠血清肝功能相关因子的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清 ALT、AST、ALP和GGT水平升高（P<0.05）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组大鼠血清ALT、AST、ALP和GGT水平降低（P<0.05）；而EX527组大鼠血清ALT、AST、ALP和GGT水平升高（P<0.05）。与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠血清ALT、AST、ALP和GGT水平升高（P<0.05，表3）。

2.3 活血清解灵对BDL大鼠肝组织病理学损伤的影响

HE染色结果显示：假手术组大鼠肝组织肝小叶结构完整，未见炎细胞浸润和肝细胞坏死情况；模型组肝小叶结构紊乱，有大量炎性细胞浸润，汇管区可见明显胆管扩张（P<0.05）；HXQJL-L组和HXQJL-H组大鼠肝脏组织小叶中心区域未见明显病理改变，胆管扩张有明显改善，炎性细胞浸润减少（P<0.05）。与模型组比较，EX527组大鼠肝小叶结构紊乱面积增大，有更多的炎细胞浸润，汇管区的胆管扩张更加明显（P<0.05）；与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织肝小叶结构紊乱，炎细胞浸润增强，汇管区的胆管扩张明显（P<0.05，图1、表4）。

天狼星红染色结果显示，假手术组肝脏结构完整，肝细胞排列规整，无明显胶原纤维沉积。模型组肝间质区域出现明显红色胶原纤维沉积，主要集中在汇管区及肝细胞间隙。与模型组比较，HXQJL-L组和HXQJL-H组肝组织胶原纤维沉积减轻，仅存少量红色胶原纤维沉积；而EX527组肝组织红色胶原沉积面积则增加。与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织红色胶原纤维沉积增加。定量评估天狼星红染色阳性染色面积百分比，结果显示，与假手术组相比，模型组天狼星红染色阳性染色面积增加（P<0.05）。与模型组比较，HXQJL-L组和HXQJL-H组阳性染色面积降低（P<0.05），而EX527组则增加（P<0.05）。与单独HXQJL-H组比较，EX527联合HXQJL-H组天狼星红染色阳性染色面积增加（P<0.05，图1、表4）。

2.4 活血清解灵对BDL大鼠肝组织纤维化的影响

Real-time PCR 法检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的FN、COL I和α-SMA mRNA 表达升高（P<0.05）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组的FN、COL I和α-SMA mRNA水平均降低（P<0.05），而EX527组FN、COL I和α-SMA mRNA水平均升高（P<0.05）。此外，与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中FN、COL I和α‑SMA mRNA水平均升高（P<0.05，表5）。

Western blotting检测结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠的FN、COL I和α-SMA蛋白表达升高（P<0.01）；与模型组比较，活血清解灵高剂量组的FN、COL I和α-SMA 蛋白表达均降低（P<0.05），而EX527组FN、COL I和α-SMA 蛋白水平均升高（P<0.05）。与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中FN、COL I和α-SMA 蛋白水平均升高（P<0.05，图2、表6）。

免疫荧光检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的α-SMA蛋白表达升高（P<0.01）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组的α-SMA 蛋白表达均降低（P<0.05），而EX527组α-SMA 蛋白水平均升高（P<0.05）。此外，与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中α-SMA 蛋白水平均升高（P<0.05，图3）。

2.5 活血清解灵对BDL大鼠肝组织自噬的影响

Real-time PCR 法检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的Beclin-1、Atg5和LC3B mRNA 表达升高（P<0.05），而p62 mRNA水平降低（P<0.05）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组的Beclin-1、Atg5和LC3B mRNA水平均降低（P<0.05），p62 mRNA水平升高（P<0.05）。而EX527组Beclin-1、Atg5和LC3B mRNA水平均升高（P<0.05），p62 mRNA水平降低（P<0.05）。与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中Beclin-1、Atg5和LC3B mRNA水平均升高（P<0.05），p62 mRNA水平降低（P<0.05，表7）。

Western blotting检测结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠的Beclin-1、Atg5和LC3B蛋白表达升高（P<0.05），而p62蛋白水平降低（P<0.01）；与模型组比较，活血清解灵高剂量组的Beclin-1、Atg5和LC3B-Ⅱ/LC3B‑Ⅰ蛋白水平均降低（P<0.05），p62蛋白水平升高（P<0.05）。而EX527组Beclin-1、Atg5和LC3B‑Ⅱ/ LC3B‑Ⅰ蛋白水平均升高（P<0.05），p62蛋白水平降低（P<0.05）。与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中Beclin-1、Atg5和LC3B‑Ⅱ/LC3B‑Ⅰ蛋白水平均升高（P<0.05），p62蛋白水平降低（P<0.05，图4、表8）。

免疫荧光检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的LC3B蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组的LC3B蛋白表达均降低（P<0.05），而EX527组LC3B蛋白水平均升高（P<0.05）。与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中LC3B 蛋白水平均升高（P<0.05，图5）。

2.6 活血清解灵对BDL大鼠肝组织Sirt 1表达的影响

Real-time PCR 法检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的Sirt 1 mRNA 表达降低（P<0.01）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组的Sirt 1 mRNA水平均升高（P<0.05），而EX527组Sirt 1 mRNA水平降低（P<0.05）。此外，与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中Sirt 1 mRNA水平降低（P<0.05，表9）。

Western blotting检测结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠的Sirt 1蛋白表达降低（P<0.01）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组的Sirt 1蛋白表达均升高（P<0.05），而EX527组Sirt 1蛋白水平降低（P<0.05）。此外，与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中Sirt 1蛋白水平降低（P<0.05，图6、表10）。

免疫荧光检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的Sirt 1蛋白表达降低（P<0.01）；与模型组比较，活血清解灵各剂量组的Sirt 1蛋白表达均升高（P<0.05），而EX527组Sirt 1 蛋白水平降低（P<0.05）。与单独HXQJL-H组大鼠比较，EX527联合HXQJL-H组大鼠肝组织中Sirt 1蛋白水平降低（P<0.05，图7）。

3 讨论

肝脏是代谢、免疫应答调节、糖原储存和蛋白质合成的关键器官，在维持生理平衡中发挥至关重要的作用^［9］。胆汁淤积是一种由免疫因素、遗传缺陷、药物不良反应和其他情况引起的疾病，通常会导致毒性胆汁酸在肝细胞、肝胆管和肝外胆管中蓄积，从而促进细胞死亡和肝脏炎症反应，随后可进展为不可逆的肝纤维化，甚至肝衰竭^［10］。由于疾病性质、不同病因和复杂的损伤机制，胆汁淤积性肝纤维化的特异性强效药物治疗受到限制^［11］。因此，为开发胆汁淤积的潜在治疗药物提供新的见解可能具有重要的临床意义。

活血清解灵是吴咸中院士在长期临床实践中总结出的经验方，由茵陈蒿汤化裁而来，是天津市南开医院的临床经验方。目前国内外已有大量关于茵陈蒿汤治疗胆汁淤积性肝纤维化的研究，包括调节胆汁酸代谢与排泄、减轻炎症反应、抑制HSC活化、抑制氧化应激等^［12-15］。但是活血清解灵对胆汁淤积性肝纤维化的作用及机制尚不清楚。因此，本研究制备BDL诱导大鼠肝纤维化模型，深入探讨其对BDL诱导大鼠肝纤维化的改善作用及分子机制。

在胆汁淤积性肝纤维化的进展过程中，长期的炎症和活化的HSCs是其重要的驱动因素，激活的HSCs转化为肌成纤维细胞，大量合成并沉积ECM，最终导致肝内纤维间隔形成和肝纤维化的发生。研究表明，血清中ALT、AST、ALP和GGT通常可以直接/间接反映肝脏炎症和肝功能的状态^［16］。纤连蛋白（FN）和胶原，特别是COL Ⅰ是肝纤维化中ECM的关键检测标记物^［17］。此外，α-SMA作为HSCs活化的标志物^［18］。本研究结果显示，BDL术后，大鼠血清ALT、AST、ALP和GGT水平以及肝组织中肝纤维化标志物 FN、COL Ⅰ和α-SMA的表达均显著升高，这与先前的文献报道一致。此外，本研究证实活血清解灵干预均能显著降低上述血清肝功能指标和肝纤维化标志物的表达。

在肝纤维化的发病机制中，自噬在 HSC 中的作用被广泛研究，越来越多的证据表明自噬的激活对于 HSC 的增殖和活化以及随后的肝组织纤维化形成至关重要^{［19， 20］}。先前的研究表明，BDL诱导肝纤维化模型中Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白水平升高，而p62蛋白水平降低，药物可通过抑制自噬，抑制HSC活化，从而改善纤维化^［21-23］。与先前报道一致的是，本研究发现BDL诱导肝纤维化组织中自噬相关蛋白Beclin-1、Atg 5和LC3B-Ⅱ的水平均显著升高，p62水平显著降低，表明自噬水平显著升高。而活血清解灵干预均能显著降低BDL诱导肝纤维化的自噬。

Sirt 1是一种NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶。研究表明，Sirt 1可通过改变不同靶分子的乙酰化状态，减轻肝细胞凋亡，抑制HSC 活化，从而在肝纤维化中发挥重要作用^［24-26］。若下调 Sirt 1的表达则会诱导肝细胞的凋亡，从而加速促进肝纤维化的形成^［27-29］。本研究发现，BDL-诱导肝纤维化组织中Sirt 1的表达水平显著降低，当Sirt 1活性被 Sirt 1选择性抑制剂EX527抑制时，大鼠肝组织病理评分，纤维化水平均显著升高，结果与先前研究一致。而活血清解灵干预则能恢复Sirt 1的表达。而研究还表明，Sirt 1与自噬之间关系密切，Sirt 1能够使自噬相关分子去乙酰化，从而调控自噬^{［30， 31］}。本研究发现，当Sirt 1活性被EX527抑制的同时，活血清解灵对BDL诱导肝纤维化的改善作用显著降低，包括肝组织病理评分，肝功能生化指标如ALT、AST、ALP和GGT，肝纤维化指标如天狼星红染色、FN、COL Ⅰ和α-SMA的表达以及肝脏组织自噬水平均显著升高。总之，EX527消除了活血清解灵对BDL诱导肝纤维化的改善作用。

综上所述，活血清解灵通过调控Sirt1-自噬信号通路减轻BDL诱导。此外，该实验缺乏细胞实验进一步验证该机制，后续会进行深一步的研究。

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