生脉散通过调控乳酸/Wnt/β-catenin/LDHA通路改善非小细胞肺癌奥希替尼耐药的作用机制

Shengmai San improves osimertinib resistance of non-small cell lung cancer cells by regulating the lactate/Wnt/β-catenin/LDHA pathway

摘要

目的 探讨生脉散改善非小细胞肺癌奥希替尼耐药的作用和机制。 方法 制备大鼠含药血清，单用或联合奥希替尼处理人肺癌细胞A549检测细胞活力的变化，试剂盒检测细胞葡萄糖和乳酸含量变化，构建小鼠皮下肺癌模型，观察生脉散联合奥希替尼使用对奥希替尼体内抗肺癌活性的影响。Western blotting、RT-qPCR和免疫荧光实验检测生脉散和乳酸对Wnt/β-catenin/LDHA信号通路的影响。 结果 生脉散以浓度依赖性增加A549细胞对奥希替尼的药物敏感性，与单用奥希替尼组比较，生脉散联合奥希替尼抑制细胞活力（P<0.001），克隆形成（P<0.001）和肺癌细胞体内增长（P<0.05），生脉散呈剂量依赖性减少A549细胞葡萄糖和乳酸含量（P<0.05）。Western blotting结果显示生脉散抑制LDHA、β-catenin总蛋白、细胞质和细胞核β-catenin蛋白表达（P<0.01），而乳酸则激活β-catenin总蛋白、细胞核β-catenin和LDHA蛋白表达（P<0.001）；免疫荧光结果显示乳酸激活β-catenin蛋白核积累，而生脉散抑制细胞核β-catenin蛋白表达；RT-qPCR结果显示乳酸激活Wnt/β-catenin下游靶基因（c-myc、CD44、Axin2、Oct3/4、Survivin和CCND1）的表达（P<0.05），而生脉散则抑制其表达（P<0.05）。 结论 生脉散抑制肺癌细胞乳酸/Wnt/β-catenin/LDHA通路，抑制糖酵解水平，改善非小细胞肺癌奥希替尼耐药。

Abstract

Objective To explore the effect of Shengmai San (SMS) for improving osimertinib resistance in non-small cell lung cancer cells and the underlying mechanism. Methods Cultured A549 cells were treated with osimertinib alone or in combination with SMS-medicated rat serum, and the changes in cell viability and glucose and lactate levels were determined. The effect of SMS combined with osimertinib for improving osimertinib resistance of A549 cells was assessed in a mouse model bearing subcutaneous A549 cell xenograft. Western blotting, RT-qPCR, and immunofluorescence staining were used to analyze the effects of SMS and lactate on the Wnt/β‑catenin/LDHA signaling pathway. Results SMS significantly increased osimertinib sensitivity of A549 cells in a concentration-dependent manner. Compared with osimertinib alone, the combined treatment with SMS and osimertinib significantly inhibited cell viability, colony formation ability, and tumor growth in nude mice. SMS concentration-dependently decreased glucose and lactate levels in A549 cells. The results of Western blotting showed that SM inhibited the protein expression of LDHA, total β‑catenin, and cytoplasmic and nuclear β‑catenin, while lactate obviously activated the expressions of total β‑catenin protein, nuclear β‑catenin, and LDHA in A549 cells. Immunofluorescence concentration-dependent staining showed that lactic acid activated nuclear accumulation of β‑catenin protein, while SMS significantly inhibited the expression of nuclear β‑catenin protein; RT-qPCR demonstrated that lactate significantly increased mRNA expressions of the Wnt/β‑catenin downstream target genes (c-myc, CD44, Axin2, Oct3/4, survivin, and CCND1), while SMS inhibited their expressions. Conclusion SMS improves osimertinib resistance in non-small cell lung cancer cells by inhibiting lactate/Wnt/β-catenin/LDHA pathway-mediated glycolysis.

Graphical abstract

关键词

生脉散 / 非小细胞肺癌 / 奥希替尼耐药 / 糖酵解 / 乳酸 / 机制 / Wnt/β-catenin信号通路 / 乳酸脱氢酶 A

Key words

Shengmai San / non-small cell lung cancer / osimertinib resistance / glycolysis / lactate / mechanism Wnt/β‑catenin pathway / lactate dehydrogenase A

肺癌新增及死亡病例均位居我国恶性肿瘤首位，其中非小细胞肺癌是最常见的病理类型^［1］。奥希替尼作为第3代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs），是目前唯一被批准用于EGFR T790M阳性突变患者的靶向药物，在晚期或转移性NSCLC治疗中显示出显著的临床效益，但其广泛应用仍面临化疗耐药的严峻挑战。奥希替尼的耐药机制极为复杂，涉及药物的代谢异常、肿瘤微环境的改变、肿瘤细胞代谢重编程、多种信号通路的异常激活及表观遗传学修饰等多个方面因素^{［2， 3］}。

代谢重编程是肿瘤耐药的重要特征之一。最新研究发现，奥希替尼耐药肺癌细胞通常伴随糖酵解的异常增强^［4］。糖酵解增强及乳酸积聚可通过调节 Wnt/β-catenin 信号通路促进肿瘤细胞存活、干性维持与药物耐受^{［5， 6］}。然而，目前针对“乳酸/Wnt/β-catenin/LDHA”通路在奥希替尼耐药中的作用研究尚未发现，其分子调控机制尚未阐明。

现代医学研究发现，中药在肿瘤化疗中具有增效减毒的作用，在肿瘤辅助化疗中具有重要的临床价值^［7］。肺癌属于中医学“肺积、息贲、肺岩、痰饮、咳嗽、咯血”等范畴，其病机以正虚邪实、气阴两虚为主^［8］。细胞毒性抗肿瘤药是一种具有“火热”特点的有毒之品，虽可“以毒攻毒”以攻邪抑瘤，但也易损伤人体气血津液，耗气伤阴。因此，气阴两虚成为晚期肺癌最常见的证型之一。生脉散（SMS）一方始见于《医学启源》一书，仅以人参、麦冬、五味子三药合用，补、润、敛皆有，共起益气生津、敛阴止汗之功效^［9］。研究报道生脉散可用于肺癌化疗后的气阴两虚证的治疗^［10］，联合奥希替尼可用于晚期肺癌的治疗，但是生脉散在改善肺癌奥希替尼治疗敏感性中的作用和分子机制仍不清楚。

基于此，本研究将从肺癌细胞糖酵解为切入点探讨生脉散调控乳酸/Wnt/β-catenin/LDHA通路改善非小细胞肺癌奥希替尼耐药的作用及机制，丰富其临床应用的科学内涵。

1 材料和方法

1.1 实验动物与细胞

人非小细胞肺癌细胞A549（CCL-185）和小鼠肺癌细胞LLC（CRL-1642）（ATCC）。SPF级雄性SD大鼠，7~8周龄，体质量180~200 g；C57BL/6雄性小鼠，4~5周龄，体质量18~20 g［广东药康生物科技有限公司，许可证号：SYXK（粤）2023-0315，SYXK（粤）2022-0172］。本研究通过了北京大学深圳研究生院伦理审查委员会审查（伦理批号：AP0044018）。

1.2 药物与主要试剂

生脉散（人参10 g、麦冬15 g、五味子6 g；广州中医药大学深圳医院）；DMEM培养基、PBS、胎牛血清、青霉素-链霉素、胰蛋白酶（Gibco）；奥希替尼（上海陶术生物科技）；CCK-8、吉姆萨染色液、DAPI染色液、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏发光液、葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒（碧云天生物）；总RNA分离试剂盒、RT反转录试剂盒、PowerUp™ SYBR™ Green预混液、免疫荧光二抗（Thermo Fisher Scientific）；Ki67抗体、β-Catenin抗体、β-Actin抗体、LDHA抗体、Wb二抗（Cell Signaling Technology）。

1.3 主要仪器

多功能酶标仪（TECAN）；LightCycler 480实时荧光定量PCR仪（Roche）；多功能成像分析系统（Protein Simple）；PowerPac™ HC 高电流电泳仪（Bio-Rad）；激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss）。

1.4 方法

1.4.1 生脉散的制备

生脉散药物组成：人参10 g、麦冬15 g、五味子6 g，由广州中医药大学深圳医院采购并鉴定，组方用药参照《中国药典》2020版。全方药量共计31 g。所有药物煎煮前浸泡1 h，加10倍量水煎煮提取两次，1 h/次。合并水煎液后浓缩至药物浓度为4 g/mL （生药量），置于4 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 大鼠含药血清制备

将大鼠随机分成4组：对照组、SMS低、中和高剂量组，8只/组。SMS低中高剂量组分别给予1.6275、3.25、6.5 g/kg水煎液灌胃，2次/d，对照组予等量水灌胃处理，连续灌胃1周。末次灌胃2 h后，深度麻醉大鼠，通过腹主动脉进行采血，离心收集血清，56 ℃水浴灭活1 h，过滤除菌后用于实验。

1.4.3 肺癌细胞培养及实验分组

A549和LLC细胞培养于DMEM完全培养基（1%双抗霉、10% FBS和89% DMEM基础培养基）于5% CO₂、37 ℃培养箱中进行培养。待对数生长期的A549细胞密度达到80%左右时，细胞可用于进一步实验，细胞实验分组为对照组（大鼠血清培养）、SMS低剂量组（SMS低剂量大鼠含药血清）、SMS中剂量组（SMS中剂量大鼠含药血清）、SMS剂量组（SMS高剂量大鼠含药血清）、药物联合组即将低中高剂量含药血清联合5 μmol/L奥希替尼处理细胞。

1.4.4 CCK-8检测细胞增殖率

按1500 /孔的细胞密度将A549细胞接种于96孔板中，细胞培养过夜，按上述分组进行相应处理，处理48 h后按说明书加入CCK-8溶液，避光孵育45 min后，测定吸光度A_{450 nm}，并计算相对细胞活力。

1.4.5 克隆形成实验检测细胞增殖能力

按上述分组处理细胞，将处理后的细胞按照200/孔的细胞密度接种于6孔板中，正常培养2周后，4%多聚甲醛固定液固定细胞，然后用即用型吉姆萨染色液染色15 min，置于扫描仪进行结果扫描并统计分析。

1.4.6 动物实验检测药物体内疗效

将对数生长期的小鼠肺癌细胞LLC按1.5×10⁶/100 μL的密度重悬于无菌PBS中，C57BL/6雄性小鼠腋下注射细胞悬液100 μL/只，待皮下瘤成型，体积达到100 mm³的时候进行药物干预，实验分组为对照组（灌胃同剂量无菌水）、生脉散中剂量组（灌胃4.7 g/kg生脉散水煎液）、奥希替尼组（腹腔注射5 mg/kg奥希替尼）和联合组（灌胃4.7 g/kg生脉散水煎液+腹腔注射5 mg/kg奥希替尼）。2 d/次，给药两周，给药期间记录小鼠体质量变化和皮下瘤的体积（长×宽²×0.5）。给药结束后，麻醉处死小鼠，剥离皮下瘤，组织固定于通用型组织固定液中用于后续免疫组化的分析。

1.4.7 葡萄糖和乳酸含量测定

收集药物处理的不同实验组细胞，使用试剂盒配套的裂解液充分裂解细胞，超声破碎后收集上清液，按照说明书配制反应体系，酶标仪读取吸光度，并根据标准曲线计算细胞内葡萄糖和乳酸浓度。

1.4.8 Western blotting检测β-catenin和LDHA蛋白表达

用强效RIPA裂解液充分裂解不同处理组细胞，4 ℃离心收集上清液，BCA进行蛋白定量之后，10% SDS-PAGE分离总蛋白，目的蛋白经过一抗（稀释比1∶1000）和二抗（稀释比1∶1000）孵育之后，通过超强发光液对目的蛋白条带进行显影，进一步分析蛋白表达量。

1.4.9 RT-qPCR检测Wnt/β-catenin下游靶基因变化

用RNA提取试剂盒提取各处理组细胞中的总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，设计并合成特异性引物，按照PowerUp™ SYBR™ Green 预混液配制反应体系，通过LightCycler 480实时荧光定量PCR仪得到CT值，按照公式2^–ΔΔCt计算mRNA的基因相对表达量。引物由北京擎科生物技术有限公司合成（表1）。

1.4.10 免疫组化检测组织标本中Ki-67和β-catenin蛋白表达

固定之后的组织经过石蜡包埋之后，进一步经过脱蜡水化、抗原修复、3%双氧水阻断内源性过氧化物酶活性、封闭、一抗和二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、干燥封片之后，用数字切片扫描仪对切片进行扫描，并用Image J对目的蛋白的表达量进行定量分析。

1.4.11 细胞免疫荧光检测细胞β-catenin蛋白的变化 4%多聚甲醛固定液固定不同处理组细胞，0.1% Triton X-100通透细胞、通用型山羊血清封闭、一抗和二抗孵育、DAPI复染细胞核。荧光染色后的细胞在共聚焦显微镜下观察并拍摄β-catenin蛋白在细胞的表达和分布情况。

1.4.12 统计学分析

以上各实验均独立重复3次。采用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据均以均数±标准差描述。多组间比较使用单因素方差分析，组内差异比较使用Bonferroni事后分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SMS促进奥希替尼药物敏感性

不同剂量SMS对A549细胞增殖无影响（P>0.05），奥希替尼单用或者联合不同剂量SMS含药血清抑制A549细胞活性（P<0.001），与单用组比较，联合组以浓度依赖性抑制细胞活力（P<0.001，图1A）。克隆形成实验的结果显示：与奥希替尼单用组比较，SMS剂量组以浓度依赖性抑制克隆团的数目和大小（P<0.001，图1B）。

2.2 SMS体内抗肺癌活性

与对照组比较，SMS组、奥希替尼组、SMS联合奥希替尼组可以减小肿瘤体积和肿瘤质量，下调Ki67蛋白表达（P<0.05，图2）。与奥希替尼单用组比较，SMS联合奥希替尼抑制肺癌体内增长（P<0.05）。给药期间小鼠体质量无明显变化（P>0.05）。

2.3 SMS抑制A549细胞葡萄糖和乳酸含量

与对照组对比，单用SMS或者奥希替尼降低细胞内葡萄糖和乳酸浓度逐渐降低（P<0.05），而联用组相对于单用奥希替尼组显著降低细胞内葡萄糖和乳酸浓度（P<0.001，图3）。

2.4 SMS抑制A549细胞Wnt/β-catenin/LDHA信号通路

与对照组比较，SMS以浓度依赖性抑制Wnt/ β-catenin信号通路核心蛋白β-catenin和糖酵解相关限速酶LDHA的蛋白表达（P<0.05，图4A、B）；细胞质和细胞核中的β-catenin蛋白表达下调（P<0.01，图4C）。与空白组比较，中剂量SMS含药血清抑制Wnt/β-catenin信号通路下游关键靶基因和LDHA的mRNA水平（P<0.05，图4D）。

2.5 SMS抑制体内肿瘤组织中β-catenin蛋白表达

与对照组比较，SMS和奥希替尼单用可以抑制体内肺癌组织中β-catenin蛋白表达水平（P<0.01），与单用奥希替尼组比较，SMS联合奥希替尼可以抑制体内肿瘤组织中β-catenin蛋白表达（P<0.001，图5）。

2.6 乳酸激活Wnt/β-catenin/LDHA信号通路

与对照组对比，乳酸促进A549细胞中β-catenin和LDHA蛋白的表达（P<0.001，图6A），促进β-catenin蛋白的核积累（P<0.001，图6B）。与对照组对比，乳酸促进Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的转录（P<0.001，图6C）。

2.7 各组β-catenin蛋白核积累情况比较

与对照组相比，乳酸刺激可以激活β-catenin蛋白的细胞核积累， SMS联合奥希替尼处理之后，β-catenin蛋白的核积累减少（图7）。

3 讨论

肺癌奥希替尼耐药的机制复杂多元，涉及EGFR突变的消失和新突变的产生、信号通路变化、表型转化、药物代谢和肿瘤微环境等多个层面^{［11， 12］}。中医以辨证论治为基本原则，整体观为宗旨，研究发现中医药联合EGFR-TKIs具有减毒增效的作用^［13］。鉴于奥希替尼在晚期NSCLC治疗中的核心地位，联合中医药探索改善其耐药性的策略对提升患者生存获益具有重大意义。

生脉散是治疗气阴两虚证的经典名方，由人参、麦冬、五味子3味药组成。临床研究发现生脉散可以缓解化疗后气阴两虚患者不良反应甚至并发症，与化疗药物合用能起到减毒增效的效果^{［10， 14］}。在本研究中发现，选取对细胞无明显毒性的低中高3个不同浓度的生脉散联合奥希替尼给药，与对照组相比，联合用药后对A549细胞生长具有明显的抑制作用；此外，体内功能实验结果表明，生脉散联合奥希替尼能够抑制小鼠体内肿瘤的生长。综合以上体内和体外实验的结果，生脉散联合奥希替尼能够显著增加奥希替尼的抗肺癌活性，其在克服奥希替尼耐药方面具有重要的临床应用前景。

有氧糖酵解是肿瘤细胞的标志性代谢特征，表现为高糖吸收、有氧糖酵解和高乳酸生成，这种异常的代谢重编程被认为是驱动包括肺癌在内的多种肿瘤产生多药耐药的关键因素之一^{［15， 16］}。中医药“扶正培本、益气养阴”的理论与现代代谢研究具有一定的内在一致性。中医认为气阴两虚是肺癌的重要本虚证候，其本质反映为机体能量代谢与氧化应激失衡^［17］。有研究表明，中药复方能够通过抑制糖酵解途径来阻碍肿瘤的生长，如人参参荣汤、四君子汤合沙参麦冬汤、清燥救肺汤等^［18-20］。本研究发现生脉散可以显著抑制肺癌细胞A549的葡萄糖摄取、乳酸生成，在一定程度抑制了肺癌细胞的糖酵解通量。同时，生脉散抑制A549细胞Wnt/β-catenin/LDHA信号通路，下调下游靶基因Survivin，CD44，Oct3/4等基因的转录水平。既往研究表明，Survivin、CD44与Oct3/4在维持肿瘤干性及耐药形成中具有关键作用^［21-23］，其中Survivin的下调显著增强奥希替尼诱导的凋亡效应；CD44和Oct3/4的下调则可能直接损害了肿瘤细胞的自我更新和致瘤能力。因此，生脉散显著抑制了肺癌细胞的糖酵解水平和肿瘤耐药相关的生物学行为。

Wnt/β-catenin信号通路在多种肿瘤中异常激活，在肿瘤发生、转移和肿瘤耐药中发挥重要作用，该通路的异常激活和肺癌的耐药密切相关^［24］。本研究通过乳酸刺激肺癌细胞A549可以观察到Wnt/β-catenin信号通路和LDHA蛋白表达的显著增强，同时促进β‑catenin蛋白的核积累。细胞免疫荧光检测发现，生脉散与奥希替尼联用能够显著降低β-catenin蛋白的核积累。有研究指出，当该通路被激活后，β-catenin在胞内积累并进入胞核，与TCF/LEF结合启动下游基因的转录^［25］，同时还可以通过增强LDH-A的转录与表达，激活肿瘤细胞糖酵解^［26］。乳酸不仅是糖酵解的产物，其本身亦可作为信号分子激活包括TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin在内的关键通路和癌症起始细胞自我更新的调节剂^{［15， 27］}，并且通过乳酸化修饰等调控基因表达，影响肿瘤微环境与耐药性^{［28， 29］}。因此，乳酸/Wnt/β-catenin/LDHA通路是肺癌细胞中异常激活的正反馈通路，在调节肺癌细胞糖酵解，介导肺癌奥希替尼耐药中发挥重要作用。值得注意的是，生脉散中各单味药的活性成分均被证实可通过干预肿瘤能量代谢，特别是糖酵解过程，发挥抗肿瘤或逆转耐药的作用。例如，有研究表明，人参中的活性成分人参皂苷Rg3可通过调控HK2和PKM2的表达，有效抑制卵巢癌细胞糖酵解过程^［30］。另有研究指出，Rg3还能阻断β-catenin的核转位，降低Wnt/β-catenin信号通路活性，从而抑制结直肠癌细胞的增殖与迁移^［31］。麦冬中的特征性成分麦冬皂苷B则能显著抑制糖酵解通路中的多个关键蛋白的表达，进而调控人肺癌细胞A549的有氧糖酵解水平^［32］，还可通过增强Axin与β-catenin的相互作用抑制Wnt/β-catenin通路活性，从而阻断非小细胞肺癌细胞的迁移与侵袭^［33］。王首星等^［34］发现五味子甲素能有效抑制有氧糖酵解并诱导胃癌细胞凋亡。

综上所述，本研究证实生脉散联合奥希替尼使用可以改善肺癌细胞对奥希替尼化疗的敏感性。同时本研究发现生脉散可以抑制肺癌细胞糖酵解过程，减少乳酸生成，抑制乳酸/Wnt/β-catenin/LDHA通路发挥增敏作用，可以为临床奥希替尼耐药患者的治疗提供理论依据。本文局限性为未使用奥希替尼诱导的获得性耐药细胞系，并且生脉散的具体活性成分作用靶点在肺癌奥希替尼耐药中的直接作用机制尚不完全明确。未来将进一步研究生脉散具体作用靶点并探索与其现有治疗策略的联合方案，为奥希替尼耐药患者带来新的希望。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金（C类）(82505309)

中国博士后科学基金面上项目(2024M760671)

广东省医学科学基金青年项目(B2025082)

广州中医药大学校院联合科技创新基金-深圳医院(GZYFT2024G12)

经方与现代中药融合创新全国重点实验室开放课题一般项目(LSLSKL20240118)

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