不同配伍黄芪药对通过PTGS2调控脂质过氧化改善小鼠糖尿病肾病

Different Astragalus medicinal pairs improve diabetic nephropathy in mice by regulating lipid peroxidation through PTGS2

摘要

目的 探究芪丹地黄颗粒中不同黄芪药对（黄芪丹参药对、黄芪地黄药对、黄芪山药药对）调节糖尿病肾病（DKD）小鼠PTGS2介导的脂质过氧化的不同影响。 方法 通过网络药理学方法筛选芪丹地黄颗粒中黄芪、丹参、生地黄和山药的活性成分及其作用靶点，构建药对-有效成分-靶点网络，并与DKD相关靶点进行交集分析，构建PPI蛋白互作网络和富集分析。利用分子对接技术验证关键活性成分与PTGS2的结合能力。通过动物实验评估不同黄芪药对对DKD小鼠的影响。30只小鼠随机分为6组（n=5），包括正常对照组、模型组、厄贝沙坦组（50 mg/kg/d）及3个黄芪药对组（黄芪丹参、黄芪地黄、黄芪山药，给药剂量均为6 g/kg/d）。除正常组外，其余各组采用链脲佐菌素（50 mg/kg）诱导DKD模型，造模成功后给予相应药物干预8周。 结果 网络药理学结果显示芪丹地黄颗粒中各药对的活性成分与DKD相关靶点存在广泛交集，PTGS2为关键靶点。主要活性成分与PTGS2具有良好的结合亲和力。与模型组相比，黄芪-丹参组和黄芪-地黄组小鼠的体质量、空腹血糖、血清肌酐、尿素氮和24 h尿白蛋白水平改善（P<0.05），其中黄芪-丹参组改善最显著；而黄芪-山药组仅在血糖和肌酐水平方面有轻微改善（P<0.05），对尿素氮和尿白蛋白无统计学差异（P>0.05）。PTGS2蛋白表达在模型组升高（P<0.01），黄芪-丹参组显著下调其表达（P<0.01）。黄芪-丹参组显著提高SOD活性（P<0.01），降低MDA含量（P<0.01）并上调GPX4表达（P<0.01）；黄芪-地黄组改善作用相对较弱，黄芪-山药组效果最差。 结论 芪丹地黄颗粒中3个黄芪药对可在一定程度上通过PTGS2介导的脂质过氧化改善糖尿病肾病，其中黄芪丹参药对效果最为显著。

Abstract

Objective To explore the regulatory effects of 3 Astragalus herb pairs (Astragalus-Salvia miltiorrhiza, Astragalus-Rehmannia glutinosa, and Astragalus-Dioscorea opposita) in QidanDihuang Granule on PTGS2-mediated lipid peroxidation in mice with diabetic kidney disease (DKD). Methods Network pharmacology was used to screen active components and targets of Astragalus membranaceus, Salvia miltiorrhiza, Rehmannia glutinosa, and Dioscorea opposita in Qidan Dihuang Granule to construct herb pair-active component-target networks, followed by intersection analysis with DKD-related targets for PPI network construction and enrichment analysis. Molecular docking was used to verify the binding of the key active components to PTGS2. In 25 C57BL/6J mouse models of streptozotocin-induced DKD, the therapeutic effects of treatments with saline, irbesartan, and the 3 Astragalus herb pairs (n=5) for 8 weeks were tested, with 5 normal mice serving as the control group. Results Network pharmacology showed extensive intersections between the active components of each herb pair and DKD-related targets, with PTGS2 as the key target. The major active components exhibited good binding affinity to PTGS2. The DKD mouse models in Astragalus-Salvia miltiorrhiza and Astragalus-Rehmannia glutinosa groups, particularly those in the former group, showed significant improvements in body weight, fasting blood glucose, serum creatinine, urea nitrogen, and 24-h urinary albumin. The Astragalus-Dioscorea opposita pair only slightly improved blood glucose and creatinine without improving urea nitrogen or urinary albumin in the mouse models. The Astragalus-Salvia miltiorrhiza pair, but not the other two pairs, markedly reduced the elevation of PTGS2 expression, significantly enhanced SOD activity, reduced MDA content, and upregulated GPX4 expression in the mouse models, and the therapeutic effect was only moderate in Astragalus-Rehmannia glutinosa group and the poorest in Astragalus-Dioscorea opposita group. Conclusion The 3 Astragalus herb pairs from Qidan Dihuang Granule can improve DKD in mice by reducing PTGS2-mediated lipid peroxidation, and the Astragalus-Salvia miltiorrhiza pair shows the strongest efficacy.

Graphical abstract

关键词

芪丹地黄颗粒 / 药对 / 糖尿病肾病 / 脂质过氧化 / PTGS2

Key words

Qidan Dihuang Granules / herb pair / diabetic kidney disease / lipid peroxidation / PTGS2

糖尿病是一种发病率持续上升的慢性代谢性疾病，已成为全球公共卫生领域面临的重大挑战^［1］。其主要特征是胰岛素分泌不足或靶组织对胰岛素敏感性下降，导致持续高血糖，并进而诱发多系统慢性并发症^［2］。糖尿病肾病（DKD）是最常见且最严重的微血管并发症之一，显著影响患者的生活质量和寿命。流行病学调查显示，30%~40%的糖尿病患者最终会发展为DKD^［3］。一旦出现持续性蛋白尿，肾功能将不断恶化，平均生存期缩短至5~7年。DKD不仅显著提高糖尿病患者的致残率和病死率，还是全球终末期肾病（ESRD）的主要病因，严重加重医疗系统负担^［4，5］。随着病情发展，许多患者需依赖透析或肾移植等肾脏替代治疗，进一步加重身体和经济负担。因此，深入阐明DKD的发病机制并探索有效干预手段，已成为基础与临床研究的重要方向。

目前临床对DKD的治疗主要包括强化血糖、血压及血脂控制，联合使用肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）抑制剂^{［6， 7］}、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）^［8］、血管加压素受体拮抗剂（VRA）等药物，以延缓肾功能恶化^{［9， 10］}。然而，这些治疗手段效果有限，难以阻止部分患者最终进展为ESRD，提示现行策略仍有待优化。DKD发病机制复杂，涵盖糖代谢障碍、肾小球高灌注与高滤过、炎症反应、氧化应激、脂质代谢紊乱及细胞凋亡等多个环节，尚缺乏可逆转病程的特异性靶向治疗。

近年来，氧化应激和脂质过氧化在DKD发病机制中的作用日益受到关注。前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2），又称环氧合酶2（COX-2），是催化花生四烯酸生成前列腺素的关键限速酶。其表达上调可显著促进脂质过氧化反应，增强氧化应激，诱发肾小球及间质细胞损伤^［11］。有研究表明，PTGS2在糖尿病肾病组织中高表达，并与蛋白尿程度和肾功能下降密切相关。因此，靶向调控PTGS2介导的脂质过氧化通路，有望成为防治DKD的潜在策略。

中医药在慢性病的综合防治中具有独特优势，尤其在多靶点、多机制干预方面展现出广阔应用前景^［12］。中医学将糖尿病肾病归属“消渴”“肾痿”“水肿”等范畴^［13］，认为其病机以“气阴两虚、瘀阻脉络、毒邪内陷”为主^［14］，虽病位在肾，亦常累及肺、脾、肝等脏腑。治疗应以益气养阴、活血通络为基本原则^［15］。近年来，中药复方因其多成分协同机制受到现代药理学关注，并广泛应用于糖尿病及其并发症的治疗^{［16， 17］}。研究表明，中药复方可通过多途径调控氧化应激、抑制炎症、改善代谢紊乱，从而干预DKD的病理过程，成为现有治疗的重要补充^［12］。

芪丹地黄颗粒为本课题组依据中医理论，结合现代药理研究成果所研制的自拟中药复方，已获国家发明专利（专利号：ZL201310015464.5）^［18］。该方由黄芪、丹参、生地黄、山药和甘草五味药组成。其中，黄芪为君药，主补气升阳、固表利水^［19］；丹参为臣药，活血化瘀、养血安神^［20］；生地黄养阴清热，山药健脾补肾，甘草调和诸药，增强协同效应。方剂遵循“益气养阴、活血通络”之治则，契合DKD“本虚标实、气阴两伤、瘀毒并见”的病机特征。前期研究表明，芪丹地黄颗粒可有效降低糖尿病模型小鼠的尿白蛋白水平，改善肾功能，并抑制肾组织纤维化进展^{［21， 22］}。临床观察亦显示，该方可改善DKD患者的蛋白尿及肾小球滤过率，且具有良好的安全性与应用前景^{［23， 24］}。

然而，现有研究多集中于固定复方的整体效应，对于复方内部核心药对配伍的协同机制及其特异性作用靶点缺乏深入剖析。这种整体研究模式，难以揭示君臣佐使配伍理论中，不同臣药与君药协同所产生的差异化效应及其背后的精准分子机制。因此，本研究创新性地聚焦于该复方中以黄芪为核心的3组关键药对，系统比较3种不同臣药（丹参、地黄、山药）配伍形成的药对在干预糖尿病肾病中的疗效差异，旨在明确改善DKD的核心有效药对，并揭示其通过调控PTGS2介导的脂质过氧化通路发挥肾脏保护作用的特异性机制。本研究综合运用网络药理学预测、分子对接验证及动物实验验证，不仅为“君臣佐使”配伍理论的科学内涵提供了精准的现代药理学注解，也为开发靶向脂质过氧化的DKD中医药精准干预策略提供了新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 网络药理学方法

1.1.1 芪丹地黄颗粒各黄芪药对活性成分及相应潜在靶点的筛选

以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，本研究检索了TCMSP数据库（https：//tcmsp-e.com/）、ETCM数据库（www.tcmip.cn/ETCM/）以及中国知网（CNKI）的相关文献，收集了黄芪、山药、丹参和生地黄的有效化学成分，并获取了它们的化学结构文件。将这些结构文件导入Swiss Target Prediction平台（http：//swisstargetprediction.ch/），筛选出预测概率大于0的靶点作为潜在药物作用靶点，最后通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）对这些靶点进行了标准化校正。

1.1.2 构建药对-活性成分-靶点网络

利用Cytoscape 3.9.1软件，将各黄芪药对的活性成分及其对应靶点信息进行网络构建，生成“药对-活性成分-靶点”相互作用网络图。在该网络中，边连接活性成分节点与靶点节点，表示二者之间存在相关性。进一步采用cytoNCA插件筛选网络中的关键活性成分。

1.1.3 DKD作用靶点的筛选

以“DN”（diabetic nephropathy）、“DKD”（diabetic kidney disease）为关键词在OMIM（https：//www.omim.org/）、GeneCards（https：//genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com）以及TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）数据库中进行检索，筛选出与DKD相关的疾病靶点。

1.1.4 筛选药对与疾病共有基因靶点

对预测得到的药对靶点与DKD相关靶点进行交集分析，筛选出芪丹地黄颗粒中各黄芪药对与DKD相关的共同作用靶点，并利用Venny图绘制了各药对与DKD共有基因的可视化结果。

1.1.5 构建PPI蛋白互作网络和富集分析

将各黄芪药对与DKD的共有基因靶点上传至STRING数据库（https：//cn.string-db.org），设定物种为“Homo sapiens”，最小相互作用置信度>0.4，进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。随后，借助Cytoscape 3.9.1软件中的CytoHubba插件筛选关键靶点。进一步通过Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）对共有靶点进行基因本体论（GO）富集分析，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3个类别，以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。选取P值排名前20的GO条目和KEGG通路，分别使用生物信息学在线工具绘制条形图与气泡图以可视化富集结果。

1.1.6 分子对接验证

根据网络药理学分析结果，从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取各黄芪药对关键活性成分的分子结构，并从PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载核心靶点PTGS2的蛋白结构。使用PyMOL软件对蛋白结构进行预处理，去除水分子及小分子配体。随后，采用Autodock Vina对关键活性成分与PTGS2靶点进行分子对接。最后，通过PyMOL和Ligplus软件筛选结合模式最佳的对接复合物，并进行可视化展示。

1.2 动物实验验证

1.2.1 试剂及仪器

中药颗粒及厄贝沙坦片（暨南大学附属第一医院）；PBS缓冲液（Gibco）；PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司）；SDS-PAGE上样缓冲液（Affinibody）；PageRuler Prestained Protein Ladder（Thermo Scientific）；PTGS2抗体、GPX4抗体、β-actin抗体（proteintech）；Goat anti-Rabbit IgG-HRP抗体（Asbio）；TBS、Tris-Glycine Transfer Buffer、Tris-Glycine SDS-PAGE Running Buffer（Servicebio）；血清尿素氮BUN检测试剂盒、血清肌酐Scr检测试剂盒、尿微量白蛋白ALB检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；无水乙醇（广州市梓兴化玻仪器有限公司）；甲醇（广州市梓兴化玻仪器有限公司）；BCA试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）；伊红染液、苏木精染液（北京雷根生物技术有限公司）血糖仪（Roche Diabetes Care Ltd.）；酶标仪（BioTek）；石蜡切片机（上海徕卡显微系统贸易有限公司）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2.2 动物模型构建及分组

30只6周龄雄性C57BL/6J小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠在SPF级环境中（温度21±3 ℃，湿度50%，12 h/12 h光暗循环）适应性饲养1周。动物实验经暨南大学动物实验伦理委员会批准（伦理批号：20231102-18）。

小鼠随机分为6组，5只/组，分别为：正常对照组、糖尿病肾病模型组、厄贝沙坦组、黄芪丹参药对组、黄芪地黄药对组、黄芪山药药对组。正常对照组给予等体积溶媒干预。糖尿病肾病模型通过连续5 d腹腔注射链脲佐菌素（STZ，Sigma）建立，STZ以50 mg/kg的剂量溶于pH 4.5的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液中。造模1周后，对小鼠进行连续3次（每次间隔24 h）空腹血糖（FBG）检测，若FBG持续≥13.0 mmol/L，则判定糖尿病模型建立成功。

厄贝沙坦组给予50 mg·kg^-1·d^-1的厄贝沙坦灌胃；黄芪丹参、黄芪地黄和黄芪山药药对组分别按2：1的药材比例，以6 g·kg^-1·d^-1的剂量灌胃。分别于给药后0、2、4、6、8周测定体质量和血糖（使用罗氏血糖仪检测）。实验8周结束后，以戊巴比妥钠（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，经眶后静脉丛采血进行生化分析，并收集肾脏组织用于后续研究。

1.2.3 生化指标检测

实验结束后，收集小鼠血液及尿液样本，检测尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、白蛋白（ALB）等生化指标，以评估糖尿病肾病的进展情况及药物治疗效果。同时，检测肾脏组织中脂质过氧化产物含量以及PTGS2和GPX4的表达水平，从而评价不同黄芪药对在调节脂质过氧化方面的作用。

1.2.4 病理学检查

取小鼠肾脏组织，经4%缓冲甲醛固定后，进行石蜡包埋并切片，分别采用HE染色、PAS染色和Masson染色处理。通过显微镜观察肾脏组织的病理形态变化，以评估糖尿病肾病相关损伤程度及药物治疗效果。

1.2.5 免疫组化分析

石蜡切片经乙醇梯度脱水后，采用柠檬酸缓冲液进行微波抗原修复，PBS漂洗，随后使用3% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，3% BSA阻断非特异性结合。切片于一抗PTGS2（1∶100）中4 ℃孵育过夜，再与HRP标记的二抗于室温反应50 min。DAB显色后以苏木精复染细胞核，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明及中性树脂封片，最后在光学显微镜下观察并进行组织学分析，以评估 PTGS2 蛋白在肾组织中的表达定位及相对水平。

1.2.6 Western blotting

通过SDS-PAGE凝胶电泳按相对分子质量大小分离蛋白质，之后将蛋白从凝胶转移至PVDF膜或硝酸纤维素膜上。转膜完成后，使用5%脱脂奶粉封闭膜上的非特异性结合位点。随后依次孵育一抗PTGS2 （1∶1000）、GPX4 （1∶2000）、β-Actin （1∶20 000）和相应二抗Goat anti-Rabbit IgG-HRP（1∶2000），采用化学发光法检测目标蛋白条带，最后通过ImageJ软件对条带进行定量分析。

1.2.7 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.5软件进行数据分析和图形绘制。数据采用方差分析（ANOVA）进行统计处理，多重比较使用Fisher最小显著差异检验或Turkey事后检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学研究结果

2.1.1 药对活性成分及其靶点基因筛选

根据筛选标准，黄芪共获得56个活性成分，对应953个靶点基因；丹参含154个活性成分，对应2566个靶点基因；地黄有90个活性成分，对应83个靶点基因；山药含70个活性成分，对应70个靶点基因。对各药对取药物交集基因后，黄芪丹参药对获得190个交集基因，黄芪地黄药对获得41个，黄芪山药药对获得47个。利用Cytoscape软件构建各药对的“成分-靶点”网络图：黄芪丹参药对网络包含753个节点和3713条边（图1A），黄芪地黄药对网络包含519个节点和118条边（图1B），黄芪山药药对网络包含484个节点和1125条边（图1C）。

2.1.2 DKD作用靶点筛选结果

在GeneCards数据库中初步检索到21 697个DKD相关靶点。通过在Excel中将靶点按Score值由高至低排序，并以大于Score中位数为条件，经过4次排序和3轮筛选，最终确定Score>17.99的靶点共2984个作为候选靶点。进一步从OMIM、DrugBank、DisGeNET和TTD数据库中分别获取552、43、10和25个相关靶点。合并所有靶点并去除重复后，最终得到3614个DKD作用靶点（图1D）。

2.1.3 各黄芪药对和DKD共有基因靶点

黄芪丹参药对与DKD之间存在106个共有基因靶点（图1E）；黄芪地黄药对与DKD共有基因靶点21个（图1F）；黄芪山药药对与DKD共有基因靶点27个（图1G）。

2.1.4 PPI蛋白互作网络及富集分析结果

利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，结果显示：黄芪丹参药对与DKD的共有基因PPI网络包含106个节点和1172条边，平均节点度为22.1，PPI富集P值<1.0×10^-16（图2A）。该网络中，核心靶点按degree值排名前六的依次为PTGS2、ICAM1、PPARG、JUN、FOS和ACTB（图2B）。黄芪地黄药对与DKD的共有基因PPI网络包含21个节点和42条边，平均节点度为4，PPI富集P值<1.0×10^-16（图2C），其核心靶点前6名为PTGS2、PTGS1、ADRB2、MMP9、RELA和SLC6A2（图2D）。黄芪山药药对与DKD的共有基因PPI网络包含27个节点和69条边，平均节点度为5.11，PPI富集P值<1.54×10^-12（图2E），核心靶点前六位为PTGS2、P90AB1、MAOB、AKT1、TP53和GSK3B（图2F）。上述靶点可能是各黄芪药对治疗DKD的关键作用靶点，其中PTGS2为3个药对共同的关键靶点。

将交集靶点导入Metascape数据库进行富集分析。黄芪丹参药对的KEGG通路富集结果显示，其主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、活性氧通路、NF-κB信号通路和TNF信号通路（图3A）。GO功能分析表明，在BP中主要富集于对激素的反应、对有毒物质的反应、细胞激活和蛋白磷酸化等；CC中主要涉及受体复合物、膜筏、黏着斑、质膜外侧及过氧化物酶体；MF主要包括蛋白同源二聚体结合、蛋白结构域特异性结合、抗氧化活性、酶激活剂活性以及丝氨酸型内肽酶活性（图3B）。

黄芪地黄药对的KEGG通路主要富集于钙信号通路、化学致癌-活性氧、花生四烯酸代谢和脂肪细胞中脂解调节通路（图3C）。其GO BP包括对缺氧的反应、血压调节和对药物的反应；MF涵盖氧化还原酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、G蛋白偶联胺受体活性、血红素结合和胺结合（图3D）。

黄芪山药药对的KEGG通路显著富集于PI3K-Akt信号通路、钙信号通路和脂肪细胞中的脂解调节通路（图3E）。GO分析显示，BP主要包括对缺氧的反应和对氧气水平下降的反应；CC涉及膜筏、质膜筏、突触前膜组分、毛细血管、突触膜和突触后膜组分；MF主要包括抗氧化活性、过氧化物酶活性和氧化还原酶活性（图3F）。

2.1.5 分子对接结果

采用cytoNCA筛选关键活性成分，按度值排序前4位分别是大豆苷元（Daidzein）、芒柄花素（Formononetin）、山奈酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercetin）。大豆苷元来源于黄芪；芒柄花素来源于黄芪；山奈酚和槲皮素均来源于黄芪、丹参。基于前期网络药理学分析结果，PTGS2被识别为各黄芪药对治疗DKD的核心靶点，该靶点在DKD的细胞损伤和纤维化过程中起关键作用，因此选择PTGS2作为受体，与上述四种活性成分进行分子对接。

对接结果显示，PTGS2与大豆苷元通过残基Ser49、Gln461和His39结合，结合能为-7.8 kcal/mol（图4A）；与芒柄花素通过Ser49、Gly135和Trp323结合，结合能为-8.7 kcal/mol（图4B）；与山奈酚通过Asn34、Gly135、Trp323、Ser49和Cys47结合，结合能为-6.2 kcal/mol（图4C）；与槲皮素通过Lys369、Leu366、Phe371、Gln370、Ser126、Gln372、Lys532、He124结合，结合能为-10.0 kcal/mol（图4D）。

2.2 动物实验结果

2.2.1 生化指标检测

与对照组相比，模型组及各干预组小鼠体质量均显著下降（P<0.05）。各干预组与糖尿病肾病模型组之间的体质量差异无统计学意义（图5A）。糖尿病肾病模型组表现出典型的代谢紊乱特征，其空腹血糖、血清肌酐、血尿素氮以及24 h尿白蛋白水平均显著升高（P<0.05）。经不同中药药对干预后，除黄芪山药组在血尿素氮和24 h尿白蛋白含量方面未见显著改善外，各治疗组的上述指标均得到改善。其中，黄芪丹参药对组的治疗效果最为显著，黄芪地黄药对组次之，而黄芪山药药对组的改善效果相对有限（图5B~E）。

组织病理学分析进一步显示，糖尿病肾病模型组出现典型的肾脏病理改变，包括肾小球炎症浸润、肾小球肥大、系膜基质扩张和基底膜增厚等特征性病变。经中药治疗后，各治疗组能够不同程度地逆转上述病理变化，其中黄芪丹参药对组的效果最为明显，其肾脏组织结构接近正常对照组水平，黄芪地黄组效果次之，而黄芪山药组与模型组之间差异无统计学意义（图5F~H）。

2.2.2 不同黄芪药对调控DKD小鼠肾脏组织PTGS2的表达

免疫组化结果显示，与对照组相比，糖尿病肾病模型组肾脏组织中PTGS2阳性染色面积显著增加；经不同黄芪药对干预后，模型组肾脏PTGS2表达得到不同程度的抑制（图6A、B）。Western boltting结果也表明，模型组PTGS2蛋白表达显著升高（P<0.05），而黄芪丹参药对组能有效逆转PTGS2高表达（图6C、D）。

2.2.3 不同黄芪药对调节DKD小鼠肾脏脂质过氧化水平

黄芪丹参组能够显著降低MDA含量（P<0.05）、提高SOD水平（P<0.05），并有效抑制活性氧（ROS）的过度积累；黄芪地黄组能够降低ROS水平，提高SOD含量；而黄芪山药组仅能降低ROS水平（图7A~C）。Western blot结果表明，糖尿病肾病模型组中GPX4蛋白表达显著下降（P<0.05），黄芪丹参可显著上调GPX4表达（图7D、E）。

3 讨论

本研究结合网络药理学与动物实验，系统探讨了芪丹地黄颗粒中3种黄芪配伍药对（黄芪-丹参、黄芪-地黄、黄芪-山药）干预DKD的效应与核心机制。PTGS2是3组药对的共同关键靶点，其中黄芪-丹参药对通过调控PTGS2介导的脂质过氧化通路，表现出最为显著的DKD改善效果。

网络药理学分析提示，PTGS2是3组药对交集的核心靶点，在脂质过氧化通路中发挥关键调控作用，可能作为连接药效成分与DKD病理机制的重要环节。分子对接进一步证实，药对中多种关键活性成分包括大豆苷元（黄芪来源）、山奈酚（黄芪、丹参来源）、槲皮素（黄芪、丹参来源）及芒柄花素（黄芪来源）均能与PTGS2稳定结合（结合能≤-5 kcal/mol），为该靶点的作用预测提供了直接依据。动物实验也证实3组药对均能不同程度改善DKD模型小鼠的糖代谢紊乱和血清肌酐水平。此外，黄芪-丹参与黄芪-地黄药对还可降低24小时尿蛋白含量、减轻肾脏病理损伤。在机制层面，黄芪-丹参药对显著下调肾组织中PTGS2的表达，并同步改善脂质过氧化相关指标。该药对在各项功能与病理指标中均表现出显著优势，提示其活性成分可能通过“靶点直接结合”与“通路协同调控”相结合的双重机制，发挥更为突出的肾脏保护作用。

近年来，脂质过氧化作为氧化应激的关键环节，在DKD发生发展中的核心作用日益明确。该过程指细胞膜中不饱和脂肪酸在ROS作用下发生的自催化链式反应，生成脂质自由基及其过氧化物，最终形成以MDA为代表的活性醛类物质。脂质过氧化不仅破坏细胞膜结构与功能，还可诱发炎症反应、促进细胞凋亡与坏死，从而加重肾小球及肾小管的病理损伤^{［25， 26］}。研究表明，脂质过氧化不仅是糖尿病肾损伤的病理产物，更是推动DKD持续进展的重要驱动因素之一^［27-29］。

在脂质过氧化过程中，PTGS2作为关键催化酶，可促进花生四烯酸代谢为前列腺素及其衍生物，从而增强局部炎症反应与氧化应激，并进一步加速脂质过氧化物的积累^［30］。PTGS2的持续激活被认为是细胞脂质代谢紊乱的重要标志^［31］。已有研究证实，PTGS2在糖尿病肾病中表达显著上调，并与蛋白尿水平升高及肾功能下降呈正相关^{［32， 33］}。与此同时，细胞内抗氧化系统在调控脂质过氧化中起着关键作用。在细胞内抗氧化系统中，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是唯一能够直接还原磷脂氢过氧化物的酶类，其活性依赖于谷胱甘肽（GSH）水平及胱氨酸的摄取能力^［34-36］。GPX4能够阻断脂质过氧化的链式反应，维持细胞膜稳定性，是防止铁死亡发生的关键因子。GPX4功能缺失或表达下调会导致脂质过氧化物的大量积聚，进一步诱导细胞死亡及组织损伤^［37］。从分子调控层面看，PTGS2与GPX4在脂质过氧化过程中形成“促氧化-抗氧化”的拮抗动态平衡。PTGS2上调促进脂质过氧化，而GPX4则通过清除过氧化脂质抑制该过程。有研究提出，GPX4活性的降低可导致过氧化脂质的积累，进而诱导PTGS2表达上调，形成反馈性正向放大环路，进一步加剧肾损伤^［38］。因此，维持PTGS2与GPX4之间的动态平衡，对于控制脂质过氧化、减缓DKD的进展具有重要意义。本研究发现，DKD模型小鼠肾组织中呈现PTGS2显著高表达、GPX4明显下调的“促氧化-抗氧化失衡”状态。仅黄芪-丹参药对能同时下调PTGS2表达、上调GPX4表达，并显著降低MDA与ROS水平、提高SOD活性，从而恢复氧化‑抗氧化稳态。而黄芪‑地黄与黄芪‑山药药对无此调节效应。这一结果提示，丹参在与黄芪配伍中可能发挥“靶向增效”作用，特异性增强君药黄芪对PTGS2/GPX4通路的调节能力。

从中医理论看，DKD属“消渴”“肾痿”范畴，核心病机为“气阴两虚、瘀毒内阻”，而黄芪-丹参药对的“益气活血”配伍恰好契合该病机标本兼顾之治则。黄芪补气固表、升清利水，可改善“气阴两虚”之本；丹参活血化瘀、通利血脉，能疏通“瘀毒内阻”之标，二者合用可调畅肾络气机，延缓DKD进展。现代药理研究也支持了该配伍的协同性。黄芪中黄酮类、皂苷类成分具有抗氧化、抗炎作用；丹参中丹参酮、酚酸类成分可保护血管内皮、抑制氧化应激。二者在“补气活血”功效与“多成分-多靶点”机制上形成叠加与协同，可能是该药对在实验中表现出显著优势的内在基础。此外，本研究以“固定君药-可变臣药”的对照设计，系统比较了不同药对的效应差异，既体现了中药“君臣佐使”的配伍逻辑，也为复方研究与药对优化提供了可借鉴的研究思路。药对作为中药复方的“最小功能单元”，在机制阐释与配伍规律研究中具有独特价值，有助于在控制变量的基础上揭示协同增效的生物学基础，为中药现代化研究提供新的切入点。

本研究存在一定局限性。尽管通过多维度实验验证了PTGS2作为关键靶点的重要性，并构建了“药对-PTGS2-脂质过氧化”的间接关联链条，但尚未开展PTGS2特异性干预实验（如抑制剂、基因干预）及前列腺素E2（PGE2）等功能产物的检测。在后续研究中，我们计划在DKD模型中联合使用PTGS2抑制剂（如塞来昔布）或构建PTGS2敲除小鼠，以验证药效是否依赖于PTGS2的活性；同时检测肾组织中PGE2水平，直接评估PTGS2的功能活性变化；并借助高糖诱导的足细胞或肾小管上皮细胞模型，明确药对活性成分对PTGS2及其下游脂质过氧化指标的直接调控作用，从而为相关机制提供更深入的实验依据。

综上所述，本研究综合运用网络药理学、分子对接及动物实验，系统阐明芪丹地黄颗粒中不同黄芪药对可通过干预PTGS2介导的脂质过氧化通路改善DKD，其中黄芪-丹参药对凭借“益气活血”的配伍特点，在恢复氧化-抗氧化平衡方面表现最为突出。本研究不仅为该复方的临床精准应用提供了实验依据，也为中药复方在防治糖尿病肾病中的配伍优化与机制研究提供了新的思路与策略。

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