清肾颗粒通过调控糖酵解重编程及组蛋白 H3K18 乳酸化减轻小鼠肾纤维化

Qingshen Granules inhibits renal fibrosis in mice by regulating glycolytic reprogramming and H3K18 lactylation

摘要

目的 探讨清肾颗粒对叶酸诱导的肾纤维化小鼠模型及转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的HK-2细胞的作用及其调控糖酵解重编程、乳酸累积和组蛋白 H3K18 乳酸化的机制。 方法 构建叶酸诱导的肾纤维化小鼠模型，分为正常组、模型组和清肾颗粒组（4.0 g·kg^-1·d^-1），6只/组，灌胃4周。HE 和 Masson 染色观察肾组织病理；Western blotting检测肾组织纤维化标志（α-SMA、FN、E-cad）、糖酵解关键蛋白（HIF-1α、HK2、PFKM、PKM2、LDHA）及组蛋白乳酸化相关蛋白（Pan Kla、H3/H4 乳酸化位点）表达；免疫荧光检测 α-SMA、FN、E-cad、LDHA、H3K18la表达；ELISA检测血清肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）；比色法检测肾组织乳酸含量。细胞实验：构建TGF-β1刺激下的HK-2细胞模型，SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验，分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。CCK-8测细胞活力，EdU染色检测增殖；Western blotting检测细胞内 α-SMA、E-cad、LDHA、H3K18la表达；Seahorse XFe96 检测细胞外氧耗率 （OCR）和细胞外酸化率（ECAR）；比色法检测细胞内乳酸含量。 结果 肾脏病理检查提示，与模型组相比，清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化（P<0.05）。与模型组相比，清肾颗粒组小鼠肾组织中α-SMA、FN、HIF-1α、HK2、PFKM、PKM2、LDHA、Pan Kla、H3K18la 表达均显著减少，E-cad 表达显著增加（P<0.05）。与模型组相比，清肾颗粒组肾组织内 α-SMA、FN、LDHA 表达显著减少，E-cad 表达显著增加（P<0.05），且LDHA与H3K18la在肾小管的共定位水平降低。此外，与模型组相比，清肾颗粒组小鼠血清 Scr、BUN 水平及肾组织内乳酸含量均显著降低（P<0.05）。细胞实验中，与模型组相比，清肾颗粒含药血清提高细胞活力、促进细胞增殖（P<0.05）。与模型组相比，清肾颗粒含药血清组细胞内α-SMA、LDHA、H3K18la 表达减少（P<0.05）；同时显著提高细胞外OCR、降低ECAR，减少细胞内乳酸含量（P<0.05）。外源性补充乳酸后，与清肾颗粒含药血清组相比，细胞内LDHA、H3K18la及α-SMA的抑制作用被显著逆转（P<0.05）。 结论 清肾颗粒通过调控糖酵解重编程、减少乳酸堆积及抑制组蛋白H3K18乳酸化，发挥减轻肾纤维化的作用。

Abstract

Objective To investigate the effects of Qingshen Granules (QSG) on folic acid (FA)-induced renal fibrosis in mice and TGF-β1-stimulated HK-2 cells and the underlying mechanism. Methods A mouse model of FA-induced renal fibrosis were treated daily with QSG at 4.0 g·kg^-¹ via gavage for 4 weeks. Renal histopathological changes were evaluated using HE and Masson staining, and renal expressions of fibrosis markers, key glycolytic pathway proteins, and histone lactylation-related proteins (Pan Kla, and lactylation sites of H3/H4) were detected using Western blotting. Renal expressions of α-SMA, FN, E-cad, LDHA, and H3K18 lactylation (H3K18la) were also examined with immunofluorescence staining. Serum creatinine (SCR) and blood urea nitrogen (BUN) were measured by ELISA, and renal lactate content was determined with colorimetric assay. In HK-2 cells stimulated with TGF-β1, the effects of QSG-medicated serum from SD rats on cell viability, proliferation, protein expressions of α‑SMA, E-cad, LDHA, and H3K18la, extracellular oxygen consumption rate (OCR), extracellular acidification rate (ECAR), and intracellular lactate levels were analyzed. Results The mouse models of renal fibrosis showed increased renal expressions of α‑SMA, FN, HIF-1α, HK2, PFKM, PKM2, LDHA, Pan Kla, and H3K18la, elevated serum SCR and BUN and renal lactate level, and decreased E-cad expression. QSG treatment effectively reversed these changes and alleviated renal fibrosis in the mouse models. Immunofluorescence staining showed that QSG treatment significantly reversed the elevation of renal α‑SMA, FN and LDHA expressions and reduction of LDHA/H3K18la co-localization, and enhanced E-cad expression. In HK-2 cells, TGF‑β1 treatment significantly reduced cell viability, proliferation and OCR, and increased ECAR, lactate, α‑SMA, LDHA, and H3K18la, which were all reversed by treatment with QSG-medicated serum. Exogenous lactate obviously reversed the inhibitory effects of QSG on these proteins. Conclusion QSG alleviates renal fibrosis in mice by modulating glycolytic reprogramming, reducing lactate accumulation, and inhibiting H3K18la.

Graphical abstract

关键词

清肾颗粒 / 糖酵解重编程 / 组蛋白乳酸化 / 肾纤维化

Key words

Qingshen Granules / glycolytic reprogra-mming / histone lactylation / renal fibrosis

慢性肾脏病（CKD）是由各种原因引起的肾脏结构或者功能异常，并且持续时间超过3个月^［1］。最近的调查显示，中国CKD患病率为8.2%，约8200万成人受此影响^［2］。肾纤维化是CKD进展至终末期肾衰竭的共同病理基础，其核心特征包括肾小管上皮细胞损伤、细胞外基质过度沉积及成纤维细胞异常活化^［3］。

尽管TGF-β1/Smad通路的激活被公认为纤维化的关键驱动因素，但代谢重编程在肾纤维化中的作用近年来逐渐受到关注^{［4， 5］}。研究表明，肾小管上皮细胞在纤维化过程中会发生能量代谢模式转换，从脂肪酸氧化转向糖酵解，这一过程被称为“糖酵解重编程”^{［6， 7］}。这种代谢模式的异常转换使糖酵解途径的终产物乳酸无法及时代谢而大量堆积。而乳酸的堆积并非仅为代谢产物的被动蓄积，其更可作为信号分子参与病理过程的调控——组蛋白乳酸化是2019年发现的一种新型表观遗传修饰，通过对组蛋白赖氨酸残基进行修饰，可松弛染色质结构，从而促进特定基因的转录表达^［8］。值得注意的是，乳酸通过介导组蛋白乳酸化修饰参与纤维化基因的表达，影响肾纤维化进程^［9］。

CKD 病程迁延难愈，中医认为湿热与瘀血贯穿始终，本课题组前期研究发现，具有清热化湿祛瘀功效的清肾颗粒可延缓肾纤维化，单中心及多中心临床研究已证实其对CKD湿热证患者的有效性和安全性^{［10， 11］}。实验研究证明清肾颗粒可通过抗炎、抗氧化改善肾纤维化^［12-15］。然而，其是否通过调控糖酵解重编程及组蛋白乳酸化发挥作用尚未明确。因此，本研究通过构建体内和体外实验模型，探究清肾颗粒是否通过调控糖酵解重编程及组蛋白乳酸化发挥抗肾纤维化作用，进而阐明其改善 CKD 病程的深层分子机制，为临床优化清肾颗粒的应用及CKD的靶向治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 实验动物

8周龄C57BL/6J小鼠（20~25 g），购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK（苏）2023-0009。8周龄SPF级雄性SD大鼠（180~220 g），购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK（苏）2020-0005。动物实验方案经安徽中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批号：AZYFY-2025-3003）。

1.1.2 实验细胞

人肾近曲小管上皮细胞系（HK-2，上海赛百慷生物技术股份有限公司）。

1.1.3 药物

叶酸、碳酸氢钠、乳酸（MCE），清肾颗粒（10 g/包，安徽中医药大学第一附属医院制剂室，皖药制字：BZ20080011，批号：20210215）由茵陈、丹参、大黄、白花蛇舌草、白术、猪苓、茯苓、白蔻仁、扁豆、薏苡仁、泽泻、黄连、益母草、车前草组成。

1.1.4 主要试剂

苏木素染液、醇溶伊红染液（BaSO），Masson三色染色试剂盒（Leagene），ELISA试剂盒（Njjcbio），L-乳酸比色法测试盒（Elabscience）。山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠IgG（Zs-BIO），α-SMA、Fibronectin、HIF-1α、LDHA、E-cadherin（Affinity），PFKM、HK2、PKM2、Pan KLA（HUABIO），H3K9LA、H3K14LA、H3K18LA、H3K23LA、H3K56LA、H4K5LA、H4K8LA、H4K12LA、H4K16LA（PTMBIO），H3、β-actin（Zs-BIO）。

1.1.5 主要仪器

生物组织包埋机（湖北亚光），病理切片仪（Leica），荧光定量PCR仪（ABI），显微镜（OLYMPUS），Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪（Agilent Technologies）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模

8周龄C57BL/6J小鼠饲养于标准环境中，适应性饲养1周。1周后以单纯随机抽样，随机分为3组：正常组（Vehicle组）、叶酸模型组（FA组）和清肾颗粒治疗组（QSG组），6只/组。模型组与清肾颗粒组通过单次腹腔注射叶酸建立肾纤维化模型，叶酸剂量为250 mg/kg，溶于0.3 mol/L碳酸氢钠。正常组小鼠在称质量后腹腔注射等体积0.3 mol/L碳酸氢钠作为对照。清肾颗粒组自造模首日起开始给予清肾颗粒灌胃，剂量为4 g·kg^-1·d^-1），连续给药4周。正常组与模型组同时给予等体积生理盐水灌胃。4周后，对所有实验动物进行称重和麻醉，采集血样，实施安乐死，并完整剖取双侧肾脏组织。所有实验结束后，动物尸体集中装袋，送至安徽中医药大学科研实验中心按照医疗废物处理规定统一处置。

1.2.2 含药血清制备

健康雄性SPF级SD大鼠20只进行适应性喂养7 d，随机分为空白组和药物组，10只/组。药物组的大鼠给予清肾颗粒8 g·kg^-1·d^-1灌胃，1次/d，持续给药10 d后处死动物，经腹主动脉采血，常温静置2 h后，3000 r/min 离心15 min，分离血清后混合均匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，56 ℃水浴灭活 30 min，置-80 ℃保存备用。空白组动物给予等量生理盐水灌胃，并按上法制备大鼠空白血清。

1.2.3 HE和Masson染色

小鼠肾组织石蜡包埋切片按照制造商的操作规程，用苏木素和伊红进行HE染色。胶原纤维化通过Masson 三色染色试剂盒检测，每张切片随机选取3个视野，使用光学显微镜拍摄图像，胶原纤维区域的百分比通过Image J软件进行定量分析。

1.2.4 Western blotting法检测肾组织和细胞中相关蛋白 肾组织或细胞用含蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液裂解，经 SDS-PAGE分离后转移至聚偏氟乙烯膜上。膜与一抗（α-SMA 1∶500，Fibronectin 1∶500，E-cadherin 1∶500，PFKM 1∶500，HK2 1∶1000，HIF-1α 1∶500，PKM2 1∶1000，LDHA 1∶500，Pan KLA 1∶500，H3K9LA 1∶500，H3K14LA 1∶500，H3K18LA 1∶2000，H3K23LA 1∶500，H3K56LA 1∶500、H4K5LA 1∶1000，H4K8LA 1∶1000，H4K12LA 1∶1000，H4K16LA 1∶1000，H3 1∶500，β-actin 1∶1000）在4 ℃条件下孵育过夜，再用酶标二抗 （1∶10 000）处理。通过Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

1.2.5 免疫荧光染色

小鼠肾组织石蜡包埋切片后，进行脱蜡、再水化、抗原修复处理。然后与特定一抗（α‑SMA 1∶200，Fibronectin 1∶200，LDHA 1∶200， H3K18LA 1∶100）孵育，均在 4 ℃孵育过夜；荧光二抗（1∶500）检测特异性信号，细胞核在室温下用 DAPI复染 10 min。所有图像通过荧光显微镜拍摄，并采用先前描述的方法进行定量分析。

1.2.6 乳酸含量测定

冷冻后的肾脏组织或细胞在冰上用磷酸盐缓冲液（PBS）匀浆，然后以12 000 r/min在4 ℃条件下离心15 min。收集上清液，按照厂家说明使用L-乳酸比色法测试盒进行检测。

1.2.7 细胞活力测定

各组细胞正常消化后用培养基重悬至密度1×10⁵/mL，混匀后每孔接种100 μL至培养板，于5% CO₂、37 ℃培养箱中过夜培养。实验分两阶段筛选：第1阶段为安全浓度范围筛选，设6个含药血清浓度梯度（5%、10%、20%、30%、40%、50%），对照组为含正常血清的 DMEM 培养基，各组连续培养 48 h。第2阶段为最佳干预浓度筛选，取第1阶段确定的安全浓度（5%、10%、20%），先以对应浓度含药血清预处理细胞 24 h，再换含 10 ng/mL TGF-β1 的培养基共处理 24 h。两阶段均于处理结束后每孔加入10 μL CCK-8，孵育 1 h 后通过酶标仪检测吸光值A_{450 nm}，同步设置调零孔和阴性对照孔，最终筛选出含药血清的最佳浓度为20%。

1.2.8 EdU增殖试验

处理后的各组细胞加入10 μmol/L EdU 溶液，按试剂盒说明孵育 2 h。随后经固定、通透处理，加入含荧光探针的 EdU 检测反应液进行点击化学反应，同时用 DAPI 染核。荧光下，EdU 阳性增殖细胞呈绿色，细胞核呈蓝色。计算每个视野中 EdU 阳性细胞数与 DAPI 标记总细胞数的比值，确定其相对比例。

1.2.9 细胞培养与处理

HK-2细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）及1%青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，培养条件为 37 ℃、5% CO₂。细胞接种于6孔板，过夜贴壁后分组干预，正常组（Ctrl组）：以含正常血清的 DMEM 培养基连续培养48 h；模型组（TGF-β1组）：经10 ng/mL TGF-β1处理24 h后换DMEM 培养基续养24 h；清肾颗粒含药血清组（QSG 组）：以含 20% 清肾颗粒含药血清的 DMEM 培养基预处理24 h，再添加 10 ng/mL TGF-β1共处理24 h。部分实验以20% 含药血清预处理 24 h 后，经乳酸干预 1 h，再加入10 ng/mL TGF-β1共处理 24 h。

1.2.10 细胞外氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）

检测采用Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪检测各组细胞的 OCR 和 ECAR，具体操作如下：将细胞接种于 XF96 细胞培养微孔板中，37 ℃孵育 24 h；更换为添加 2 mmol/L 谷氨酰胺的 XF 基础培养基，置于 37 ℃无 CO₂培养箱中平衡 1 h。检测 OCR 时，先记录基础条件下的 OCR 值，随后依次注射 1 µmol/L 寡霉素、0.5~1 µmol/L FCCP（解偶联剂） 及 0.5 µmol/L 鱼藤酮+2 µmol/L 抗霉素 A；检测 ECAR 时，先记录基础条件下的 ECAR 值，随后依次注射 10 mmol/L 葡萄糖、1 µmol/L 寡霉素及50 mmol/L 2-DG。

其中OCR相关参数定义及计算方式如下：基础呼吸：指细胞在基础状态下用于线粒体氧化磷酸化的氧耗，计算方式为 “注射寡霉素前的基础OCR值减去注射鱼藤酮+抗霉素 A后的非线粒体呼吸 OCR 值”，反映线粒体基础能量生成能力；最大呼吸：指线粒体在 FCCP刺激下达到的最大氧耗能力，计算方式为“注射 FCCP 后的峰值OCR值减去非线粒体呼吸OCR值”，反映线粒体功能储备上限；备用呼吸能力：指线粒体应对能量需求增加时的额外氧耗潜力，计算方式为“最大呼吸值减去基础呼吸值”，反映线粒体功能灵活性。

ECAR相关参数定义及计算方式如下：糖酵解：指细胞在基础状态下利用葡萄糖进行糖酵解的活性，计算方式为“注射葡萄糖后的ECAR升高值减去基础ECAR值”，反映基础糖酵解速率；糖酵解能力：指细胞在寡霉素（抑制线粒体ATP合成）刺激下，通过糖酵解代偿供能的最大能力，计算方式为“注射寡霉素后的ECAR峰值减去基础ECAR值”，反映糖酵解代偿潜力；糖酵解储备：指细胞超出基础糖酵解的额外糖酵解能力，计算方式为“糖酵解能力值减去糖酵解值”，反映糖酵解活性储备。

每次实验结束后，裂解细胞并测定蛋白质浓度，分别对 OCR 和 ECAR 结果进行标准化处理；上述参数均通过 Seahorse XF 96 Wave软件自动计算，结果以 pmol/min 表示。

本实验通过OCR参数评估细胞线粒体氧化磷酸化功能状态，明确清肾颗粒对TGF-β1诱导的 HK-2 细胞线粒体功能抑制的改善作用；通过 ECAR 参数量化细胞糖酵解活性及代偿能力，验证清肾颗粒对 “氧化磷酸化减弱、糖酵解亢进” 这一糖酵解重编程的调控效果，为 “清肾颗粒通过纠正代谢失衡抑制肾纤维化” 提供功能学证据。

1.2.11 统计学分析

所有数据均采用GraphPad Prism 9.5.0软件进行统计分析，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，以Tukey检验进行组间两两比较；P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 清肾颗粒抑制叶酸诱导的小鼠肾纤维

HE染色显示正常组小鼠肾组织结构清晰，肾小管形态完整，间质无明显炎症；模型组小鼠肾小管上皮细胞肿胀、管腔狭窄，间质炎症浸润。Masson染色显示正常组小鼠肾间质无明显纤维化，模型组小鼠肾间质胶原纤维沉积显著增加。清肾颗粒干预后，肾小管损伤及间质纤维化明显减轻（P<0.05，图1A、B）。Western blotting结果显示，与正常组相比，模型组肾组织中，纤维化标志蛋白 α-SMA、FN水平显著升高，上皮标志蛋白 E-cad表达显著降低（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组 α-SMA、FN蛋白表达下降，E-cad蛋白表达升高（P<0.05，图1C、D）。免疫荧光结果显示，与正常组相比，模型组肾组织中 α-SMA、FN蛋白荧光强度显著增加，E-cad蛋白荧光强度明显减少（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组 α-SMA、FN荧光强度显著减少，E-cad蛋白荧光强度明显增加（P<0.05，图1E、F）。血清生化检测显示，与正常组相比，模型组小鼠血清SCR、BUN显著升高（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组SCR、BUN均显著降低（P<0.05，图1G、H）。

2.2 清肾颗粒调控叶酸诱导肾纤维化小鼠肾组织的糖酵解重编程

Western blotting检测结果显示，与正常组相比，模型组HIF-1α、HK2、PFKM、PKM2、LDHA表达均显著上调（P<0.05）；与模型组相比，上述糖酵解相关蛋白表达均显著下调（P<0.05，图2A、B）。免疫荧光染色显示，与正常组相比，模型组LDHA荧光强度显著增强，而与模型组相比，清肾颗粒组LDHA荧光强度显著降低（P<0.05，图2C、D）。

2.3 清肾颗粒抑制小鼠肾组织乳酸堆积及组蛋白乳酸化

与正常组相比，模型组肾组织内乳酸含量显著升高（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组乳酸水平显著降低（P<0.05，图3A）。Western blotting检测Pan Kla表达，清肾颗粒组Pan Kla水平较模型组显著下调，在11000和15000出现两条优势条带，分别对应组蛋白H4和H3（图3B）。Western blotting检测组蛋白 H3（5 个位点）及 H4（4 个位点）的乳酸化修饰，发现，与正常组相比，模型组H3K18la、H3K14la、H4K12la 等位点表达显著升高（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组多个组蛋白乳酸化位点表达下降，其中H3K18la表达下降最显著（P<0.05，图3C、D）。免疫荧光检测LDHA与 H3K18la的亚细胞共定位，发现与正常组相比，模型组LDHA与 H3K18la 荧光强度显著增强，且在肾小管高度共定位；与模型组相比，清肾颗粒组LDHA 与 H3K18la 共定位荧光减少（图3E、F）。

2.4 清肾颗粒含药血清抑制 TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化

CCK-8 检测细胞活力结果显示20% 及以下浓度时，细胞活力随浓度升高呈剂量依赖性增强。超过20% 时，细胞活力显著下降（图4A）。因此，清肾颗粒含药血清的安全浓度范围为5%~20%，选取5%、10%、20% 3个浓度梯度用于后续实验。以安全浓度含药血清处理TGF-β1诱导的HK-2细胞损伤模型，结果显示，与正常组相比，模型组细胞活力明显降低（P<0.05）；与模型组比较，清肾颗粒含药血清组细胞活力均升高，且20%含药血清组细胞活力升高最显著（P<0.05，图4B）。EdU 染色检测细胞增殖显示，与正常组相比，模型组的EdU 阳性细胞比例显著降低；与模型组比较，20%含药血清组EdU阳性细胞比例显著增加，且增殖水平高于5%、10%组（P<0.05，图4C、D）。因此选择20%含药血清为最佳浓度进行后续实验。

Western blotting检测细胞内α-SMA和E-cad的蛋白表达水平，结果显示，与正常组相比，模型组细胞内α-SMA蛋白表达显著上调、E-cad蛋白表达减少（P<0.05）；而与模型组比较，清肾颗粒含药血清组的α-SMA表达显著下调、E-cad蛋白表达升高（P<0.05，图4E、F）。

2.5 清肾颗粒含药血清调控TGF-β1诱导的HK-2细胞糖酵解重编程

Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪结果显示，与正常组相比，模型组OCR 动态曲线显著下降，与模型组相比，清肾颗粒含药血清组OCR动态曲线显著回升（图5A）。对关键参数定量分析显示，与 正常组相比，模型组基础呼吸、最大呼吸、ATP 产生、备用呼吸能力显著降低（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒含药血清组以上参数显著回升（P<0.05，图5B）。同时，与正常组相比，模型组ECAR动态曲线显著上升，与模型组相比，清肾颗粒含药血清组ECAR曲线上升幅度降低（图5C）。对关键参数定量分析显示，与正常组相比，糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备显著增强（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒含药血清组以上参数显著下降（P<0.05，图5D）。

2.6 清肾颗粒含药血清抑制HK-2细胞乳酸堆积及组蛋白乳酸化

与正常组相比，模型组细胞内乳酸含量显著升高（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒含药血清组乳酸水平显著降低（P<0.05，图6A）。Western blotting结果显示，与模型组相比，清肾颗粒含药血清组LDHA、H3K18la、α-SMA表达降低（P<0.05）；而补充乳酸会逆转含药血清的保护作用，LDHA、H3K18la、α-SMA表达升高（P<0.05，图6B、C）。

3 讨论

本研究通过体内外实验证实，清肾颗粒可通过抑制糖酵解关键酶的表达、增强细胞氧化磷酸化活性及改善糖酵解亢进状态，减少乳酸累积并抑制组蛋白乳酸化修饰，进而发挥减轻肾纤维化的作用。这一发现为阐释清肾颗粒的抗纤维化机制提供了新视角，也为中医 “清热化湿祛瘀” 治法的现代生物学解释奠定了实验基础。

在肾纤维化的代谢调控研究中，糖酵解代谢异常是肾小管上皮细胞适应缺氧、炎症等病理微环境的重要特征^{［16， 17］}。既往研究证实，纤维化模型中肾小管上皮细胞糖酵解速率显著升高，HIF-1α、HK2、PKM2 及 LDHA 等关键分子表达上调^{［18， 19］}。这种代谢转换打破了氧化磷酸化与糖酵解的动态平衡，线粒体功能受抑导致能量生成效率下降，而糖酵解亢进在快速供能的同时加剧了乳酸堆积^{［20， 21］}。已有研究证实靶向糖酵解关键酶可改善纤维化，如PFKFB3抑制剂3PO能降低肾脏缺血再灌注损伤模型的纤维化程度^［22］，紫草素通过靶向抑制HK2可减轻单侧输尿管梗阻引发的肾纤维化^［23］。本研究发现清肾颗粒可下调 HIF-1α/HK2/PKM2/LDHA 通路分子的表达以降低糖酵解水平，同时恢复线粒体氧化磷酸化功能，与上述研究结论一致，提示其通过纠正糖酵解重编程发挥抗纤维化作用。与单一靶点化学抑制剂相比，现有糖酵解酶抑制剂如 3PO、紫草素等虽在动物模型中可减轻肾纤维化，但因潜在细胞毒性尚未进入临床应用，而清肾颗粒作为临床应用的中药复方，凭借多成分协同调控代谢网络的特性，既能全面改善糖酵解重编程，又具有已证实的安全性，显示出独特治疗优势。

乳酸作为糖酵解终产物，已突破 “代谢废物” 的传统认知，成为调控肾纤维化的功能性分子^［24］。研究证实，肾小管来源的乳酸可促进急性肾损伤中成纤维细胞的活化增殖^［25］，更能作为内源性信号分子介导组蛋白乳酸化修饰，调控靶基因转录，参与肾纤维化进程^{［9， 26］}。本研究首次发现，清肾颗粒可显著降低肾组织乳酸含量及组蛋白乳酸化修饰。免疫荧光共定位结果显示，LDHA与H3K18la在肾小管高度共定位，提示糖酵解产生的乳酸可能直接参与组蛋白修饰；进一步细胞实验验证，外源性补充乳酸可逆转清肾颗粒含药血清对 LDHA、H3K18la 及α‑SMA的下调作用，直接证实了乳酸在组蛋白乳酸化调控及纤维化进程中的因果作用，为 “乳酸堆积-组蛋白乳酸化增强-肾纤维化” 病理轴提供了实验支持。值得注意的是，我们在组蛋白乳酸化位点筛查中发现 H3K18la 的变化最为显著，这与现有研究结论一致。在已发现的28个组蛋白乳酸化修饰位点中，H3K18la 是研究最深入的经典位点，通过激活靶基因转录参与特发性肺纤维化、心肌梗死、肝纤维化、癌症等多种疾病进程^［27-31］。在肾脏疾病中，H3K18la 已被证实通过调控特定靶基因转录加重脓毒症相关急性肾损伤的炎症及草酸钙结石相关肾损伤^{［32， 33］}，这提示 H3K18la 可能是肾纤维化中关键的表观遗传调控位点。

综上，清肾颗粒能够减轻肾纤维化，其涉及的机制可能与调控糖酵解重编程、减少乳酸堆积及 H3K18la表达有关。本项研究为清肾颗粒在治疗CKD 患者中的临床应用提供了科学依据，为中医药预防和治疗肾脏疾病提供新的思路和方法。

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基金资助

国家自然科学基金(82274307)

安徽省自然科学基金项目(2308085MH292)

安徽省自然科学基金项目(202407290785)

安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2024BAc20084)

安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2024Aa30409)

安徽中医药大学临床科研项目(2024YFYLCZX28)

合肥市科技局生命健康专项(GJ2022SM03)

2023年度合肥综合性国家科学中心大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所科研项目(2023CXMMTCM018)

国家中医优势专科(国中医药医政函[2024]90号)

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