唾液链球菌胞外囊泡通过活化自然杀伤细胞加剧系统性红斑狼疮肾炎病理进展

Streptococcus salivarius-derived extracellular vesicles exacerbate progression of lupus nephritis by activating natural killer cells

摘要

目的 探讨唾液链球菌来源胞外囊泡（SS-EVs）对自然杀伤（NK）细胞活化功能的调控作用及其在系统性红斑狼疮（SLE）疾病进展中的潜在机制。 方法 收集35例SLE患者及38例健康对照者的临床样本，检测其外周血T细胞、B细胞及NK细胞的数量与比例。提取患者粪便DNA，通过PCR扩增出唾液链球菌DNA片段，并通过琼脂糖凝胶电泳评估其丰度水平。采用超速离心技术分离SS-EVs，并通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和Western blotting对其进行表征。将SS-EVs与NK细胞共培养，通过定量聚合酶链式反应（qPCR）及流式细胞术体外检测NK细胞的活化状态及其细胞毒功能；将24只MRL/lpr小鼠随机分成3组，8只/组，每次分别灌胃100 μL PBS、100 μL含20 μg的E.coli-EVs和SS-EVs，通过HE染色、免疫荧光及ELISA评估肾脏病理改变、免疫复合物沉积及外周炎症因子水平，从而评估SS-EVs对狼疮性肾炎的影响。 结果 SLE患者外周血中NK细胞数量与比例下降（P<0.0001），粪便中SS丰度升高，且与SLEDAI评分呈正相关（R²=0.8369）。体外研究显示，SS-EVs上调NK细胞表面激活性受体的表达（P<0.01），增强其对靶细胞的杀伤效能；体内实验发现，SS-EVs可加剧小鼠肾组织炎症反应，促进C3和IgG免疫复合物沉积，升高血清中IL-6、TNF-α、IL-8及CCL20等炎症因子水平（P<0.05）。 结论 SLE患者的肠道中唾液链球菌富集，并通过释放SS-EVs促进NK细胞毒性功能的增强，诱导肾脏炎症反应及免疫复合物沉积，从而加重SLE的疾病进展。SS及其胞外囊泡可能为SLE的防治提供全新的靶向策略。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effects of Streptococcus salivarius-derived extracellular vesicles (SS-EVs) on natural killer (NK) cell activation and cytotoxic function and their role in progression of systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Peripheral blood and fecal samples were collected from 35 SLE patients and 38 healthy individuals to assess the number and proportion of peripheral T cells, B cells, and NK cells. Fecal DNA was extracted for PCR amplification of S. salivarius DNA fragments and quantitative analysis using agarose gel electrophoresis. SS-EVs isolated by ultracentrifugation and characterized using transmission electron microscopy, nanoparticle tracking analysis, and Western blotting were co-cultured with NK cells, whose activation status and cytotoxicity were evaluated in vitro using qPCR and flow cytometry. Twenty-four MRL/lpr mice were randomized into 3 groups (n=8) for treatment with gavage of 100 μL PBS or 20 μg E. coli-EVs or SS-EVs in 100 μL PBS. Kidney pathology, immune complex deposition, and peripheral cytokine levels were assessed with HE staining, immunofluorescence staining, and ELISA. Results The number and proportion of peripheral NK cells were significantly reduced (P<0.0001) and the fecal abundance of S. salivarius was markedly increased in positive correlation with SLEDAI scores (R²=0.8369) in SLE patients. In vitro studies showed that SS-EVs significantly upregulated NK cell-activating receptors and enhanced NK-mediated cytotoxicity. In MRL/lpr mice, SS-EV treatment markedly exacerbated renal inflammation, promoted C3 and IgG immune complex deposition, and significantly increased serum levels of IL-6, TNF-α, IL-8, and CCL20. Conclusion S. salivarius is enriched in the gut of SLE patients and promotes NK-cell activation by releasing SS-EVs, which induce renal inflammation and immune complex deposition and contributes to SLE progression. S. salivarius and its EVs may represent novel therapeutic targets for treatment of SLE.

Graphical abstract

关键词

系统性红斑狼疮 / 唾液链球菌 / 胞外囊泡 / 自然杀伤细胞 / 免疫调节

Key words

systemic lupus erythematosus / Streptococcus salivarius / extracellular vesicles / natural killer cells / immunomodulation

系统性红斑狼疮（SLE）是一种以免疫失衡和多系统受累为特征的慢性自身免疫病，主要累及肾脏、皮肤、关节和血液系统^{［1， 2］}。育龄女性高发，女性与男性发病率比例约为9∶1^{［3， 4］}。尽管诊断与治疗手段不断进步，SLE仍呈高发、易复发和不可治愈的特点^［5］。据报告，2017年中国标准化发病率已达每十万人年14.09例^［6］，造成严重的社会与医疗负担。

SLE的发病机制极其复杂，核心在于免疫耐受的破坏，传统研究多集中于B细胞和 T 细胞异常 ^{［7， 8］}。然而，近年来证据表明自然杀伤（NK）细胞也在发病中具有重要作用。NK 细胞能通过释放穿孔素和颗粒酶、肿瘤坏死因子（TNF）或介导抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）等多种机制直接杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞^［9-14］，其活性依赖激活性和抑制性受体的平衡^［15］，而该平衡的破坏可能成为自身免疫性疾病的重要驱动因素。近年来有研究表明，SLE患者中存在FCER1A下调与RGS1上调等基因表达异常，且这些差异表达基因显著富集于NK细胞介导的细胞毒性等免疫相关通路^［16］。

肠道菌群在维持免疫稳态及自身免疫病发病机制中扮演关键角色。越来越多的研究证据表明，包括SLE在内的多种疾病均与肠道菌群失调密切相关^{［17， 18］}。SLE患者菌群多样性下降，有益菌减少而潜在致病菌（如链球菌属）显著增加，进而可导致免疫信号紊乱及系统性炎症的启动^［19-22］。其中，唾液链球菌（SS）在SLE患者中丰度升高，它虽在稳态下具潜在益生作用，但免疫失衡时具有潜在致病性^［22-25］。但目前，SS 在 SLE 发病中的作用仍缺乏深入研究。

近年来的研究揭示，细菌可通过释放胞外囊泡（EVs），即细菌来源的纳米级膜性囊泡（BEVs），与宿主免疫系统进行通讯，并可通过调控免疫细胞功能在自身免疫性疾病中发挥核心作用^［26］。这些BEVs在细菌生长过程中释放，携带多种生物活性物质，可远距离调控炎症反应^［27-29］，在类风湿关节炎等自身免疫病中已被证实具有致病作用^{［30，31］}。例如，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）来源的BEVs可诱导炎性因子表达，破坏免疫稳态，从而加剧炎症性关节病变^{［32， 33］}。鉴于BEVs在免疫调控中的重要作用以及SLE患者中NK细胞功能障碍的已知事实^{［34， 35］}，我们推测 SS 释放的胞外囊泡（SS-EVs）可能通过调节 NK 细胞功能参与 SLE 发生发展。

基于此，本研究旨在探讨 SS-EVs 对NK细胞活性的调控作用及其对MRL/lpr 小鼠狼疮性肾炎的影响，以期揭示“肠道菌群-NK细胞-SLE”之间的潜在联系，为疾病监测与靶向治疗提供新的思路和策略。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究使用SPF级的10~12周龄雌性MRL/lpr小鼠［珠海百试通生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2020-0009］，所有动物均在最佳实验动物条件下饲养：每笼饲养3~4只小鼠，使用国家标准SPF级啮齿类动物饲料和垫料，饮水为高压灭菌水，饲养环境温度维持在23~25 ℃，湿度控制在55%~63%，光照周期为12 h光照/12 h黑暗，垫料定期更换，动物可自由摄食饮水。

动物实验设计与执行经南方医科大学动物管理伦理委员会批准并监管（伦理批号：IACUC-LAC-20231225-001）。小鼠随机分为3组：PBS组、E.coli-EVs组和SS-EVs组（8只/组），于饲养适应期1周后开始实验处理。每组小鼠每3 d经口灌胃1次，给予20 μg相应EVs溶液，连续干预4周。为观察体内免疫效应及组织学改变，干预结束后取小鼠肾脏组织进行HE染色与免疫荧光检测，同时采集外周血进行炎症因子ELISA分析。

1.2 实验材料

唾液链球菌标准菌株（北纳生物科技有限公司）；粪便DNA小量提取试剂盒（广州永津生物科技公司）；5×TAE缓冲液（Solarbio）；DNA Ladder、琼脂糖粉末、GelRed核酸染料（上海碧云天生物技术有限公司）；BHI培养基粉末（奥博星生物技术有限公司）；磷钨酸负染液（国药集团化学试剂有限公司）； ECL发光液（GE Healthcare）；ELISA试剂盒（Elabscience生物科技有限公司）；苏木素染液、伊红染液、二甲苯、中性树胶（索莱宝）；抗LTA一抗及（1∶1000）HRP标记二抗（1∶2000）、抗Nephrin（1∶800）、抗C3（1∶800）、抗IgG（1∶800）、抗NKp44（1∶800）、抗Caspase-3免疫荧光抗体（（1∶800，Abcam）；PCR仪、流式细胞仪（Roche）。

1.3 方法

1.3.1 研究对象与样本收集

本研究纳入SLE患者35例及健康对照（HC）38例，患者均符合2019年EULAR/ACR诊断标准，并经南方医科大学南方医院伦理委员会批准（伦理批号： NFEC-2025-026）。两组人群的性别、年龄差异无统计学意义。所有参与者签署知情同意书。SLE患者活动度通过SLEDAI评分评估。采集外周血用于流式细胞术检测T、B、NK细胞亚群（绝对计数及比例），并收集新鲜粪便样本于-80 ℃保存用于SS丰度分析。

1.3.2 粪便中唾液链球菌含量检测

使用广州永津生物科技公司生产的粪便DNA小量提取试剂盒从粪便样本中提取基因组DNA。采用2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（南芯公司）进行目标片段扩增，反应体系20 μL，包括10 μL 2×Master Mix、0.4 μL正向引物（10 μmol/L）、0.4 μL反向引物（10 μmol/L）、适量模板DNA及无核酸水。反应程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s、60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。使用美国CDC唾液链球菌标准特异性引物GTFP（Forward Primer：CACGCCATGCTGGAAGTG；Reverse Primer：GCGATGAGCCAAGCTGAAG）^［36］。配制1%琼脂糖凝胶，加入0.5 μg/mL核酸染料gel red DNA dye（碧云天），用于检测DNA片段大小和完整性。电泳条件为100 V，30 min，通过Image J量化电泳条带灰度值，并与SLEDAI评分进行Pearson相关性分析。

1.3.3 SS-EVs的提取与表征

1.3.3.1 菌株培养与EVs分离

唾液链球菌（ATCC 13419）接种于BHI液体培养基，37 ℃摇床培养至对数生长期。培养液经3 000×g离心30 min去除菌体，上清过0.22 μm滤膜后，超速离心（100 000×g，4 ℃，1 h）收集SS-EVs，PBS重悬后保存于-80 ℃。

1.3.3.2　EVs表征

纳米颗粒追踪分析（NTA）：使用NanoSight NS300分析粒径分布（稀释至10⁸ particles/mL）。透射电镜（TEM）：样本经2%磷钨酸负染色后，于Hitachi HT7800电镜观察形态。Western blotting：检测SS-EVs标志蛋白LTA，以大肠杆菌EVs（E.coli-EVs）为对照。

1.3.4 体外实验NK细胞功能分析

1.3.4.1 NK细胞分离

从健康志愿者外周血中分离NK细胞，使用Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMC），通过磁珠分选（CD56⁺ NK细胞分选试剂盒，Miltenyi Biotec）纯化NK细胞，纯度>95%（流式验证）。

1.3.4.2 受体表达检测

NK细胞与SS-EVs（1、10 μg/mL）共孵育24 h后，qPCR检测激活性受体（NKG2D、Perforin、TNF、GZMB、IL-2）及抑制性受体（NKG2A）mRNA表达。引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成（表1）。

1.3.5 体外杀伤实验

以K562、293T、RPTEC/TERT1及HK-2为靶细胞，使用羧基荧光素二乙酸酯（CFSE）标记靶细胞。将500 µL CFSE工作液加入500 µL靶细胞中，使最终浓度为0.5 µmol/L，37 ℃孵育10 min，避光处理。将NK细胞与靶细胞按不同效应靶比（E∶T）（如1∶1、2∶1、4∶1）共培养4 h。使用死细胞染料（如7-AAD）对共培养后的细胞进行染色，检测靶细胞的死亡情况。通过流式细胞仪（BD FACSCanto II）分析靶细胞的荧光强度变化，计算NK细胞的杀伤效率。

1.3.6 体内实验MRL/lpr小鼠模型

1.3.6.1 动物分组及处理

将10~12周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为PBS组、E.coli-EVs组及SS-EVs组，8只/组，3 d/次灌胃（20 μg EVs/次），持续4周。

1.3.6.2　组织病理分析

HE染色：肾脏切片经苏木精-伊红染色，评估炎症细胞浸润及肾小球病变。免疫荧光：检测Nephrin、C3、IgG及NKp44表达，共聚焦显微镜（Zeiss LSM 900）成像。血清炎症因子检测：ELISA定量IL-6、TNF-α、IL-8及CCL20（R&D Systems）。

1.3.7 统计学分析

数据以均数±标准差表示，GraphPad Prism 9.0进行统计分析。两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，相关性分析使用Pearson检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE患者肠道唾液链球菌丰度显著增加

SLE患者组与HC组在年龄与性别方面差异均无统计学意义（P>0.05，表2）。SLE组粪便样本中核酸片段主要集中于100 bp附近（图1A）。与HC组相比，SLE组样本在电泳图中表现出更高的条带灰度值，提示其肠道中唾液链球菌的丰度明显升高（P<0.0001，图1A）。SS的灰度值与SLEDAI评分呈显著正相关（R²=0.8369，图1B）。

2.2 SLE患者外周血免疫细胞亚群分布异常

流式细胞术结果显示，与HC组相比，SLE患者外周血中免疫细胞亚群的绝对数量及相对比例均发生变化（图2）。NK细胞的绝对计数（P<0.0001）及相对比例（P<0.05）下降（图2A、B）；总T细胞的绝对计数虽降低（P<0.05），但其相对比例反而升高（P<0.0001，图2C、D）。此外，CD8⁺ T细胞的相对比例升高（P<0.0001，图2E），而CD4⁺ T细胞的绝对计数明显减少（P<0.001，图2F）。

2.3 SS-EVs的物理特性及NK细胞受体调控作用

NTA结果显示，所提取囊泡粒径主要集中在100~200 nm（图3A）。透射电镜下观察到囊泡结构稳定、形态规则，多呈圆形或椭圆形杯状，表面光滑、边界清晰，具有完整的膜性结构，粒径分布于30~150 nm，展现出良好的均一性（图3B）。Western blotting检测显示囊泡表达唾液链球菌特异性标志物LTA，进一步验证其来源（图3C）。进一步功能实验发现，SS-EVs与NK细胞共培养后，可上调NK细胞表面激活性受体TNF、颗粒酶B、NKG2D、IL-2及穿孔素（Perforin）的mRNA表达水平，同时下调抑制性受体NKG2A的表达，且该调控效应呈SS-EVs浓度依赖性（图3D）。

2.4 SS-EVs增强NK细胞对靶细胞的毒性作用

SS-EVs处理组在所有4种靶细胞中均提升NK细胞的杀伤效率，明显优于E.coli-EVs对照组（P<0.05，图4A~D）。两种胞外囊泡均呈现剂量依赖性促进NK细胞毒性的趋势（图4E~G），其中SS-EVs在最高浓度（10 μg/mL）时对肾小管上皮细胞的杀伤效率相较对照组提升2.1~2.8倍（P<0.001）。

2.5 SS-EVs灌胃加重MRL/lpr小鼠肾脏病理损伤

HE染色结果显示，与PBS组及E.coli-EVs对照组相比，经口灌胃SS-EVs处理的MRL/lpr小鼠肾组织呈现显著病理改变（图5）。在SS-EVs组中，可观察到肾小球体积增大（P<0.01），同时肾皮质及血管周围炎性细胞浸润增强（P<0.001，图5A、B）。免疫荧光分析进一步显示，该组肾组织中肾小球裂隙膜蛋白Nephrin表达下调42.5%（P<0.01），补体C3沉积水平上升2.3倍（P<0.001），IgG免疫复合物沉积增加1.8倍（P<0.01，图5C）。SS-EVs处理组肾小球区域NK细胞标志物NKp44阳性细胞数目增加3.1倍（P<0.001），而凋亡相关蛋白Caspase-3表达也上调2.7倍（P<0.01，图5D）。此外，ELISA检测结果表明，SS-EVs灌胃处理的小鼠外周血中炎症因子TNF、IL-6、IL-8及CCL20的浓度高于PBS和Ecoli-EVs组（P<0.05，图5E~H）。

3 讨论

本研究首次证实，SS-EVs可显著调控NK细胞的活性，并加速SLE的疾病进展。通过整合临床数据、体外细胞实验及体内动物模型，我们发现，在易感性小鼠体内，肠道SS丰度升高、NK细胞毒性增强与肾脏病理损伤加重三者之间存在高度相关性。这一结果与既往关于SLE患者存在免疫细胞比例异常、包括CD8⁺ T细胞比例升高、NK细胞数量减少及T/B细胞比例失衡的报道相一致^{［7， 8］}。值得注意的是，SLE患者粪便中SS丰度显著升高，且与SLEDAI呈显著正相关，提示其与疾病严重程度密切相关。本研究发现，SS-EVs可通过上调TNF、IL-2、NKG2D等激活性受体，同时下调抑制性受体NKG2A的表达，促进NK细胞在体外的活化，从而显著增强NK细胞的细胞毒性。功能实验证实，经SS-EVs处理的NK细胞对肾小管上皮细胞的杀伤作用增强，且呈剂量依赖性。相比之下，大肠杆菌来源EVs未产生类似效应，提示SS-EVs在免疫调控中具有特异性。这与既往研究中胞外囊泡可作为强效免疫调节因子、在多种炎症及自身免疫疾病中发挥作用的结果一致^{［27， 37， 38］}。

体内实验进一步验证了上述发现。MRL/lpr小鼠经SS-EVs灌胃后，表现为肾脏炎性浸润加重、C3与IgG免疫复合物沉积增强、Caspase-3水平升高，同时伴随外周炎症因子（IL-6、TNF、IL-8、CCL20等）显著上调。这些现象均提示系统性炎症被放大。特别是肾组织中大量浸润的NK细胞表明，其活化不仅是继发于炎症的反应，而可能直接驱动狼疮性肾炎的终末器官损伤。

与活细菌不同，细菌来源EVs能够跨越黏膜屏障，将免疫信号传递至远端器官^{［29， 30］}。因此，本研究揭示了SS-EVs作为“菌群-宿主”通讯新形式的致病潜力，提示肠道菌群在SLE发病中不仅通过抗原模拟，还可能通过释放具有免疫活性的囊泡直接调节关键效应细胞功能。结合已有研究中SLE患者NK细胞数量和功能缺陷的报道^{［34， 35］}。本研究结果进一步强调NK细胞在SLE免疫异常中的核心地位。

综上所述，本研究提供了实验证据表明SS-EVs可增强NK细胞活性并加重狼疮性肾炎病变，揭示了肠道菌群-NK细胞-SLE之间的重要联系。这一发现不仅拓展了对SLE发病机制的理解，也提示通过调节NK细胞功能或干预细菌EV信号传导，可能成为新的治疗思路。未来研究应聚焦于解析SS-EVs中发挥免疫活化作用的关键分子，并探索其在疾病诊断、预后评估和靶向治疗中的应用潜力。SLE患者表现出免疫细胞分布紊乱，伴随肠道中SS定植水平显著升高。SS-EVs能够增强NK细胞的细胞毒性活性，并在易感狼疮小鼠体内诱发炎症性损伤，促进疾病进展。本研究为揭示SLE肠道菌群与免疫调控轴的相互作用提供了重要新视角。

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基金资助

国家自然科学基金(82002218)

国家自然科学基金(82202978)

吴阶平医学基金资助项目(320.6750.2025-6-104)

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