硒代胱氨酸通过诱导活性氧产生启动氧化应激损伤抑制结肠癌细胞生长

Selenocystine inhibits colon cancer cell growth by promoting reactive oxygen species generation to trigger oxidative damage

摘要

目的 评价硒代胱氨酸（SeC）体外抑制结肠癌细胞生长的分子机制。 方法 体外培养RKO、HCT-116、LoVo结肠癌细胞，SeC处理细胞24 h和48 h，分为正常对照组和SeC低、中、高剂量组（SeC为5、10、20 μmol/L）。MTT检测结肠癌细胞的活性。划痕实验检测结肠癌细胞迁移能力。流式细胞仪PI染色检测细胞周期阻滞和凋亡情况。荧光探针检测自由基产生、线粒体结构和膜电位变化。铁死亡标志物如丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、亚铁离子（Fe²⁺）分析铁死亡的水平，Western blotting检测蛋白表达情况。 结果 SeC低、中、高剂量组均抑制结肠癌细胞增殖和迁移（P<0.05）；SeC不同剂量处理组中细胞周期相关蛋白CDK2、CDK4表达下调，并且凋亡蛋白PARP和Caspase9发生活化（P<0.05）；此外，Western blotting结果显示SeC诱导铁死亡蛋白FTH1，xCT表达下降和DMT1表达升高；SeC不同剂量处理组中MDA，Fe²⁺水平增加和GSH水平降低（P<0.05）。荧光结果显示线粒体结构损伤、活性氧（ROS）生成增多；Western blotting结果显示氧化损伤蛋白的磷酸化表达升高和NRF2/HO-1蛋白表达下调（P<0.05）；ROS清除剂显著逆转结肠癌细胞中SeC对DMT1、PARP、p-H₂A.X蛋白的上调作用（P<0.05）。 结论 SeC可通过诱导ROS生成启动氧化应激损伤诱导结肠癌细胞凋亡和铁死亡，进而抑制结肠癌细胞生长，是结肠癌潜在的化疗剂。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanism by which selenocystine (SeC) inhibits colon cancer cell growth in vitro. Methods Colon cancer cells (RKO, HCT-116, and LoVo) were cultured and treated with 5, 10, or 20 μmol/L SeC for 24 h and 48 h. MTT assay was used to detect the cell viability, and wound healing assay was used to examine changes in cell migration. Flow cytometry with PI staining was used to analyze cell cycle arrest and apoptosis. Fluorescence probes were employed to monitor reactive oxygen species (ROS) generation, mitochondrial morphology and membrane potential, and the changes in ferroptosis were evaluated by detecting malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) and ferrous ion (Fe²⁺) levels; Western blotting was used to detect the changes in protein expressions. Results SeC at all the 3 doses significantly inhibited proliferation and migration of colon cancer cells, down-regulated the expression of cell cycle-related proteins CDK2 and CDK4 and activated the apoptotic proteins PARP and caspase-9. Western blotting showed that SeC decreased the expression of ferroptosis proteins FTH1 and xCT and increased the expression of DMT1. The levels of MDA and Fe²⁺ were increased and GSH level was decreased in SeC-treated cells. Fluorescence staining results showed that SeC treatment induced mitochondrial structure damages and promoted cellular ROS production. SeC treatment also increased phosphorylation of oxidative damage proteins and lowered the expression levels of NRF2 and HO-1 proteins. ROS scavenger significantly reversed the up-regulation of DMT1, PARP and p-H₂A.X protein induced by SeC in colon cancer cells. Conclusion SeC induces apoptosis and ferroptosis of colon cancer cells by promoting ROS generation and initiating oxidative damage, suggesting the potential of SeC as a potential chemotherapeutic agent for colon cancer.

Graphical abstract

关键词

硒代胱氨酸 / 结肠癌 / 活性氧 / 氧化应激 / 凋亡 / 铁死亡

Key words

selenocystine / colon cancer / reactive oxygen species / oxidative stress / apoptosis / ferroptosis

结直肠癌是受遗传、环境和营养因素影响的第3大常见的恶性肿瘤，全世界每年有100万~200万新病例被诊断出来^{［1， 2］}。早期结肠癌以手术切除为主要治疗方法，晚期患者通常会接受辅助化疗，化疗药物包括奥沙利铂、5-氟尿嘧啶等。然而，化疗耐受和毒副作用严重以及进口药物价格昂贵等问题限制了化疗药物的临床应用^{［3， 4］}。除此之外，一些天然来源物质如大蒜、姜黄等，能够通过促进细胞凋亡和细胞周期阻滞来抑制结肠癌发生^［5］。但植物化学物质的毒性指数在临床环境中研究还不够充分，影响其在临床中的应用^［6］。

硒是人体必须的微量元素，具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等多重功效，流行病学证实补硒可显著降低患癌的风险^{［7， 8］}。与无机亚硒酸盐相比，有机硒具有较低毒性和较高生物利用度^［9］。硒代胱氨酸（SeC）是一种天然含硒氨基酸，是硒代半胱氨酸的二硒化氧化产物。已有研究证实SeC作为新型抗肿瘤药物，通过诱导氧化应激参与细胞凋亡来抑制多种肿瘤细胞的生长^［10-13］。另外，SeC对人类正常细胞毒性较低，表现出其在肿瘤和正常细胞之间的巨大选择性，表明其在癌症化学预防方面的潜在应用^［14］。

线粒体功能失调时，活性氧（ROS）生成过多而清除减少，过度的氧化应激可引起DNA损伤、脂质过氧化^［15］。现有研究中，有机硒化合物EbSe以脂质体作为递送载体，在肿瘤组织中聚积。通过诱导线粒体损伤，促进肿瘤细胞凋亡^［16］。以钯-硒为核心的高储氢纳米四倍体（PdH0.2）4Se经近红外照射后产生硒化氢，通过触发线粒体功能障碍、ROS生成和脂质过氧化介导的氧化损伤诱导癌细胞发生明显的铁死亡^［17］。然而，SeC通过诱导ROS堆积引起氧化应激，从而导致结肠癌细胞凋亡和铁死亡的研究较少，本研究通过体外培养3种结肠癌细胞系，探讨SeC体外抑制结肠癌细胞生长的分子机制。

1 材料和方法

1.1 试剂材料

RKO、HCT-116、LoVo人结肠癌细胞（ATCC），硒代胱氨酸（Sigma）、BCA、DCFH-DA、Mito-Tracker、Mito-SOX、JC-1、Hoechst 33342、NAC和PI荧光探针（碧云天），WB一抗CDK2、CDK4、Cyclin A2、CDK6、p-ATM、p-BRCA1、p-Chk1、p-Chk2、p-Histone H₂A.X、NRF2 HO-1、PARP、Caspase-9、DMT1/SLC11A2、FTH1、xCT/SLC7A11、β‑actin及二抗（Cell Signaling Technology），PVDF膜、化学发光液（Millipore），DMEM、胎牛血清、青霉素-链霉素（Invitrogen），MDA检测试剂盒、GSH检测试剂盒（碧云天），Fe²⁺检测试剂盒（索莱宝）。

1.2 细胞活性测定

MTT法检测SeC对结肠癌细胞系RKO，HCT-116，LoVo的毒性作用。培养瓶内RKO，HCT-116，LoVo细胞密度长至70%~80%，弃去旧培养液，加入1 mL胰酶于培养箱内消化1 min。加入3 mL新鲜完全培养液终止消化后，收集细胞团于离心管内，900 r/min离心5 min。将获得的细胞团用完全培养基重悬计数，调细胞密度至7×10⁴/mL后100 μL/孔接种于96孔板。在培养箱37 ℃，5%CO₂内培养12 h左右使细胞密度至70%，将SeC按0、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L浓度梯度加入各孔中分别孵育24 h、48 h。NAC预处理30 min，按照SeC 0 μmol/L+NAC 0 mmol/L，SeC 20 μmol/L，NAC 2 mmol/L，SeC 20 μmol/L+NAC 2 mmol/L分组浓度同样进行96孔板加药操作，孵育48 h。每个处理组设置3个复孔，同时设置调零孔去除背景信号。96孔板中加入20 μL/孔噻唑蓝（MTT，5 mg/mL），继续在培养箱中孵育5 h。之后弃去孔中液体，加入150 μL/孔 DMSO，至摇床放置20 min。用酶标仪处测各孔吸光度值。细胞存活率=（实验组A_{560 nm}-背景组A_{560 nm}）/（对照组A_{560 nm}-背景组A_{560 nm}）×100%。

1.3 细胞迁移实验

消化后的RKO细胞以30×10⁴/孔铺于6孔板中。根据MTT结果进行实验分组：对照组（SeC 0 μmol/L），SeC低剂量组（SeC 5 μmol/L），SeC中剂量组（SeC 10 μmol/L），SeC高剂量组（SeC 20 μmol/L）。待细胞密度至100%时，人为制造划痕并拍下各处理组0 h时的细胞划痕处照片。SeC梯度用药后放于培养箱内培养，拍摄加药24、48 h后的细胞划痕处照片。并用ImageJ分析迁移比例。

1.4 细胞周期测定

如上述铺板操作，将RKO，HCT-116，LoVo细胞以20×10⁴/孔铺板于6孔板中，细胞密度培养至70%~80%后，依据实验分组依次加入SeC（0、5、10、20 μmol/L）培养48 h。拍摄细胞照片后，提取各孔细胞于离心管中用75%酒精溶液进行固定。PI溶液染色后，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.5 线粒体膜电位和功能检测

在六孔板内放置载玻片，如上述铺板操作，将RKO细胞以20×10⁴/孔铺于6孔板中，细胞密度培养至70%~80%后，依据实验分组依次加入SeC（0、5、10、20 μmol/L）培养48 h。用JC-1荧光探针（10 μg/mL）于培养箱避光孵育30 min检测线粒体膜电位变化，用Mito-Tracker荧光探针（0.5 μmol/L）于培养箱避光孵育30 min检测线粒体功能。同时用Hoechst 33342探针进行细胞核着色。避光孵育结束后用荧光显微镜拍摄照片，并用ImageJ进行半定量分析。

1.6 ROS与线粒体超氧化物检测

与上述线粒体膜电位荧光探针检测方法一致，细胞密度培养至70%~80%后，依据实验分组依次加入SeC（0、5、10、20 μmol/L）培养48 h。分别用DCFH-DA探针（10 μmol/L）、Mito-SOX探针（2 μmol/L）于培养箱内避光孵育30 min分别检测细胞中ROS生成情况和线粒体内超氧化物堆积情况。避光孵育结束后用荧光显微镜拍摄照片，并用ImageJ进行半定量分析。

1.7 MDA、GSH和Fe²⁺检测

将细胞以20×10⁴/孔铺于六孔板中，细胞密度培养至70%~80%后，依据实验分组依次加入SeC（0、5、10、20 μmol/L）培养48 h。收集不同实验分组细胞，加入裂解液后，1000 g，4 ℃离心10 min后提取上清液，分别根据MDA检测试剂盒、GSH检测试剂盒和Fe²⁺检测试剂盒说明配置MDA工作液、总谷胱甘肽工作液及Fe²⁺试剂，并于96孔中与待测样本反应。用酶标仪分别于波长532 nm、412 nm、593 nm处测定细胞中MDA，GSH，Fe²⁺的含量。具体方法参照试剂盒说明书进行。

1.8 Western blotting检测

收集六孔板内SeC（0、5、10、20 μmol/L）剂量培养48 h的细胞。NAC预处理30 min，按照SeC 0 μmol/L+ NAC 0 mmol/L、SeC 20 μmol/L、NAC 2 mmol/L、SeC 20 μmol/L+NAC 2 mmol/L分组加药孵育48 h，同样提取六孔板中细胞。用RIRA裂解缓冲液在冰上4 ℃裂解15 min，各管加入上样缓冲液，金属浴10 min制得蛋白样本。同时用BCA检测试剂盒提取蛋白并定量。将蛋白样本（30 μg/道）装入10%SDS-PAGE，80 V电压20 min后转170 V电压30 min。电泳后，将蛋白从凝胶转移至用甲醇激活的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，120 V恒压1 h。用5%脱脂奶粉在室温封闭1 h，之后将PVDF膜与一抗（1∶1000）4℃孵育过夜。用PBST清洗PVDF膜3次，15 min/次。然后将PVDF膜与二抗（1∶5000）室温孵育1 h。将PVDF膜与化学发光液结合后，用显影仪扫描目的蛋白。β-actin作为参考带。用ImageJ对条带进行半定量分析。

1.9 统计学分析

计量数据以均数±标准差表示，所有实验均独立重复3次。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，符合正态性和方差齐性，组间比较采用单因素方差分析和Tukey事后检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SeC剂量依赖性抑制结肠癌细胞生长

SeC处理24 h和48 h，剂量依赖性抑制了RKO， HCT-116和LoVo细胞的活性，其中48 h作用效果更明显（P<0.01，图1A）。SeC 5 μmol/L至80 μmol/L，48 h作用条件下，RKO细胞活性从81%降至56%。SeC 40 μmol/L处理组中RKO、HCT-116、LoVo细胞表现出明显细胞皱缩、细胞数量减少和细胞间接触丧失（图1B）。划痕实验表明SeC剂量依赖性抑制RKO细胞迁移（图1C），定量分析结果直观显示出SeC 0 μmol/L至20 μmol/L处理使细胞迁移率从78.8%降至21.8%（P<0.05，图1D）。

2.2 SeC诱导结肠癌细胞周期阻滞和凋亡

Western blotting结果显示，SeC处理剂量依赖性下调了CDK2，CDK4，CDK6及Cyclin A2表达（P<0.05， 图2A、C）。流式PI结果显示，SeC 5 μmol/L至20 μmol/L处理组，RKO细胞G0/G1期细胞数从43.4%升高至52.8%，发生G0/G1期阻滞（P<0.05，图2B、D）；SeC 0 μmol/L~10 μmol/L处理组HCT-116细胞的S期细胞数从11.6%升高至22.7%，发生S期阻滞（P<0.05，图2B、D）；SeC 5 μmol/L至20 μmol/L处理组，LoVo细胞的S期细胞数从30.8%升至32.2%，发生S期阻滞（P<0.05，图2B、D）。

2.3 SeC诱导结肠癌细胞凋亡和铁死亡

Western blotting结果显示，SeC剂量依赖性诱导了PARP的切割和Caspase-9的活化（P<0.05，图3A、C）。另外，SeC上调DMT1蛋白表达，同时下调FTH1和xCT蛋白表达（P<0.05，图3B、C）。除此之外，SeC剂量依赖性增加MDA和Fe²⁺的生成量，同时降低GSH的含量。例如，SeC 5 μmol/L至20 μmol/L处理RKO细胞使MDA含量从151.4%升至233.5%；GSH含量从82.1%降至56.6%；Fe²⁺含量从25.5 ng/mg升至83.6 ng/mg（P<0.05，图3D）。

2.4 SeC诱导结肠癌细胞线粒体功能障碍和氧化应激

Western blotting结果显示，SeC处理剂量依赖性上调p-ATM、 p-Chk1、 p-Chk2、p-H₂A.X蛋白的表达并下调p-BRCA1蛋白的表达，另外SeC 20 μmol/L处理组NRF2和HO-1蛋白明显上调表达（P<0.05，图4A、C）。免疫荧光染色技术检测了SeC对线粒体功能的影响，SeC处理剂量依赖性诱导DCFH-DA绿色荧光强度以及Mito-SOX红色荧光强度的增强，表明线粒体自由基的释放。同时，Mito-Tracker探针结果从荧光分布均匀到荧光强弱不均、聚积异常以及JC-1探针荧光结果从红色至绿色的变化表明SeC诱导RKO细胞发生线粒体膜电位异常，从而发生线粒体结构功能紊乱（P<0.05，图4B、D）。

2.5 ROS清除减弱SeC诱导的凋亡和铁死亡

Western blotting结果显示，ROS清除剂NAC显著逆转SeC诱导的DMT1， p-H₂A.X和PARP切割蛋白下调（P<0.05，图5A、D）。与SeC 20 μmol/L处理组相比，NAC预处理后SeC 20 μmol/L作用下，RKO细胞活性从71%升至84%（P<0.05，图5B）。NAC预处理后SeC 20 μmol/L处理使得凋亡细胞减少、RKO细胞形貌改善且细胞密度更高。

3 讨论

凋亡级联可以由外源性受体介导的信号通路或内在线粒体介导的信号通路触发^［18］。活性氧堆积通过氧化多不饱和脂肪酸破坏线粒体膜，线粒体外膜通透性增加，细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，从而活化caspase-9激活下游效应caspase，导致细胞凋亡^{［19， 20］}。在已有研究中，8-硝基-三苯胺通过调节TGF-β/SMAD和PI3K/AKT/mTOR通路降低结肠癌细胞膜电位并诱导其发生凋亡^［21］。使用黑姜根提取物将硒阳离子还原为硒纳米颗粒（KP-SeNP），实验结果发现KP-SeNP通过PI3K/AKT/mTOR上调胃癌细胞中凋亡信号标志物表达，诱导胃癌细胞发生凋亡和自噬^［22］。含硒香豆素衍生物通过促进线粒体释放细胞色素C，激活caspase9和caspase3，触发线粒体介导的凋亡通路抑制神经母细胞瘤活性^［23］。然而，有机硒SeC抑制结肠癌细胞发生凋亡及凋亡发生机制的相关研究很少。本研究采用Western blotting技术分析SeC对凋亡蛋白的作用，PARP切割和caspase-9活化表明SeC可诱导RKO细胞发生线粒体介导的细胞凋亡。同时，RKO、HCT-116、 LoVo三种结肠癌细胞系中Sub-G1峰明显升高也同样表明SeC剂量依赖性诱导结肠癌细胞发生凋亡。

2012年“铁死亡”这一术语被首次提出，并被定义为一种由铁和脂质过氧化介导的非凋亡性细胞死亡形式^［24］。经典铁死亡调控轴中系统xCT能以1∶1比例进行胞内谷氨酸和胞外胱氨酸交换转运。进入细胞的胱氨酸进一步合成GSH，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）以GSH为底物，清除胞内脂质过氧化，抑制铁死亡发生^［25］。另外，铁死亡的发生离不开铁离子的沉积。细胞内的Fe²⁺由DMT1/SLC11A2释放到胞质不稳定铁池中，LIP中的Fe²⁺可以通过参与脂质过氧化关键酶脂氧合酶的合成引发铁死亡，还可以通过与过氧化氢发生芬顿反应产生羟基自由基，攻击细胞成分引发铁死亡^{［26， 27］}。现有研究表明，高剂量亚硒酸钠通过降低GPX4的表达，导致脂质过氧化进而发生铁死亡来抑制卵巢癌细胞增殖^［28］。褐藻酸硒纳米颗粒（FD-SeNPs）通过上调转铁蛋白和下调铁蛋白、NRF2及HO-1，诱导肝癌细胞发生铁死亡来抑制其增殖^［29］。然而SeC诱导铁死亡的发生机制在结肠癌防治中研究较少，本研究结果中xCT/SLC7A11， GSH的表达降低及MDA的表达升高表明SeC诱导结肠癌发生脂质过氧化发生。同时，结果中FTH1表达下调及Fe²⁺表达升高表明SeC诱导结肠癌细胞发生铁沉积。脂质过氧化和铁沉积同步发生更加证实SeC通过铁死亡方式抑制结肠癌细胞生长，进一步实验可通过对铁死亡机制中其他通路蛋白的检测明确SeC在促进结肠癌细胞铁死亡过程中发挥的作用。

细胞凋亡和铁死亡之间存在相互作用，并最终导致细胞死亡。氧化应激可通过线粒体途径释放细胞色素C到细胞质中启动caspase级联凋亡，也可以通过脂质过氧化促进铁死亡进程^［30］。阿比维替尼通过bim和bax介导的线粒体途径诱导活性氧依赖性的凋亡，同时诱导铁聚积和脂质活性氧积累的铁死亡^［31］。纳米异质结构（Se@PB）通过促进芬顿反应诱导GSH耗竭和Fe²⁺蓄积，促进铁死亡来提高放射治疗的生物化学敏感性，其还可以通过增强x射线诱导线粒体功能障碍和DNA损伤，促进细胞凋亡，协同宫颈癌放疗^［32］。青蒿琥酯-硒化合物可导致HCT-116细胞线粒体功能障碍，还可以增加脂质过氧化和亚铁离子水平诱导结肠癌细胞发生铁死亡^［33］。研究表明硒化合物通过诱导铁死亡抑制结肠癌增殖，但有机硒SeC通过线粒体紊乱诱导凋亡同时导致铁死亡发生的研究在结肠癌治疗中阐述较少。本实验结果中Mito-Tracker和Mito-SOX荧光结果证实线粒体发生结构和功能紊乱，线粒体中超氧化物堆积致使氧化应激状态发生进而诱导凋亡，caspase-9活化表明SeC诱导的结肠癌细胞凋亡是线粒体介导的内源性凋亡途径，这与线粒体损伤结果一致。MDA、GSH、Fe²⁺及铁死亡相关蛋白的异常表达表明氧化应激还可发生脂质过氧化和Fe²⁺蓄积进而导致结肠癌细胞发生铁死亡。除此之外，NRF2的表达在氧化应激、细胞凋亡及铁死亡过程中发挥重要作用。氧化应激损伤后NRF2与Keap1发生解离，激活的NRF2通过线粒体自噬清除受损线粒体并通过影响TFAM和线粒体基因的表达促进线粒体生成^［34］。现有文献表明柳氮磺吡啶通过下调NRF2的表达，进而降低半胱氨酸/谷氨酸和GPX4的表达来诱导铁死亡发生，同时结果观察到铁死亡过程中线粒体膜电位降低^［35］。SeC通过NRF2-抗氧化反应元件轴降低NRF2和自噬通路蛋白表达，选择性攻击NRF2组成型激活的结肠癌细胞触发细胞死亡，同时对正常人结肠细胞无细胞毒性^［10］。本研究不仅证实SeC通过调控NRF2/HO-1通路可诱导结肠癌细胞发生线粒体功能紊乱进而导致氧化应激发生铁死亡，同时表明调控NRF2诱导氧化应激还可发生细胞凋亡。ROS清除剂减缓结肠癌细胞凋亡和铁死亡进程，进一步证实了本研究结论。

综上所述，SeC体外可通过启动线粒体功能障碍，诱导ROS依赖性的氧化应激损伤，导致结肠癌细胞凋亡和铁死亡，进而抑制结肠癌细胞生长，是潜在的结肠癌化疗剂。

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基金资助

国家自然科学基金(81701178)

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