宽缨酮靶向抑制STAT3减轻线粒体功能障碍和炎症缓解急性肾损伤

Eurycomanone inhibits renal ischemia/reperfusion-induced mitochondrial dysfunction and inflammation in mice by binding to STAT3 to inhibit its phosphorylation

摘要

目的 探究宽缨酮（EN）减轻缺血再灌注（IR）诱导的小鼠急性肾损伤（AKI）的作用机制。 方法 24只雄性C57BL/6J小鼠随机分为Sham、IR及EN低、高剂量组4组（6只/组）。双侧肾蒂IR处理构建AKI模型，EN低、高剂量组在术前2 d腹腔注射EN（0.25、1.0 mg·kg^-1·d^-1）直至组织取材前1 d。采用网络药理学分析EN作用通路和分子机制，采用分子对接分析EN与靶点的结合性能。检测小鼠肾功能、肾组织病理、肾小管损伤指标（KIM-1、NGAL）、p-STAT3、p-PI3K及p-JAK2的表达、EN与STAT3相互作用、炎症及线粒体生物发生及其功能。另将24只雄性C57BL/6J小鼠随机分为：Sham、IR、IR+EN和IR+EN+ML115（STAT3激动剂）组4组（6只/组），分析STAT3在EN减轻IR诱导的AKI中的作用机制。 结果 低、高剂量EN均减轻小鼠肾组织损伤、改善肾功能，包括降低血肌酐、尿素氮、肾小管损伤评分及下调KIM-1和NGAL的表达（P<0.05）。网络药理学分析发现EN核心靶点富集信号通路与炎症密切相关。低、高剂量EN均降低AKI小鼠肾组织炎症因子（IL-6、MCP-1、TNF-α）的水平及肾间质巨噬细胞浸润（P<0.05），增加肾组织ATP含量及线粒体DNA拷贝数（P<0.05），并上调PGC-1α、TFAM、Nrf2的基因表达以及PGC-1α、TOM20的蛋白表达（P<0.05）。基于分子对接结果筛选出STAT3和PI3K为EN减轻AKI的关键靶点。动物实验结果显示，EN抑制AKI小鼠肾组织p-STAT3和p-PI3K表达（P<0.05），但不影响p-JAK2的表达（P>0.05）。表面等离子共振实验证实EN特异性结合STAT3。ML115可逆转EN对AKI小鼠的肾功能、肾组织病理损伤、肾小管损伤及炎症反应的保护作用（P<0.05）。 结论 EN通过靶向抑制STAT3促进线粒体生物发生，减轻肾脏线粒体功能损伤及炎症反应，从而缓解IR诱导的AKI。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of eurycomanone (EN) for ameliorating ischemia/reperfusion (IR)-induced acute kidney injury (AKI) in mice. Methods Twenty-four male C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups (n=6) for sham operation, IR modeling by bilateral renal pedicle clamping, or intraperitoneal injections of EN at 0.25 or 1.0 mg/kg for two days prior to surgery. Network pharmacology and molecular docking were used to identify the potential molecular targets and signaling pathways and evaluate the binding affinities. Renal function, histopathological changes, expression of tubular injury markers (KIM-1 and NGAL), phosphorylation levels of STAT3, PI3K, and JAK2, renal inflammation, mitochondrial biogenesis, and mitochondrial function of the mice were assessed. The interaction between EN and STAT3 was examined using surface plasmon resonance (SPR). Another 24 male C57BL/6J mice receiving sham operation, IR modeling, or EN or EN+ML115 (a STAT3 agonist) treatment prior to modeling (n=6) were used to validate the role of STAT3 in EN-mediated renal protection. Results Both low- and high-dose EN significantly alleviated renal injury and improved renal function in mice with IR-induced AKI. The core targets of EN were associated with inflammation-related signaling pathways. EN treatment markedly reduced renal levels of IL-6, MCP-1, and TNF-αand decreased macrophage infiltration (F4/80-positive cells) in renal interstitial tissue of the mice. EN also significantly increased renal ATP content and mitochondrial DNA copy number (P<0.05), and upregulated the expressions of PGC-1α, TFAM, and Nrf2 mRNAs and protein levels of PGC-1α and TOM20. Molecular docking identified STAT3 and PI3K as key molecular targets of EN. In mice with IR-induced AKI, EN significantly suppressed phosphorylation of STAT3 and PI3K in the renal tissues without affecting p-JAK2 levels. SPR analysis confirmed a direct and specific interaction between EN and STAT3. Notably, activation of STAT3 by ML115 significantly reversed the renoprotective effects of EN. Conclusion EN mitigates IR-induced AKI in mice by directly binding to STAT3 to inhibit its phosphorylation, suppressing inflammation, and enhancing mitochondrial biogenesis and function, suggesting the potential of EN as a promising therapeutic candidate for IR-induced AKI.

Graphical abstract

关键词

宽缨酮 / 急性肾损伤 / 缺血再灌注 / STAT3 / 线粒体生物发生 / 炎症反应

Key words

eurycomanone / acute kidney injury / ischemia-reperfusion / STAT3 / mitochondrial biogenesis / inflammation

急性肾损伤（AKI）是一种临床常见综合征，以数小时至数天内肾功能急剧下降为特征，具有高发病率与高死亡率的特点^［1］，若早期未能有效治疗，进展为慢性肾脏病、终末期肾病甚至死亡的风险显著增加^［2］。肾脏缺血再灌注（IR）损伤是AKI的主要诱因之一，表现为肾脏缺血后血流恢复时组织损伤反而加重^［3］。研究表明，线粒体功能障碍介导的炎症反应及肾小管上皮细胞损伤，是缺血性AKI发生发展的核心病理机制^［4，5］。目前，AKI的临床治疗仍以对症支持及肾脏替代治疗为主，尚缺乏有效阻断疾病进展的特异性药物^［6］。尽管有基础研究发现生物碱、黄酮等多种天然活性成分可减轻AKI动物模型的肾损伤，但其潜在的不良反应及安全性问题限制了临床转化与应用^［7］。因此，探索安全有效的AKI治疗药物及其作用机制，成为该领域的研究重点。

宽缨酮（EN）是从传统中药东革阿里中提取的一种苦木素二萜类化合物，常作为功能性成分添加到茶、咖啡等饮品中，具有低毒、高稳定性的药理优势^［8］。研究显示，EN具有促自噬、抗氧化应激、抗炎、降脂等多种药理活性，在抗肥胖、抗肿瘤以及改善炎症性疾病等方面展现出良好的应用潜能^［9-12］。然而，EN是否对IR损伤诱导的AKI具有保护作用及其具体机制尚不明确。网络药理学基于“疾病-靶点-药物”相互作用网络，可系统预测天然化合物治疗疾病的关键作用靶点；分子对接技术则可高效评估化合物与靶标蛋白的结合模式与亲和力，为天然药物研发提供理论依据与实验方向。基于此，本研究通过构建小鼠IR损伤诱导的AKI（IR-AKI）模型，结合网络药理学、分子对接技术及动物实验验证，系统探讨EN对IR-AKI的治疗作用及其潜在机制，以期为临床AKI的新药研发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物实验

1.1.1 药物及试剂

EN（纯度≥98%，JOT-11468，成都普菲德生物技术有限公司），STAT3选择性激动剂ML115（HY-111152）、重组STAT3蛋白（MedChemExpress），血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）检测试剂盒（德荣生物），Trizol（Invitrogen），逆转录试剂盒及ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺维赞），KIM-1抗体（R&D），NGAL、PGC-1α抗体（Abcam），p-STAT3（Tyr705）、STAT3、p-PI3K、PI3K、TOM20抗体（CST），GAPDH抗体（Proteintech），F4/80抗体（Servicebid），增强型ATP检测试剂盒（碧云天），DNA提取试剂盒（天根）。

1.1.2 AKI模型构建

IR组小鼠经麻醉后，固定于恒温37.5 ℃手术操作台，沿腹正中线切开暴露双侧肾蒂，微型显微血管夹钳夹肾蒂使肾脏缺血30 min，取下血管夹待肾脏恢复血流后，逐层缝合切口。假手术组除不进行缺血处理，其余操作相同。各组小鼠均于造模后24 h收集肾脏组织及血液标本。

1.1.3 动物分组与给药方法

24只雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，体质量20~25 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司）饲养于温度22~24 ℃、相对湿度50%~60%、12 h昼夜节律的环境中，自由饮水进食。适应性饲养1周后进行实验。将小鼠随机分为4组（6只/组）：假手术组（Sham）、IR组、IR+低剂量EN组（IR+EN-L）和IR+高剂量EN组（IR+EN-H）。EN给药剂量参考既往文献［8］并结合本课题组预实验结果确定。IR+低剂量EN组及IR+高剂量EN组小鼠分别于术前2 d腹腔注射EN（0.25 mg/kg、1.0 mg/kg，1次/d）后给予IR处理，Sham组和IR组腹腔注射等体积对照剂后分别给予假手术或IR处理。为验证EN通过靶向STAT3减轻AKI，另将24只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组（6只/组）：Sham组、IR组、EN干预IR组（IR+EN）以及EN联合STAT3激动剂ML115干预IR组（IR+EN+ML115）。IR+EN组小鼠于术前2 d腹腔注射EN（1.0 mg/kg，1次/d）后给予IR处理，IR+EN+ML115组小鼠则在腹腔注射ML115（1 mg/kg，1次/d）2 h后，腹腔注射等量EN，随后进行IR处理。本研究经湘南学院伦理委员会审查批准（伦理批号：2022DWLL025）。

1.1.4 肾功能检测

将收集的小鼠血液样本室温静置2 h后，3000 r/min离心10 min，收集上层血清。采用全自动生化分析仪（BECKMAN）检测SCr和BUN水平。

1.1.5 肾脏组织病理染色

小鼠肾组织经4%多聚甲醛固定、脱水、包埋后，制备2 μm石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，流水冲洗后行苏木精­伊红（HE）染色，并于正置光学显微镜（Nikon）下观察拍照。肾小管损伤定义为刷状缘缺失、管腔扩张、管型形成及细胞溶解^［13］。通过半定量评分法评估肾小管损伤程度。

1.1.6 Western blotting

使用RIPA裂解液从肾脏组织中提取蛋白并进行BCA蛋白浓度测定。等量蛋白经变性处理后，使用SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移至聚偏氟乙烯膜上；5%脱脂奶粉于室温封闭1 h后，4 ℃条件下孵育一抗过夜，包括KIM-1（1∶1000）、NGAL（1∶1000）、PGC-1α（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）、STAT3（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、TOM20（1∶2000）及GAPDH（1∶3000）。次日，用 HRP 偶联的二抗［Goat Anti-Rabbit IgG （H+L） HRP 和Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP，1∶5000）室温孵育1 h。使用化学发光成像系统曝光显影，ImageJ软件分析蛋白质条带灰度值。

1.1.7 实时定量PCR（qRT-PCR）

应用Trizol从肾脏组织中提取总RNA，900 ng RNA用逆转录试剂盒逆合成cDNA。采用ChamQ Universal SYBR Green qPCR MasterMix试剂在LightCycler®96系统进行实时荧光定量PCR分析。以GAPDH为内参基因，2^-△△CT方法计算各基因 mRNA相对表达水平。所有引物由上海生工生物科技有限公司设计合成，引物序列（表1）。

1.1.8 免疫荧光染色检测

小鼠肾组织4 μm的石蜡切片脱蜡至水；柠檬酸钠抗原修复20 min，0.3% TritionX-100室温通透15 min，5%山羊血清室温封闭1 h；滴加F4/80一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜；然后滴加将荧光标记的AlexaFluor488偶联抗兔 IgG二抗（1∶200）室温避光孵育1 h，PBS洗涤后进行DAPI复染；使用抗荧光猝灭封片剂封片。于正置荧光显微镜（Nikon）进行观察拍照。

1.1.9 组织ATP含量测定

使用肾脏组织ATP检测试剂盒，按照说明书操作方法，检测各组小鼠肾组织ATP的含量。

1.1.10 mtDNA拷贝数检测

使用DNA提取试剂盒提取肾脏组织总DNA，微量核酸蛋白测定仪（Quawell）测定DNA 浓度。取50 ng的DNA为模板在LightCycler®96系统进行实时定量PCR检测分析。以核糖体蛋白S18为内参基因，校正线粒体基因NADH脱氢酶1（ND1）的荧光强度，通过ΔΔCT法计算ND1/S18的比值，以此分析各组肾脏组织mtDNA的拷贝数变化。

1.2 网络药理学方法

1.2.1 EN改善IR-AKI的核心靶点获取

通过Super-PRED网站预测EN的潜在靶点；在Genecards网站分别以“ischemia-reperfusion”和“acute kidney injury”为检索词获取疾病相关靶点。通过绘制靶点维恩图获得EN与IR、AKI靶点的交集，作为EN改善IR-AKI的潜在核心靶点进行后续分析。

1.2.2 GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库对上述交集靶点进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设定物种为“人类”，以P<0.05为标准筛选富集条目和通路。

1.2.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络

将交集靶点导入STRING数据库，设定物种为“Homo spaiens”，置信度阈值>0.7，并删除不连续节点，构建PPI网络。随后，将数据导入Cytoscape3.9.1软件，使用Network Analyzer工具进行网络拓扑分析，根据节点度值等拓扑参数筛选关键靶点。

1.2.4 构建“化合物-核心靶点”（C-T）网络

在Cytoscape3.9.1软件中，以EN、及筛选出的核心靶点为节点，以其相互作用为边，构建“C-T”网络模型，并进行拓扑分析。节点大小和颜色深度（红色）代表靶点度值大小，度值越高提示该靶点成为EN改善IR-AKI靶点的可能性越大。

1.3 分子对接

基于上述分析，将EN与度值排序前20的蛋白靶点进行分子对接。从UniProt 数据库获取各靶点蛋白的三维结构，并从PubChem数据库获取EN的SDF结构文件。使用AutoDockTools1.5.6软件对配体EN进行可旋转键设置，并为受体蛋白添加极性氢原子。利用ProteinPlus服务器（Zentrum für Bioinformatik： Universität Hamburg-pProteins Plus Server）预测各蛋白的可能结合口袋。采用AutoDock Vina-1.1.2［AutoDock Vina-molecular docking and virtual screening program （scripps.edu）］评估结合自由能（kcal/mol），并使用Pymol软件对对接结果进行可视化展示。

1.4 表面等离子共振（SPR）

采用配备CM5传感芯片的Biacore T200系统（GE Healthcare），在25 ℃恒温条件下进行。具体流程：以10 μL/min流速注入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液（GE Healthcare）激活芯片通道；将STAT3蛋白溶于醋酸钠缓冲液（50 μg/mL），以10 μL/min流速偶联至活化通道；注入1 mol/L乙醇胺溶液（10 μL/min，持续420 s）封闭未结合位点；相邻通道经相同活化/封闭处理后，固定pH=5.0 PBS缓冲液作为空白参照；将浓度梯度的EN化合物溶液以10 μL/min流速进样150 s，实时监测结合信号；采用10 mmol/L甘氨酸-HCl（pH 2.0）再生溶液清洗5 min恢复芯片基线，循环执行直至完成所有浓度测试。使用Biacore Insight评估软件（Cytiva）扣除参比通道信号，将结合曲线通过全局拟合至1∶1 Langmuir结合模型，获得结合和解离常数。

1.5 统计学分析

采用GraphPad Prism 9 软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，方差齐时使用LSD法进行事后多重比较；若方差不齐则选用Dunnett's T₃法进行校正分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EN减轻IR-AKI小鼠肾损伤

基于IR诱导的AKI小鼠模型给予低、高剂量EN进行干预（图1A）。血生化结果显示，与Sham组相比，IR组Scr和BUN水平升高，低、高剂量EN干预组SCr和BUN水平较IR组降低（P<0.05，图1B、C）。HE染色显示，与Sham组相比，IR组肾小管损伤严重，表现为刷状缘缺失、肾小管扩张和管型形成、肾小管损伤评分升高，低、高剂量EN干预组肾小管损伤评分较IR组降低（P<0.05，图1D、E）。qRT-PCR和Western blotting结果显示，IR组肾组织中KIM-1和NGAL的表达水平高于Sham组，低、高剂量EN干预组KIM-1和NGAL的表达量较IR组降低（P<0.05，图1F~J）。

2.2 GO功能富集和KEGG通路富集分析

将EN（结构式如图2A）的靶点与IR、AKI的靶点进行交集分析，共得到98个交集靶点（图2B）。交集靶点的GO功能富集分析共得到1254条信号通路，其中生物过程1090条，细胞组分41条，分子功能113条，靶基因涉及生物过程包括血液凝固、细胞对肽的反应、活性氧代谢等，根据P值排序前10位的GO条目（图2C~E）。交集靶点的KEGG通路共富集到124条通路，其中多条通路与炎症密切相关，包括中性粒细胞胞外陷阱形成、趋化因子信号通路、JAK-STAT信号通路以及TNF信号通路等（图2F）。

2.3 EN抑制IR-AKI小鼠肾脏炎症

qRT-PCR结果显示，与Sham组相比，IR组肾组织促炎细胞因子MCP-1、TNF-α及IL-6的mRNA水平升高，低、高剂量EN干预组肾组织促炎因子mRNA水平较IR组降低（P<0.05，图3A~C）。免疫荧光染色结果显示，与Sham组相比，IR组肾间质F4/80阳性细胞数量增加，低、高剂量EN干预组肾间质F4/80阳性细胞数量较IR组减少，其中高剂量组减少程度更明显（P<0.05，图3D、E）。

2.4 EN通过促进线粒体生物发生改善IR-AKI小鼠肾脏线粒体功能

与Sham组相比，IR组肾组织ATP含量降低，低、高剂量EN干预组ATP含量较IR组均升高（P<0.05，图4A）。qRT-PCR结果显示，与Sham组相比，IR组肾组织mtDNA拷贝数以及PGC-1α、TFAM和Nrf2的mRNA表达水平降低，低、高剂量EN干预组肾组织mtDNA拷贝数以及PGC-1α、TFAM和Nrf2的mRNA表达水平均高于IR组（P<0.05，图4B~E）。Western blotting结果显示，与Sham组相比，IR组肾组织PGC-1α、TOM20的蛋白表达水平降低，而低、高剂量EN干预组肾组织PGC-1α、TOM20的蛋白表达水平高于IR组（P<0.05，图4F~H）。

2.5 EN改善IR-AKI小鼠肾损伤的关键靶点筛选

PPI网络包含73个节点和161条相互作用边。拓扑学分析显示，信号转导与转录激活因子3（STAT3）的度值最高（连接46个蛋白），其次为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）亚基：PIK3CA（28个连接蛋白）、PIK3R1（26个）、PIK3CD（24个）及PIK3CB（24个）（图5A）。C-T网络图显示，按度值大小排序获得EN抗IR-AKI靶点包括STAT3和PI3K亚基（图5B）。

2.6 EN与核心靶点的分子对接

将EN与从PPI网络中筛选degree值排序前20的核心靶点进行分子对接，所有靶点的结合能均小于-5.0 kcal/mol（表2）。应用Pymol将EN与STAT3及PI3K亚基（包括PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG及PIK3R1）的分子对接进行可视化（图6）。

2.7 EN直接靶向STAT3并抑制其磷酸化

Western blotting结果显示，与Sham组相比，IR组肾组织p-STAT3、p-PI3K及p-JAK2的蛋白表达水平升高，低、高剂量EN干预组肾组织p-STAT3、p-PI3K蛋白表达水平较IR组降低（P<0.05，图7A~C），但p-JAK2的蛋白表达无变化（P>0.05，图7D、E）。SPR分析显示，EN与STAT3发生特异性结合（结合平衡常数KD=5.82 μmol/L，图7F）。

2.8 STAT3激动剂ML115能够逆转EN对IR-AKI小鼠的肾损伤及炎症反应

血生化结果显示，与IR+EN组相比，IR+EN+ML115组Scr和BUN水平升高（P<0.05，图8A、B）。HE染色显示，与IR+EN组相比，IR+EN+ML115组肾小管损伤更严重，肾小管损伤评分增高（P<0.05，图8C、D）。qRT-PCR和Western blotting结果显示，IR+EN+ML115组肾组织中KIM-1和NGAL的表达水平高于IR+EN组（P<0.05，图8E~I）。ML115逆转了EN对肾脏促炎因子 MCP-1、TNF-α及IL-6 mRNA 表达的抑制作用（P<0.05，图8J~L）。

3 讨论

IR损伤是AKI的主要诱因之一，可引发肾脏线粒体损伤、炎症反应、肾小管细胞损伤等一系列病理生理改变^［14］。目前，针对IR-AKI仍缺乏有效的临床治疗手段，导致患者预后不佳^［15］。本研究发现，EN可改善IR-AKI模型小鼠的肾功能与肾组织病理损伤，减轻肾小管损伤程度及肾脏炎症反应，促进线粒体生物发生并改善线粒体功能障碍，直接靶向结合STAT3并抑制其磷酸化激活；STAT3激动剂ML115可逆转EN对IR-AKI的保护作用。这一发现不仅为EN作为AKI治疗药物提供了新的理论依据，也进一步证实了抑制STAT3活性在AKI肾脏保护中的关键作用。

炎症反应是IR-AKI的核心病理环节之一，IR损伤后，肾小管上皮细胞释放多种细胞因子与趋化因子，募集巨噬细胞等炎症细胞浸润肾间质，从而触发并加剧肾脏炎症^［16］。既往研究表明，EN可通过抑制核因子κB（NF-κB）通路、减少炎症细胞因子释放发挥抗炎作用^{［17， 18］}，但其在IR-AKI肾脏中的抗炎效应尚不明确。本研究通过网络药理学KEGG富集分析发现，EN改善IR-AKI的核心靶点显著富集于炎症相关信号通路。动物实验进一步证实，低、高剂量EN干预均下调IR-AKI小鼠肾组织中促炎因子（TNF-α、MCP-1、IL-6）的基因表达水平。此外，肾脏F4/80免疫荧光染色结果显示，EN呈剂量依赖性减少肾间质巨噬细胞浸润。以上结果表明，EN可通过抑制促炎因子的水平及炎症细胞的聚集，减轻IR-AKI小鼠肾脏炎症反应。

线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能障碍在IR-AKI的发生发展中起关键作用。IR损伤早期即可破坏线粒体稳态，导致ATP生成减少，进而释放损伤相关分子（DAMPs），激活炎症反应^{［14， 19］}。线粒体生物发生是维持线粒体稳态的重要机制，通过生成新的功能性线粒体以补充ATP，其核心调控因子为过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）^［20］。AKI早期，PGC-1α的转录活性受抑制，导致线粒体生物发生受阻、稳态失衡，从而促进肾脏炎症^［21］。本研究发现，EN预处理可剂量依赖性地增加IR-AKI小鼠肾组织ATP含量与mtDNA拷贝数，上调线粒体生物发生相关标志物PGC-1α、线粒体转录因子A（TFAM）及核呼吸因子-2（Nrf2）的基因表达，并增加PGC-1α和线粒体外膜转位酶（TOM20）的蛋白表达。上述结果提示，EN可通过上调PGC-1α表达促进线粒体生物发生，从而改善IR损伤所致的线粒体功能障碍。

为明确EN减轻IR-AKI肾损伤的分子靶点，本研究通过网络药理学的PPI、C-T网络拓扑分析与分子对接验证，筛选出STAT3和PI3K作为EN改善IR-AKI 的核心靶点。STAT3是一种多功能转录因子，其酪氨酸705位点（Tyr705）磷酸化激活后可入核调控下游炎症因子的表达，参与炎症反应等多种生物学过程^［22］。目前，STAT3磷酸化在IR-AKI中的作用仍存争议，不同研究对其活化状态与肾脏保护或损伤的关系报道不一致。有研究显示依达拉奉通过抑制STAT3磷酸化减轻IR-AKI小鼠肾脏线粒体功能障碍与细胞凋亡^［23］；有研究显示芹菜素通过激活JAK2/STAT3信号通路缓解IR-AKI大鼠肾小管上皮细胞凋亡及组织炎症^［24］；也有研究报道IL-22可通过激活近端小管上皮细胞中STAT3与Akt信号抑制细胞凋亡与炎症，从而改善IR-AKI^［25］。本研究免疫印迹检测结果显示，IR-AKI小鼠肾组织STAT3（Tyr705）磷酸化水平升高，而低、高剂量EN干预均可降低其磷酸化水平。进一步研究结果表明，STAT3激动剂ML115可逆转EN对IR-AKI小鼠肾功能、肾组织病理损伤、肾小管损伤以及炎症反应的保护作用。该结果支持抑制STAT3活化可缓解IR-AKI的观点。上述不一致的研究结果提示，STAT3磷酸化在AKI中的作用可能并非简单的“促损伤”或“保护性”，而是一个依赖于细胞类型及上下游信号网络协同调控的动态过程。另一方面，PI3K作为关键脂质激酶，在细胞凋亡、增殖与存活中起重要调控作用^［26］。既往研究表明，胃泌素和红景天苷可通过促进PI3K磷酸化，抑制肾小管上皮细胞铁死亡和凋亡，从而缓解IR-AKI^{［27， 28］}。本研究同样发现，IR-AKI小鼠肾组织PI3K磷酸化水平升高，而EN干预可剂量依赖性地逆转该现象。该结果与有学者在TNF-α刺激的Jurkat细胞中报道的“EN不影响PI3K/AKT通路”的结论^［18］存在差异，提示EN对PI3K/AKT信号通路的调控可能具有细胞类型和疾病背景依赖性。因此，EN主要通过抑制STAT3通路，而非激活PI3K通路，减轻IR-AKI过程中的肾脏线粒体功能障碍、炎症反应及肾小管上皮细胞损伤。

STAT3的药理学抑制可通过干预其上游激酶（如JAK2）或直接靶向STAT3蛋白本身实现^［29］。马钱子苷通过抑制JAK2磷酸化阻断STAT3的磷酸化激活，从而减轻缺血性AKI肾脏炎症、细胞凋亡和氧化应激^［30］；抑制剂Stattic可直接结合STAT3的SRC同源2结构域，抑制其磷酸化，进而减轻IR-AKI小鼠肾脏炎症与凋亡^［31］。为进一步阐明EN抑制STAT3磷酸化的机制，本研究首先检测了EN对缺血性AKI肾组织JAK2磷酸化水平的影响。结果显示，IR组肾脏组织磷酸化JAK2（p-JAK2）的表达水平较对照组升高，而EN干预并未降低p-JAK2表达。SPR实验进一步证实，EN与STAT3存在直接相互作用。以上结果表明，EN可能通过直接作用于STAT3、而非经由JAK2抑制，阻断STAT3的磷酸化激活。研究显示与靶向上游调控因子相比，直接靶向STAT3的抑制剂在降低脱靶效应和提高临床活性方面更具优势^［29］。然而，目前已开发的STAT3抑制剂仍面临药代动力学性质不佳和耐受性有限等问题^{［32， 33］}。因此，开发具有更优临床适用性的直接STAT3抑制剂具有重要意义。有研究指出，EN具备良好的类药特性与ADMET属性，包括较高的血浆稳定性、较低的血浆蛋白结合率及优异的代谢稳定性^［8］，提示EN在治疗STAT3失调相关疾病中具有广阔的临床转化前景。

本研究仍存在一定局限性：首先，本研究未能采用Seahorse能量代谢分析系统实时监测EN对线粒体呼吸功能的影响，缺乏对线粒体氧化磷酸化过程的动态评估；其次，虽然本研究通过特异性抗体证实EN抑制STAT3 Tyr705位点的磷酸化，但尚未通过点突变或免疫共沉淀等手段系统验证EN对STAT3不同磷酸化位点的特异性作用；最后，研究主要集中于动物实验，尚未在细胞水平（如HK-2或原代肾小管上皮细胞）建立缺氧/复氧模型，未能实现体内外数据的相互佐证。未来研究将围绕上述实验展开，以进一步深入阐明EN减轻IR-AKI的分子机制，提升研究的完整性与说服力。

综上所述，本研究通过网络药理学、分子对接及动物实验首次阐明了EN通过直接靶向结合STAT3并抑制其磷酸化激活，促进线粒体生物发生，从而减轻肾脏线粒体功能损伤和炎症反应，进而缓解IR诱导的AKI。本研究不仅拓宽了EN抗IR诱导AKI的新药理作用，也为临床AKI的靶向治疗提供了新的候选药物与理论依据。

参考文献

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基金资助

湖南省自然科学基金青年项目(2023JJ40609)

湖南省教育厅科学研究重点项目(23A0596)

湖南省科技厅创新型省份专项郴州产业要素科技创新服务建设平台项目(22sfq51)

生物医药产业化中试技术研发公共服务平台(4692201)

湘南学院-郴州产业技术研究院科技与成果转化平台建设(2023sfq10)

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