股骨头坏死（ONFH）是骨科领域中一种棘手且严重的疾病
［1］。其发病机制复杂，一旦患病，股骨头血供受损或中断，致使骨髓成分与骨细胞死亡
［2］。随后，股骨头结构逐渐改变、塌陷，患者会遭受髋关节疼痛的折磨，且髋关节功能严重受限，极大地降低生活质量，甚至可能导致残疾
［3， 4］。从全球范围来看，股骨头坏死的发病率呈现出逐渐上升的趋势，且好发于青壮年群体
［5， 6］。这给家庭带来沉重负担，也给社会医疗资源造成较大压力
［7， 8］。而我国股骨头坏死患者据统计约有800余万人，且每年新增病例数也逐步上升，因此同样是一个不容忽视的健康问题
［9， 10］。
饮酒作为一种在全球范围内广泛存在的社会文化行为，深深融入到人们的日常生活与社交活动中
［11］。然而，长期大量饮酒对人体健康的危害不容小觑
［12］。长期酗酒者，身体多个器官系统都会受到不同程度的损害，如肝脏、胃肠道、心血管系统以及神经系统等
［13-16］。据世界卫生组织发布的报告显示，全球每年因饮酒导致的各类疾病死亡人数高达300余万，饮酒相关疾病负担在全球疾病总负担中占据相当比例
［17， 18］。
近年来，酒精暴露与股骨头坏死之间的潜在关联逐渐受到关注。越来越多的临床研究和流行病学调查数据表明，长期大量饮酒极有可能是导致股骨头坏死的重要危险因素之一
［19， 20］。既往一些研究追踪了饮酒人群的健康状况，发现相较于不饮酒或少量饮酒者，长期大量饮酒人群中股骨头坏死的发生率显著升高
［21］。有研究指出，每周酒精摄入量超过一定阈值的人群，其股骨头坏死的发生几率相较于普通人群高出数倍
［22］。还有研究通过对非创伤性股骨头坏死患者的病因分析发现，有相当比例的患者存在长期饮酒史，这进一步暗示了酒精暴露与股骨头坏死之间存在紧密的联系
［23］。目前，酒精暴露究诱发股骨头坏死的具体的分子生物学机制以及详细的病理生理过程，尚未完全明确，仍有待进行深入探索与研究。这也凸显了开展酒精暴露与股骨头坏死潜在关系研究的紧迫性与重要性，对深入了解股骨头坏死的发病机制、制定有效的预防和治疗策略具有重要意义。
1 资料和方法
1.1 数据收集
使用关键词“Alcohol”和“Osteonecrosis of the Femoral Head”在基因表达综合数据库（GEO）进行查询，共收集到GSE20489、GSE44456以及GSE56906等酒精暴露相关3个数据集，另外收集到GSE123568、GSE74089等2个ONFH相关数据集（
表1）。
1.2 数据合并及去除批次效应
使用R软件对GSE20489、GSE44456、GSE56906等3个酒精暴露相关数据集进行合并，对GSE123568、GSE74089等2个ONFH相关数据集进行合并，使用R软件中的“sva”包中的“ComBat”函数来进行数据的批次校正
［24］。采用主成分分析确定批次去除后的数据质量。
1.3 酒精暴露及ONFH差异基因的识别
使用R软件中的“Limma”包来识别酒精暴露和ONFH的差异基因，其标准设定为|log2FC|>1.0且
P<0.05
［25］。在R软件（版本4.2.3）中使用火山图及热图对差异基因进行可视化。对酒精暴露和ONFH的差异基因取交集，使用维恩图进行可视化。使用GeneMANIA在线网站（
http：//genemania.org/）进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建，探究所获得交集基因之间的相互作用关系。
1.4 交集差异基因富集分析
使用R软件中的“org.Hs.eg.db”、“ggplot2”、“clusterProfiler”和“enrichplot”包进行基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析以及疾病本体论语义富集分析（DOSE），以P<0.05显著性差异来确定富集情况。
1.5 免疫细胞浸润分析
使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）量化每个样本中浸润免疫细胞类型的水平
［26］。这些细胞类型包括活化的B细胞、活化的CD4
+ T细胞、活化的CD8
+ T细胞等23种人类免疫细胞。本研究对酒精暴露的合并数据集以及ONFH的合并数据集进行了免疫浸润分析。
1.6 机器学习算法构建诊断模型
采用 Lasso、Ridge、Stepglm、XGBoost、随机森林（RF）、弹性网络（Enet）、广义线性模型偏最小二乘回归、广义提升回归模型、朴素贝叶斯、线性判别分析、广义线性模型提升和支持向量机等12 种机器学习算法构建诊断模型。在十折交叉验证框架内，采用这12种算法进行113种组合对ONFH合并的数据集作为训练数据集进行分析，进而进行变量选择和模型开发，使用单个数据集对模型性能进行验证。
1.7 筛选潜在靶向药物
利用Enrichr网络平台（
https：//amp.pharm.mssm.edu/enrichr/）中的药物特征数据库（DSigDB）识别可能靶向酒精暴露和ONFH病理机制的潜在药物。
1.8 实验材料与主要仪器
MC3T3-E1细胞（ATCC）；MEM α培养基（Gibco）；胎牛血清（赛维尔）；95%药用酒精（阿拉丁）；GAPDH、AHSP、CISD2、GMCL1、GMPR、PTPN12、SOAT1、ST3GAL6、UBL3等基因之正反引物（南宁捷尼斯生物科技有限公司，引物序列见
表2）；RNA提取试剂盒（诺唯赞）；逆转录试剂盒、扩增试剂盒（吐露港）；生物安全柜（青岛海尔特种电器有限公司）；电恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（普和希株式会社）；倒置显微镜（OLYMPUS）；细胞计数仪（江苏卓微生物科技有限公司）；高速冷冻离心机、超微量分光光度计（ThermoFisher）；基因扩增仪、荧光定量PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）。
1.9 采用qRT-PCR对构建诊断模型的基因进行验证
本研究采用MC3T3-E1细胞对构建模型基因进行验证。将细胞分为对照组和酒精组，对照组为正常培养基，酒精组培养基中加入酒精浓度为100 mmol/L，干预48 h
［27］。FreeZol Reagent试剂盒对两组细胞进行总RNA提取。逆转录试剂盒合成cDNA。扩增试剂盒进行扩增，根据试剂商说明书，将SYBR Green预混液与引物、样本cDNA以及无酶水按照体系混合配制，点入八联管中。然后将配制好扩增体系的八联管放入荧光定量PCR仪中，设定说明书中推荐程序并运行。采用相对定量对实验结果进行分析，以2
-△△Ct进行分析。同时，绘制构建预测模型基因在ONFH矩阵中的热图表达，观察细胞实验验证结果是否与其热图表达一致。
1.10 统计学分析
使用R软件4.2.3版本进行统计分析。两组间差异通过独立样本t检验进行比较。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 数据处理
对从GEO数据库中获得的酒精暴露相关数据集GSE20489、GSE44456、GSE56906进行合并，并去除了批次效应，进行标准化处理后，最终得到53例酒精暴露和50例对照样本的处理队列。对ONFH数据集同法进行合并整合去除批次效应，并进行标准化处理，最终得到34例ONFH样本和14例对照样本的处理队列。主成分分析结果显示校正后显著改善了不同数据集间的批次效应（
图1）。
2.2 酒精暴露与ONFH差异基因的筛选
使用“limma”包对酒精暴露及ONFH合并后的数据集进行差异基因分析（
图2）。在酒精暴露队列中，共鉴定出2242个差异基因，其中包含981个上调基因和1261个下调基因；在ONFH队列中，共鉴定出181个差异基因，其中包含61个上调基因和120个下调基因。进一步对ONFH和酒精暴露之间的差异表达基因进行韦恩图分析取交集，得到22个交集基因，剔除1个尚未正式命名的基因，最终得到21个交集基因。
2.3 与交集差异基因的富集分析
使用GeneMANIA数据库对这些交集DEGs构建了PPI网络，同时利用GO、KEGG和DO进行功能富集分析以确定潜在的作用机制（
图3）。GO富集分析显示，生物过程包括对糖脂代谢过程、脂多糖代谢过程、唾液酸化、膜脂代谢过程、寡糖代谢过程、糖脂生物合成过程、循环系统中的血管相关过程、羧酸转运、血管转运、跨血脑屏障转运等显著富集。显著富集的细胞成分包括血红蛋白复合物、纤毛根丝、核周内质网、细胞器外膜、外膜、足体、核外膜、树突干、膜筏、膜微区等。显著富集的分子功能包括唾液酸转移酶活性、SH3结构域结合、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸5-磷酸酶活性、磷脂酰肌醇三磷酸磷酸酶活性、其它含氮化合物作供体的氧化还原酶活性、丝氨酸跨膜转运蛋白活性、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基结合、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶活性、三磷酸肌醇磷酸酶活性、羧酸跨膜转运蛋白活性、有机酸跨膜转运蛋白活性等。KEGG分析则揭示了这些基因显著富集于糖鞘脂生物合成-神经节系列通路、类固醇生物合成通路、糖鞘脂生物合成-乳酰和新乳酰系列通路、糖基磷脂酰肌醇锚生物合成通路、抗叶酸耐药性通路、叶酸转运与代谢通路、粘蛋白型O-聚糖生物合成等。DO富集分析还表明，这些交集基因显著富集于继发性甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、痛风、甲状旁腺疾病、腹泻、毒性脑病、胆囊癌、消化性溃疡、癫痫持续状态、甲状腺乳头状癌、皮肤纤维组织细胞瘤、发作性共济失调、早发性阿尔茨海默病、小肠肿瘤、遗忘综合征、骨髓恶性肿瘤、骨巨细胞瘤等。
2.4 酒精暴露与ONFH的免疫细胞浸润分析
对交集差异基因的富集分析显示其与炎症和免疫过程存在显著关联。采用ssGSEA来分析酒精暴露和ONFH中免疫细胞亚群的组成（
图4）。与对照样本相比，酒精暴露样本中活化的CD4
+ T细胞的含量显著减少，而髓源抑制性细胞、单核细胞、调节性T细胞、滤泡辅助性T细胞、17型辅助性T细胞的含量显著增多；在ONFH样本中，除了活化的B细胞、活化的CD8 T细胞、嗜酸粒细胞、γδ T细胞、未成熟B细胞、未成熟树突状细胞、肥大细胞、自然杀伤T细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞等细胞峰度显著上升外，与酒精暴露样本中相似，骨髓来源抑制性细胞、调节性T细胞、滤泡辅助性T细胞、17型辅助性T细胞等的细胞含量在ONFH样本中亦呈现显著上升趋势。
2.5 识别具有诊断价值的枢纽基因并开发ONFH诊断模型
整合12种机器学习算法，采用10折交叉验证法，基于21个交集基因构建并确定稳健的诊断模型，本研究选择RF联合Enet［alpha=0.8］算法建立了稳健的诊断模型，最终确定了SOAT1、GMCL1、GMPR、CISD2、ST3GAL6、AHSP、UBL3、PTPN12等8个关键基因，基于这8个关键基因绘制了列线图，并进一步绘制了临床决策曲线和校准曲线，结果表明诊断模型性能良好（
图5）。
2.6 采用临床亚组信息进一步验证模型的可靠性
本研究进一步分析了性别这一临床特征在ONFH诊断模型中的情况，结果表明，诊断模型在女性患者亚组中表现出更强的诊断性能（
图6）。
2.7 靶向药物的筛选
利用Enrichr平台上的DSigDB药物数据库对构建模型的差异基因进行了分析，以确定潜在的靶向药物。排名前10的非代码候选药物为：丙戊酸、伏立诺他、舒必利、利福布汀、表长春胺、scriptaid、曲古抑菌素A、茴香霉素、异戊烯腺嘌呤、HC毒素等（
表3）。
2.8 构建预测模型基因的qRT-PCR结果
预测模型的基因在ONFH矩阵中的表达进行热图绘制，可见AHSP、CISD2、GMPR在ONFH中低表达（
P<0.05），而GMCL1、PTPN12、SOAT1、ST3GAL6以及UBL3在ONFH中呈现出高表达（
P<0.05，
图7）。接着，使用qRT-PCR对两组细胞进行检测并得到了验证，构建预测模型的8个基因在两组不同处理的细胞中表达差异有统计学意义，其中AHSP、CISD2以及GMPR在酒精处理组细胞中呈现低表达（
P<0.05）；而GMCL1、PTPN12、SOAT1、ST3GAL6以及UBL3在酒精处理组细胞中呈现高表达（
P<0.05，
表4）。
3 讨论
ONFH作为一种高发于青壮年的致残性骨科疾病，其发病机制复杂且临床治疗棘手，而长期大量饮酒已被证实为重要危险因素之一
［28， 29］。然而，酒精暴露诱发ONFH的分子机制尚未完全明确，缺乏可靠的早期诊断标志物和靶向治疗策略。本研究通过整合生物信息学分析与机器学习方法，系统探究了酒精暴露与ONFH的共同分子特征，构建了基于8个关键基因的诊断模型，并筛选出潜在靶向药物，为揭示酒精相关性ONFH的发病机制及临床转化提供了新视角。
本研究通过对GEO数据库中酒精暴露与ONFH相关数据集的整合分析，鉴定出21个共同DEGs，这些基因不仅是酒精暴露与ONFH的分子连接点，其功能富集结果更揭示了二者潜在的关联机制。GO富集分析显示，这些基因显著参与糖脂代谢、脂多糖代谢、血管转运等生物过程，且在血红蛋白复合物、膜微区等细胞组分中富集，提示脂质代谢紊乱和血管功能异常可能是酒精诱发ONFH的核心环节。KEGG通路分析进一步表明，糖鞘脂生物合成、类固醇生物合成等通路的异常激活可能与酒精暴露引起股骨头血供障碍密切相关，糖鞘脂作为细胞膜重要组分，其代谢异常可破坏血管内皮细胞功能，而类固醇生物合成紊乱可能通过影响骨细胞凋亡和破骨细胞活性加剧骨坏死进程，这与既往研究中酒精可通过干扰脂质代谢导致股骨头微循环障碍的结论一致
［30， 31］。此外，DO富集分析发现这些交集基因与甲状旁腺功能亢进、痛风等代谢性疾病相关，提示酒精暴露可能通过诱发系统性代谢紊乱间接促进ONFH发生；例如甲状旁腺激素异常升高可加速骨吸收，而酒精可能引起的维生素D代谢异常或可进一步放大骨吸收这一效应，导致股骨头骨结构破坏
［32， 33］。这些结果表明，酒精暴露与ONFH的分子关联并非单一通路作用，而是涉及代谢、血管、免疫等多系统的协同紊乱。
免疫微环境失衡是ONFH发病的重要机制，而本研究的免疫浸润分析揭示了酒精暴露与ONFH在免疫细胞调控上的共性与特异性。结果显示，酒精暴露样本与ONFH样本中均存在调节性T细胞、髓源抑制性细胞、滤泡辅助性T细胞等免疫细胞的显著富集，提示酒精可能通过重塑免疫微环境促进ONFH发生。调节性T细胞的增多可能与酒精诱导的免疫抑制有关，酒精暴露可促进调节性T细胞分化，而调节性T细胞过度激活会抑制效应T细胞的抗炎作用，导致股骨头局部炎症物质清除障碍，加剧骨细胞凋亡
［34-37］。同时，髓源抑制性细胞的富集可进一步放大免疫抑制效应，髓源抑制性细胞可通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子抑制免疫应答，且其产生的活性氧（ROS）可直接损伤血管内皮细胞，加重股骨头缺血
［38， 39］。值得注意的是，ONFH样本中还出现活化的B细胞、γδ T细胞等促炎细胞的升高，提示酒精暴露可能先通过免疫抑制削弱骨组织防御能力，再通过后续促炎细胞浸润引发过度炎症反应，形成“免疫失衡→缺血→骨坏死”的恶性循环，这也说明酒精暴露引起的ONFH病理机制中可能存在先天免疫与适应性免疫协同紊乱的情况
［40］。
本研究通过12种机器学习算法的113种组合筛选，最终构建了基于SOAT1、GMCL1、GMPR、CISD2、ST3GAL6、AHSP、UBL3、PTPN12等8个基因的ONFH诊断模型，其在训练集和测试集中均表现出优异性能（AUC>0.95），且在女性亚组中诊断效能更优，为酒精暴露相关ONFH的早期诊断提供了可靠工具。为了验证构建预测模型的这8个基因，首先提取了这8个基因在ONFH矩阵中的差异表达，发现AHSP、CISD2以及GMPR在股骨头坏死中低表达，而GMCL1、PTPN12、SOAT1、ST3GAL6以及UBL3在股骨头坏死中高表达，在接下来的qRT-PCR实验中进一步验证了这个结果的可靠性。深入分析8个关键基因的功能可见其与酒精性ONFH的密切关联。其中，SOAT1作为胆固醇酯合成酶，其高表达可导致股骨头髓腔内脂质蓄积，压迫血管并阻塞微循环，这可能与酒精诱导的脂质代谢异常相关
［41， 42］；CISD2作为线粒体铁硫蛋白，参与调控细胞凋亡和氧化应激，其表达异常可能通过增强酒精诱导的骨细胞线粒体损伤加速骨坏死
［43-45］；PTPN12作为非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，可通过抑制NF-κB等炎症信号通路以调节免疫反应，PTPN12下调可能加剧酒精诱发的全身炎症反应，进而出现股骨头坏死
［46， 47］。这些基因的协同变化不仅反映了酒精暴露对骨代谢、免疫、血管的多重影响，更可作为早期干预的潜在靶点。此外，诊断模型在女性亚组中表现更优的现象值得关注。女性体内雌激素水平可能通过调控如SOAT1等脂质代谢相关基因的表达影响模型效能；研究表明，雌激素可抑制SOAT1活性，而酒精对雌激素代谢的干扰可能在女性中更显著，导致相关基因表达差异更明显
［48-50］。这一发现提示，性别因素可能是酒精相关性ONFH诊断和治疗中需考虑的重要变量。
基于21个共同DEGs筛选出的10种潜在药物，为酒精相关性ONFH的靶向治疗提供了候选方案。其中，丙戊酸作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，已有研究报道其可改善体内脂质代谢
［51， 52］。而丙戊酸在本研究中与SOAT1、GMCL1的关联提示其可能通过抑制脂质蓄积和细胞凋亡缓解股骨头坏死。伏立诺他作为HDAC抑制剂，可下调如TNF-α、IL-6、PTGS2等促炎因子表达，其对SOAT1、GMPR等基因的靶向作用可能同时改善脂质紊乱和免疫失衡
［53， 54］。舒必利作为多巴胺受体拮抗剂，其与PTPN12的关联暗示其也可能通过调节免疫信号通路影响酒精暴露诱导的ONFH
［55］。这些药物的多靶点作用特性，与酒精暴露相关ONFH的多机制发病特点相匹配，为临床联合用药提供了新思路。
本研究通过整合生物信息学与机器学习，揭示了酒精暴露与ONFH的分子关联及免疫机制，构建了可靠的诊断模型并筛选出潜在药物，为酒精暴露相关性ONFH的早期诊断和靶向治疗提供了理论依据和转化基础。然而本研究的数据集样本量有限，且主要来源于血液和软骨组织，可能影响结果的代表性；尽管本研究初步通过细胞实验验证了构建模型的可靠性，但该机器学习模型和潜在药物的有效性尚需进一步通过动物模型和临床试验证实。拟在未来研究工作中扩大样本量并纳入股骨头活检组织数据，提高结果的临床相关性和应用价值。
国家自然科学基金地区科学基金项目(82160913)
国家自然科学基金地区科学基金项目(81960876)
广西壮族自治区科学技术厅广西青年科学基金项目（中医药壮瑶医药专项-广西中医药大学）(2025GXNSFBA069217)
广西中医骨伤临床医学研究中心(GXZYYXYJZX-2025-01)
京公网安备11010202008535号
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