刺芒柄花素通过下调P53/SAT1/ACSL4介导的铁死亡改善新生小鼠缺氧缺血性脑损伤

Formononetin downregulates P53/SAT1/ACSL4 pathway-mediated ferroptosis to improve hypoxic-ischemic brain injury in neonatal mice

摘要

目的 探讨刺芒柄花素（FMN）对新生小鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的神经保护作用，并阐明其机制是否与调控P53/SAT1/ACSL4信号通路以抑制神经元铁死亡有关。 方法 选取24只出生9~11 d的C57BL/6J新生小鼠，通过结扎左侧颈总动脉并置于低氧环境（92% N₂，8% O₂）中40 min以构建HIBD模型。造模成功后，将小鼠随机分为4组（n=6）：假手术组（Sham）、模型组（HIBD）、FMN低剂量治疗组（HIBD+FMN-L，50 mg/kg）和高剂量治疗组（HIBD+FMN-H， 100 mg/kg）。腹腔注射给药，3 d后取脑皮层缺血半暗带组织进行检测。采用Western blotting和双重免疫荧光技术分析铁死亡通路关键蛋白P53、SAT1及ACSL4的表达水平；同时测定组织内亚铁离子（Fe²⁺）、超氧化物（DHE）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的含量，以评估铁死亡及相关氧化应激指标。体外选用HT22神经元，建立氧糖剥夺（OGD）模型并分组为：对照组（Control）、模型组（OGD）、FMN干预组（OGD+FMN，100 μmol/L）、P53激动剂Nutlin-3干预组（OGD+Nutlin-3，10 μmol/L）以及FMN与Nutlin-3联合处理组（OGD+FMN+Nutlin-3）。在药物预处理1 h及OGD处理6 h后，检测上述铁死亡相关蛋白，并利用特异性探针或生化方法评估细胞内Fe²⁺（FerroOrange）、活性氧（DCFH-DA）、脂质过氧化（BODIPY-C11、MDA）、GSH水平、线粒体膜电位（JC-1）及细胞活性（CCK-8）。 结果 体内实验结果表明，与HIBD组相比，FMN治疗能够显著抑制P53、SAT1和ACSL4的蛋白表达（P<0.05），并有效改善铁死亡相关生化指标，具体为Fe²⁺、ROS和MDA含量显著降低，同时抗氧化物质GSH水平得以恢复（P<0.05）。体外实验结果与体内发现相互印证，FMN处理缓解了OGD诱导的HT22细胞铁死亡，表现为铁死亡关键蛋白表达下调（P<0.05），Fe²⁺积聚、脂质过氧化和ROS水平受到抑制，并且GSH含量、线粒体膜电位及细胞活力得到显著改善（P<0.05）。机制验证方面，当使用Nutlin-3特异性激活P53信号后，FMN所产生的上述保护效应均被明显逆转或削弱（P<0.05），P53信号在FMN抑制铁死亡过程中发挥重要的上游调节作用。 结论 刺芒柄花素通过下调P53/SAT1/ACSL4通路介导的神经元铁死亡的途径，对新生小鼠HIBD产生神经保护效应。

Abstract

Objective To investigate the neuroprotective effects of formononetin (FMN) against hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) in neonatal mice and the underlying mechanism. Methods Twenty-four neonatal C57BL/6J mice were randomly divided (n=6) into sham-operated group, HIBD model group, HIBD+FMN-L (50 mg/kg) group, and HIBD+FMN-H (100 mg/kg) group. Mouse models of HIBD were established by left common carotid artery ligation followed by hypoxia (92% N₂, 8% O₂) for 40 min. FMN at the two doses was administered by intraperitoneal injection, and 3 days later, brain tissues from the cortical ischemic penumbra were collected for assessing expressions of ferroptosis-related proteins (P53, SAT1, and ACSL4) using Western blotting and immunofluorescence staining and for detecting the levels of Fe²⁺, superoxide, malondialdehyde (MDA), and glutathione (GSH). In cultured HT22 neurons with oxygen-glucose deprivation (OGD), the effects of 100 μmol/L FMN, 10 μmol/L Nutlin-3 (a P53 agonist), or their combination on expressions of ferroptosis proteins, intracellular Fe²⁺, reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation, GSH, mitochondrial membrane potential, and cell viability were evaluated. Results In the neonatal mouse models of HIBD, FMN treatment significantly suppressed the protein expression of P53, SAT1, and ACSL4, reduced Fe²⁺, ROS, and MDA levels and increased GSH content in the cortical ischemic penumbra. In HT22 neurons with OGD, FMN obviously alleviated OGD-induced ferroptosis as shown by lowered expressions of the key ferroptosis proteins, reduced Fe²⁺ accumulation and lipid peroxidation, and significant increases of GSH levels, mitochondrial membrane potential, and cell viability. Mechanistic experiments showed that activation of P53 signaling by Nutlin-3 markedly reversed the protective effects of FMN. Conclusion FMN produces neuro-protective effects against HIBD in neonatal mice by mitigating neuronal ferroptosis, primarily through downregulation of the P53/SAT1/ACSL4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

刺芒柄花素 / 缺氧缺血性脑损伤 / 铁死亡 / P53 / SAT1 / ACSL4

Key words

formononetin / hypoxic-ischemic brain damage / ferroptosis / P53 / SAT1 / ACSL4

围产期缺氧事件是全球新生儿死亡的主要因素之一，其所引发的缺氧缺血性脑损伤（HIBD）作为一种严重的新生儿神经系统疾病，不仅导致高死亡率，还可引起远期的神经功能障碍，包括运动障碍、认知缺陷和癫痫等，影响患儿的生存质量与发展潜力^{［1， 2］}。HIBD的发病机制复杂，涉及炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和坏死等多种分子与细胞水平的损伤过程^［3］。尽管亚低温治疗已在临床中应用并显示出一定的神经保护效果，但其疗效有限且时间窗狭窄^［4］。因此，亟需探索更有效的治疗策略与药物靶点。

近年来，铁死亡作为一种新发现的铁依赖性程序性细胞死亡方式，在HIBD发病机制中的作用日益受到关注^［5］。铁死亡的特征是细胞内脂质过氧化物异常蓄积，导致膜结构破坏、线粒体脊损伤和细胞氧化崩解，该过程依赖于铁代谢紊乱和抗氧化系统功能失调^［6］。研究表明，铁死亡不仅参与神经退行性疾病和成人缺血性脑卒中，也在新生儿HIBD中扮演重要角色。例如，在HIBD模型中发现海马区神经元存在典型的铁死亡特征，临床研究也观察到发育中的患儿体内与铁死亡相关的生物标志物水平发生显著改变^{［7， 8］}。目前关于HIBD中铁死亡的调控机制多集中于核因子E2相关因子2（Nrf2）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）等经典通路，而对其他潜在信号途径的探索仍较为有限^［9］。

P53在细胞周期调控、DNA修复和凋亡中具有核心地位，尤其以其抑癌功能著称^［10］。研究揭示P53还可通过多条下游通路正向调控铁死亡，其中包括激活亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1（SAT1）基因表达^［11］。SAT1作为P53的转录靶点，可促进多胺代谢和脂质过氧化，进而诱发铁死亡^［12］。另一方面，长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）是铁死亡执行过程中的关键酶，它催化花生四烯酸等不饱和脂肪酸的酯化，生成脂质过氧化物前体，从而在缺乏GPX4活性时加速铁死亡进程^［13］。研究还表明，P53可通过转录辅助激活因子间接上调ACSL4，其激动剂Nutlin-3可进一步放大脂质过氧化反应^［14］。因此，P53/SAT1/ACSL4信号轴可能是连接缺氧应激与神经元铁死亡的重要桥梁，但其在新生儿HIBD中的具体作用机制尚不明确。

刺芒柄花素（FMN）是一种从中药黄芪中提取的异黄酮类化合物，已被证明在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用，其机制涉及抗炎、抗氧化和抗凋亡等多重效应^{［15， 16］}。FMN还可调节铁死亡相关通路，对癌症和心肌缺血等疾病模型显示出保护潜力^{［17， 18］}。然而，该化合物是否通过调控P53/SAT1/ACSL4介导的铁死亡途径减轻HIBD尚待深入探讨。本研究旨在构建新生小鼠HIBD模型，系统评价FMN对P53/SAT1/ACSL4信号通路及铁死亡生化标志物的影响，从而揭示其是否通过抑制该通路减轻神经元铁死亡和继发性脑损伤。本研究不仅为新生儿HIBD提供了潜在的药物治疗新策略，也拓展了铁死亡调控机制在发育神经系统中的理论内涵，为今后开发针对缺氧缺血性脑损伤的靶向药物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物和细胞

本研究严格遵循昆明医科大学动物伦理规范（伦理批号：kmmu20240248），所有操作均依据《实验动物管理条例》执行。实验对象为SPF级C57BL/6J品系新生小鼠，鼠龄9~11 d，体质量4~6 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK（京）2024-0001，动物质量合格证号为：110324241107851256。动物于标准条件下驯化，环境温度维持在22±2 ℃，采用12 h光照/12 h黑暗循环模式，并提供自由摄食与饮水。细胞学实验部分，选用小鼠海马神经元细胞系HT22，购自武汉普诺赛生命科技有限公司（CL-0697），细胞经STR鉴定正确。HT22细胞培养于含10%胎牛血清及1%双抗（青霉素-链霉素）的DMEM完全培养基中，并置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱内持续培养。所有细胞处理均在生长对数期进行，以保障细胞状态的稳定与活性。

1.1.2 试剂和仪器

FMN（纯度≥98.9%，Selleck，S2299）；P53（A25915）、SAT1（A2506）、ACSL4（A20414）、4-HNE（A24456）和β-actin（AC026）抗体（ABclonal）；NeuN抗体（Abcam，ab104224）；P53激动剂Nutlin-3（Selleck，S1061）；亚铁离子（BC5410）和JC-1（M8650）检测试剂盒（北京索莱宝）；Dihydroethidium（DHE，S0063）、DCFH-DA（S0033）、BODIPY 581/591 C11（S0043）和CCK-8（C0042）检测试剂盒（北京碧云天）；FerroOrange（Fe²⁺，日本同仁，F374）；丙二醛（MDA，A003-1-2）和谷胱甘肽（GSH，A006-1-1）检测试剂盒（南京建成）；DMEM培养基（Gibco，11320033）；异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，R510-22）。恒温细胞培养箱、高速离心机和多功能酶标仪（Thermo）；荧光显微镜（Leica）；Western blotting电泳、转膜及化学发光成像系统（Bio-Rad）；OGD专用缺氧小室（Billups-Rothenberg）。

1.2 实验方法

1.2.1 HIBD模型制备及药物干预

本研究选取24只新生小鼠，采用随机分组法将其划分为假手术组（Sham）、模型组（HIBD）、FMN低剂量干预组（HIBD+FMN-L，50 mg/kg）及高剂量干预组（HIBD+FMN-H，100 mg/kg），6只/组。为避免药物的毒性，干预浓度根据已有参考文献确定^{［19，20］}。HIBD动物模型的建立选用了经典的Rice-Vannucci模型^［21］。具体为小鼠首先接受异氟烷麻醉处理，仰卧位固定于手术台上，随后在体视显微镜下实施左侧颈总动脉结扎术，以实现血流阻断。完成上述操作后，小鼠被转移至含92% N₂和8% O₂的低氧环境中，持续暴露40 min以诱导HIBD模型，可通过行为学观察对侧肢体偏瘫来确定造模的成功。假手术组仅进行左侧颈总动脉暴露，未实施血管结扎及低氧处理。FMN采用DMSO助溶后用生理盐水进行配制，通过腹腔注射途径给药，具体时间点为血管结扎术前1 h、低氧暴露后1 h及12 h。假手术组及模型组给予等体积的溶剂于上述时间点分别进行注射。直至第3 天麻醉处死小鼠，选取脑皮层缺血半暗带组织进行检测。

1.2.2 细胞培养和OGD模型建立

取处于对数生长期、融合度约70%的HT22细胞进行实验，随机设定以下分组：正常对照组（Control）、氧糖剥夺组（OGD）、FMN处理组（OGD+FMN，100 μmol/L）、Nutlin-3干预组（OGD+Nutlin-3，10 μmol/L）以及FMN与Nutlin-3联合处理组（OGD+FMN+Nutlin-3）。作为体内实验的对照，体外实验我们采用OGD处理来模拟缺氧缺血性脑损伤模型^［22］。在实施OGD前，细胞分别经FMN或P53激活剂Nutlin-3预处理1 h，之后更换为无糖培养基，并移入密闭缺氧小室。向小室内持续通入95% N₂与5% CO₂的混合气体以建立缺氧环境，于37 ℃条件下培养6 h，成功诱导OGD模型。正常对照组细胞则在含糖完全培养基中于正常氧条件下培养相同时间。处理结束后，使用0.5%胰酶消化并收集细胞，以备后续检测分析。

1.2.3 Western blotting检测铁死亡相关蛋白

使用RIPA裂解液从细胞或组织样本中提取蛋白，并通过BCA法蛋白定量以确保持一致的上样量（20 μg）。样本经95 ℃高温变性后，通过SDS-PAGE进行分离，随后利用湿转法将蛋白转移至PVDF膜。转印完成后，用5%脱脂牛奶-TBST溶液室温封闭2 h以消除非特异性结合。随后，将膜与针对目标蛋白（P53、SAT1、ACSL4）及内参β-actin的一抗（1：1000稀释）在4 ℃下孵育过夜。次日，用TBST充分洗涤膜3次，每次5 min，再与HRP标记的二抗（1∶2000稀释）于室温孵育1 h，并再次进行TBST洗涤。最后，使用化学发光试剂（ECL）进行反应，在成像系统下采集信号图像。所得图像通过Image J软件对条带灰度值进行分析，并以β-actin作为内参进行标准化。

1.2.4 双重免疫荧光染色

脑组织切片及HT22细胞经PBS清洗后，使用0.5% Triton X-100室温通透5 min。随后，以10%胎牛血清（FBS）封闭非特异性抗原1 h。接着，样品与混合的一抗（分别为兔抗P53和小鼠抗NeuN混合、兔抗4-HNE和小鼠抗NeuN混合，均1∶400稀释）在4 ℃下孵育过夜。PBS充分洗涤后，于避光条件下与荧光二抗（Alexa Fluor™ 594标记的抗兔IgG与Alexa Fluor™ 488标记的抗小鼠IgG，均1∶800稀释）室温孵育2 h。再次洗涤后，使用含DAPI的封片剂封片以复染细胞核。最后，在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.5 铁离子水平检测

采用可见分光光度法检测小鼠脑皮层缺血半暗带组织中亚铁离子的含量。根据组织质量和提取液体积1∶10的比例在冰上进行匀浆，10 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液待测。37 ℃预热30 min，酶标仪测定吸光度A_{593 nm}。按照标准曲线，计算组织样品中的亚铁离子含量。采用FerroOrange荧光探针检测HT22细胞的铁离子荧光强度。将培养好的细胞爬片用HBSS清洗细胞3次，加入浓度为1 μmol/L的FerroOrange染色工作液，在5% CO₂细胞培养箱中培养30 min。无需清洗直接在荧光显微镜下进行观测，并分析荧光强度的水平。

1.2.6 活性氧（ROS）水平检测

体外和体内实验ROS的检测分别选用DHE和DCFH-DA荧光探针试剂盒，并均用荧光显微镜进行成像分析。脑组织切片和10 μmol/L的DHE工作液一起在37 ℃孵育30 min进行荧光探针装载，随后经过适当洗涤，用荧光显微镜拍摄观测。类似的，HT22细胞选用5 μmol/L的DCFH-DA工作液与细胞共同孵育，以检测ROS的荧光水平。

1.2.7 脂质过氧化和氧化还原反应检测

BODIPY 581/591 C11荧光探针是检测脂质过氧化（LPO）水平的金标准，当还原态产物经脂质过氧化氢物氧化后，红色荧光向绿色荧光转变，其比值反映脂质过氧化水平。对于HT22贴壁细胞，用浓度为2 μmol/L BODIPY 581/591 C11染色工作液，于细胞培养箱中孵育细胞10 min，PBS洗涤后采用不同激发光观测红绿光的比值。此外，丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）分别检测了脂质氧化和氧化还原水平。通过提取组织或细胞的上清液，并加入检测试剂孵育后，用酶标仪测定MDA的吸光度值A_{532 nm}，GSH的吸光度值A_{420 nm}。

1.2.8 线粒体膜电位及细胞活力检测

以JC-1为荧光探针来检测线粒体膜电位（MMP）的水平。线粒体膜电位较高时，JC-1为聚合物，产生红色荧光；相反，线粒体膜电位较低时，JC-1为单体，产生绿色荧光。因此，在HT22细胞中加入JC-1染色工作液并孵育20 min，通过荧光显微镜观测红绿光的比值能反应细胞的损伤程度。另外，细胞活力选用经典的CCK-8试剂盒，采用比色法进行吸光度检测A_{450 nm}。

1.2.9 统计学分析

实验数据均以均值±标准差表示，通过GraphPad Prism 9.5.1软件完成所有统计分析。多组间比较在进行方差齐性检验后，选用单因素方差分析进行组间差异统计。所有实验均独立重复3次，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FMN降低HIBD后P53/SAT1/ACSL4蛋白的表达

在动物实验中，通过Western blotting检测新生小鼠HIBD后3 d的脑皮层缺血半暗带组织的蛋白表达情况。结果显示，与Sham组相比，HIBD组P53、SAT1、ACSL4蛋白表达水平显著升高（P<0.001）；而在施用FMN的HIBD+FMN-L组和HIBD+FMN-H组中，P53、SAT1、ACSL4蛋白表达水平较HIBD组明显降低（P<0.05），且HIBD+FMN-H组的降低幅度更显著（P<0.01，图1）。

2.2 FMN下调HIBD后P53及4-HNE的荧光强度

P53与NeuN的双重免疫荧光实验结果显示，相比于Sham组，HIBD组神经元中P53荧光强度显著上升（P<0.001）；而与HIBD组相比，HIBD+FMN-L组和HIBD+FMN-H组神经元中P53荧光强度均显著降低（P<0.01），且高剂量FMN干预降低幅度更明显（P<0.001，图2A、B）。此外，铁死亡特征蛋白4-HNE与NeuN共标的荧光强度结果显示，与Sham组相比，HIBD组神经元中4-HNE荧光强度显著升高（P<0.001）；FMN干预后，4-HNE 荧光强度显著下降（P<0.01，图2C、D）。

2.3 FMN改善HIBD后铁离子积累、氧化应激及脂质过氧化物损伤

亚铁离子是铁死亡发生的核心介质，其结果显示，与Sham组相比，HIBD组Fe²⁺的表达量显著升高（P<0.001）；与HIBD组相比，HIBD+FMN-L组和HIBD+FMN-H组Fe²⁺的表达量均显著降低（P<0.05，图3A）。DHE探针用于指示超氧化物阴离子ROS的水平，其荧光染色结果显示，与Sham组相比，HIBD组红色荧光分布更密集（P<0.001）；而FMN处理组红色荧光明显减少（P<0.001，图3B、C），MDA是脂质过氧化的标志性产物，其结果显示，与Sham组相比，HIBD组MDA的表达量显著上调（P<0.001）；与HIBD组相比，FMN干预后，HIBD后的脂质过氧化损伤减轻（P<0.01，图3D）。GSH是重要的内源性抗氧化分子，其结果显示，相比于Sham组，HIBD组GSH的表达量显著下降（P<0.001）；与HIBD组相比，使用FMN干预后，HIBD后脑组织的抗氧化能力提升（P<0.05，图3E）。

2.4 FMN对神经元OGD后P53/SAT1/ACSL4通路的抑制作用被Nutlin-3逆转

在HT22神经元OGD模型中，Western blotting结果显示，与Control组相比，OGD组P53、SAT1和ACSL4的蛋白表达水平显著增强（P<0.01）；而与OGD组相比，FMN处理后P53、SAT1和ACSL4的蛋白表达水平显著减弱（P<0.05）。当使用P53激动剂Nutlin-3（OGD+Nutlin-3组），P53、SAT1和ACSL4蛋白表达量较OGD组进一步升高（P<0.05）。联合使用FMN与Nutlin-3（OGD+FMN+Nutlin-3组）时，P53、SAT1和ACSL4蛋白表达水平较OGD+FMN组同样显著提高（P<0.05，图4A~D）。通过双重免疫荧光对P53与NeuN进行定量分析显示，与Western blotting结果一致，进一步验证FMN可下调OGD后神经元中P53的表达（P<0.01），且该作用被P53激动剂有效阻滞（P<0.05，图4E、F）。

2.5 FMN通过靶向抑制P53信号减轻神经元铁死亡相关指标

铁死亡的生化指标结果显示，与Control组相比，OGD组神经元内Fe²⁺荧光强度显著增强（P<0.001，图5A、B），DCFH-DA荧光强度明显升高（P<0.001，图5C、D），BODIPY-C11氧化/还原比例显著上升（P<0.01，图5E、F），MDA含量显著增加（P<0.001，图5G），而GSH表达显著降低（P<0.001，图5H）。而给予FMN处理后，与OGD组相比，显示出相反的结果，FMN可改善OGD诱导的铁超载（P<0.001）、抑制ROS生成（P<0.05）与脂质过氧化（P<0.05）、缓解氧化应激（P<0.01）。在OGD组和OGD+FMN组均施加Nutlin-3干预后，FMN对上述改善铁死亡的效果被减弱（P<0.05）。

2.6 FMN对神经元OGD后的线粒体膜电位和细胞活力具有保护作用

JC-1（图6A、B）及CCK-8（图6C）实验结果显示，Control组中神经元多以红色荧光为主，JC-1聚集体/单体比值较高。OGD组与Control组相比，绿色荧光显著增加，红色荧光明显减少，JC-1聚集体/单体比值显著降低（P<0.001），细胞活力也明显下降（P<0.001）。然而，FMN干预组可改善OGD引起的线粒体膜电位下降（P<0.05）并增强细胞活力（P<0.01）。此外，OGD+Nutlin-3组JC-1聚集体/单体比值较OGD组进一步降低（P<0.05），细胞活力也显著降低（P<0.001）。其次，与OGD+FMN组相比，OGD+FMN+Nutlin-3组的Nutlin-3施用抵消了FMN对OGD损伤神经元线粒体膜电位及细胞活力的保护作用。

3 讨论

本研究通过整合体内新生小鼠HIBD模型与体外HT22神经元OGD模型，系统地探讨了FMN对缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用及其分子机制。所选模型的意义在于新生小鼠HIBD模型能够较好地模拟人类新生儿因围产期窒息所导致的脑损伤病理过程。而HT22小鼠海马神经元系因其均质性和对氧化应激的敏感性，被广泛用于模拟HIBD的神经元损伤，其进行OGD处理被视为经典的体外模型。这两个模型的结合，虽然无法完全复制临床疾病的复杂性，但为在可控条件下深入研究FMN的细胞特异性机制提供了有力平台。本研究结果揭示，FMN能够显著改善HIBD后的神经功能损伤，其核心保护机制在于通过抑制P53/SAT1/ACSL4信号通路，进而有效遏制神经元铁死亡这一关键病理过程。

缺氧缺血性脑损伤的病理机制极为复杂，涉及兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应及细胞程序性死亡等多种途径^［23-25］。近年来，铁死亡作为一种铁依赖性的、以脂质过氧化物大量累积为特征的调节性细胞死亡形式，在HIBD的发病过程中被证实扮演了至关重要的角色^{［26， 27］}。多项研究表明，在HIBD后，皮层、海马等易感脑区的神经元呈现出典型的铁死亡特征，而使用铁死亡抑制剂（如Ferrostatin-1）可显著减轻脑损伤和神经功能缺损^［28］。因此，靶向抑制铁死亡已成为神经保护领域一个有前景的方向，而寻找能够高效透过血脑屏障且副作用小的天然铁死亡抑制剂具有重要的临床意义。本研究证实，FMN治疗能够有效逆转HIBD及OGD诱导的铁死亡典型特征，包括降低亚铁离子（Fe²⁺）和脂质过氧化物（如MDA）的水平、恢复抗氧化物质GSH的含量、减少ROS的生成，并最终改善线粒体膜电位和细胞活力。这些结果强有力地表明，FMN的神经保护效应与抑制铁死亡密切相关。

为了深入阐释FMN作用的分子靶点，我们将研究焦点集中于P53/SAT1/ACSL4这条经典但又被忽视的铁死亡调控通路上。P53作为一个多功能的转录因子，其角色远不止于肿瘤抑制。在应对基因毒性、氧化应激等刺激时，P53可被迅速激活，并通过转录依赖或非依赖的方式调控细胞命运决定^［29］。近年来，P53在铁死亡中的“推手”作用逐渐清晰：它能够直接转录上调SAT1等促铁死亡基因^［30］。SAT1是多胺代谢通路中的限速酶，其上调会促进毒性代谢物的产生，加剧氧化应激，并进一步放大ACSL4的表达^{［31， 32］}。而ACSL4已被确认为铁死亡的核心正调控分子，它通过催化长链多不饱和脂肪酸的酯化，为脂质过氧化反应提供丰富底物，其表达水平直接决定了细胞对铁死亡的敏感性^［33］。因此，P53/SAT1/ACSL4轴构成了一个连贯的促铁死亡信号放大器。本研究的创新性在于，首次在HIBD背景下，将FMN的保护作用与抑制这一完整信号轴联系起来。

本研究的体内和体外实验结果一致表明，HIBD和OGD应激能够显著上调P53的蛋白表达，而FMN预处理则能有效抑制这一上调。这一系列变化在蛋白水平上勾勒出一条完整的信号传导链条：FMN能够抑制P53，进一步下调SAT1 并降低ACSL4。更重要的是，本研究通过使用P53特异性激动剂Nutlin-3进行的反向验证实验，为FMN的作用机制提供了证据。当使用Nutlin-3激活P53信号后，FMN所介导的对铁死亡关键指标（如ACSL4表达、Fe²⁺积聚、脂质过氧化）的改善作用被显著削弱甚至逆转。这一结果将P53作为FMN发挥抗铁死亡作用的上游重要节点。

SAT1及ACSL4的下调直接解释了FMN处理后所观察到的脂质过氧化水平（通过BODIPY-C11和MDA评估）显著降低的现象，因为可用于过氧化的脂质底物减少了。此外，本研究观测到的FMN对细胞内Fe²⁺积聚的抑制作用，也可能与P53/SAT1通路存在关联。虽然其具体机制尚未完全阐明，但有研究表明P53的激活可能影响铁代谢相关蛋白（如转铁蛋白受体和铁蛋白）的表达，从而改变细胞内铁稳态^［34］。FMN通过抑制P53，可能间接调节了铁代谢，减少了毒性游离铁的累积，这与其降低ROS和脂质过氧化的效应协同作用，共同抵抗铁死亡。同时，GSH水平的恢复提示FMN可能也部分增强了对氧化应激的整体抵抗能力。GSH是GPX4的必需辅因子，而GPX4是细胞内最重要的脂质过氧化物清除酶，其活性下降是铁死亡的标志性事件^{［13， 35］}。然而，FMN是否直接影响铁死亡的核心防御蛋白GPX4的活性或表达，本研究并未涉及，这是未来需要深入探究的重要问题。

综上所述，本研究不仅验证了FMN的神经保护功效，更重要的是阐明了一条由P53/SAT1/ACSL4轴介导的、FMN抑制神经元铁死亡的新视角。这一发现为理解天然产物在对抗程序性细胞死亡中的作用提供了新的理论依据。从转化医学的角度看，本研究强化了“抑制铁死亡”作为HIBD治疗策略的可行性，并提示FMN或其结构优化衍生物有望成为一类通过靶向P53通路来发挥神经保护作用的化合物。尽管本研究取得了一些发现，但仍存在若干局限性。首先，本研究使用的模型系统简化了HIBD的体内微环境，FMN对胶质细胞及其与神经元交互作用的影响尚不明确。其次，本研究虽然确定了P53是FMN作用的关键上游节点，但FMN是与P53是直接还是间接结合，还需进一步验证。最后，将FMN推向临床前研究，还需要在其长期疗效、给药时间窗、以及大型动物模型中的安全性及有效性进行评估。这些都将是未来研究的重点方向。

参考文献

[1] Geisinger R, Rios DR, McNamara PJ, et al. Asphyxia, therapeutic hypothermia, and pulmonary hypertension[J]. Clin Perinatol, 2024, 51(1): 127-49. doi：10.1016/j.clp.2023.11.007

[2] You Q, Lan XB, Liu N, et al. Neuroprotective strategies for neonatal hypoxic-ischemic brain damage: Current status and challenges[J]. Eur J Pharmacol, 2023, 957: 176003. doi：10.1016/j.ejphar.2023.176003

[3] Guan Y, Yang L, Cui H. Extracellular vesicles derived from different brain tissue cells: a potential therapeutic measure for hypoxic-ischemic brain injury in immature brains[J]. Histol Histopathol, 2025, 40(11): 1719-32.

[4] Han JN, Xu Y, Zhou Y, et al. Therapeutic hypothermia and recombinant erythropoietin mitigate brain microvascular endothelial cell dysfunction via modulating the pentose phosphate pathway[J]. J Mol Neurosci, 2025, 75(2): 65. doi：10.1007/s12031-025-02356-1

[5] 霍启晓, 高淑君, 徐 康, 等. 低氧预处理人牙髓干细胞调控铁死亡减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤[J].中国儿童保健杂志, 2025, 33(9): 976-81.

[6] Hu XD, Bao YT, Li M, et al. The role of ferroptosis and its mechanism in ischemic stroke[J]. Exp Neurol, 2024, 372: 114630. doi：10.1016/j.expneurol.2023.114630

[7] Huang QY, Tang JH, Xiang Y, et al. 4-Benzyl-2-methyl-1, 2, 4-thiadiazolidine-3, 5-Dione rescues oligodendrocytes ferroptosis leading to myelin loss and ameliorates neuronal injury facilitating memory in neonatal hypoxic-ischemic brain damage[J]. Exp Neurol, 2025, 390: 115262. doi：10.1016/j.expneurol.2025.115262

[8] 郭 涛, 左涵珺, 匡显锋, 等. 小胶质细胞介导的铁死亡在缺氧缺血性脑损伤中的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志, 2025, 41(6): 552-8.

[9] Lin JJ, Deng L, Qi AL, et al. Catalpol alleviates hypoxia ischemia-induced brain damage by inhibiting ferroptosis through the PI3K/NRF2/system Xc-/ GPX4 axis in neonatal rats[J]. Eur J Pharmacol, 2024, 968: 176406. doi：10.1016/j.ejphar.2024.176406

[10] Liu Y, Stockwell BR, Jiang X, et al. p53-regulated non-apoptotic cell death pathways and their relevance in cancer and other diseases[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2025, 26(8): 600-14. doi：10.1038/s41580-025-00842-3

[11] 邓 伟, 刘喜燕, 郭丽媛, 等. AngⅡ激活p53/SAT1信号通路诱导白色脂肪细胞铁死亡[J]. 中国动脉硬化杂志, 2025, 33(5): 385-94. doi：10.20039/j.cnki.1007-3949.2025.05.003

[12] Yang TF, Zhang SY, Nie K, et al. WWOX-mediated p53/SAT1 and NRF2/FPN1 axis contribute to toosendanin-induced ferroptosis in hepatocellular carcinoma[J]. Biochem Pharmacol, 2025, 233: 116790. doi：10.1016/j.bcp.2025.116790

[13] 陈鑫源, 吴成挺, 李瑞迪, 等. 双术汤通过P53/SLC7A11/GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡[J].南方医科大学学报, 2025, 45(7): 1363-71.

[14] Xiao D, Chang W, Ao X, et al. Parkin inhibits iron overload-induced cardiomyocyte ferroptosis by ubiquitinating ACSL4 and modulating PUFA-phospholipids metabolism[J]. Acta Pharm Sin B, 2025, 15(3): 1589-607. doi：10.1016/j.apsb.2024.12.027

[15] 李友宽, 史 焱, 段琳楠, 等. 刺芒柄花素对脑卒中后自噬、炎症和氧化应激的交互作用[J].中国细胞生物学学报, 2023, 45(10): 1551-7.

[16] 郭 涛, 左涵珺, 石金沙, 等. 刺芒柄花素增强脑缺血半暗带自噬流改善神经损伤[J]. 生物化学与生物物理进展, 2024, 51(12): 3253-65.

[17] Xie D, Jiang Y, Wang H, et al. Formononetin triggers ferroptosis in triple-negative breast cancer cells by regulating the mTORC1/SREBP1/SCD1 pathway[J]. Front Pharmacol, 2024, 15: 1441105. doi：10.3389/fphar.2024.1441105

[18] 李 恒.豆科植物红三叶草提取物刺芒柄花素联合运动减轻心梗大鼠心肌损伤的研究[J].分子植物育种, 2025, 23(1): 254-63.

[19] Pingale TD, Gupta GL. Acute and sub-acute toxicity study reveals no dentrimental effect of formononetin in mice upon repeatedi.p.dosing[J]. Toxicol Mech Meth, 2023, 33(8): 688-97. doi：10.1080/15376516.2023.2234026

[20] Xiao QP, Huang JQ, Zhu XY, et al. Formononetin ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis via enhancing antioxidant capacity, promoting tight junction protein expression and reshaping M1/M2 macrophage polarization balance[J]. Int Immuno-pharmacol, 2024, 142: 113174. doi：10.1016/j.intimp.2024.113174

[21] Ourednik J, Ourednik V, Ghosh N, et al. Protocol to optimize the Rice-Vannucci rat pup model of perinatal asphyxia to ensure predictable hypoxic-ischemic cerebral lesions[J]. STAR Protoc, 2024, 5(2): 103025. doi：10.1016/j.xpro.2024.103025

[22] Yu LT, Liu SX, Zhou RX, et al. Atorvastatin inhibits neuronal apoptosis via activating cAMP/PKA/p-CREB/BDNF pathway in hypoxic-ischemic neonatal rats[J]. FASEB J, 2022, 36(4): e22263. doi：10.1096/fj.202101654rr

[23] Fang F, Tang JX, Geng JQ, et al. N-acetylserotonin derivative ameliorates hypoxic-ischemic brain damage by promoting PINK1/Parkin-dependent mitophagy to inhibit NLRP3 inflammasome-induced pyroptosis[J]. Int Immunopharmacol, 2025, 153: 114469. doi：10.1016/j.intimp.2025.114469

[24] Jin N, Sha S, Ruan Y, et al. Identification and analysis of oxidative stress-related genes in hypoxic-ischemic brain damage using bioinformatics and experimental verification[J]. Immun Inflamm Dis, 2024, 12(8): e70000. doi：10.1002/iid3.70000

[25] 左涵珺, 段兆达, 王 朝, 等. 天麻素经PI3K/AKT通路改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后小胶质细胞介导的炎症反应[J]. 南方医科大学学报, 2024, 44(9): 1712-9. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2024.09.11

[26] Wang XX, Li M, Xu XW, et al. BNIP3-mediated mitophagy attenuates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats by inhibiting ferroptosis through P62-KEAP1-NRF2 pathway activation to maintain iron and redox homeostasis[J]. Acta Pharmacol Sin, 2025, 46(1): 33-51. doi：10.1038/s41401-024-01365-x

[27] Luo L, Deng L, Chen Y, et al. Identification of lipocalin 2 as a ferroptosis-related key gene associated with hypoxic-ischemic brain damage via STAT3/NF‑κB signaling pathway[J]. Antioxidants: Basel, 2023, 12(1): 186. doi：10.3390/antiox12010186

[28] Zheng JY, Fang Y, Zhang M, et al. Mechanisms of ferroptosis in hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats[J]. Exp Neurol, 2024, 372: 114641. doi：10.1016/j.expneurol.2023.114641

[29] Temaj G, Chichiarelli S, Telkoparan-Akillilar P, et al. P53: a key player in diverse cellular processes including nuclear stress and ribosome biogenesis, highlighting potential therapeutic compounds[J]. Biochem Pharmacol, 2024, 226: 116332. doi：10.1016/j.bcp.2024.116332

[30] Zhou C, Xu Z, Ding S, et al. Benzo(a)Pyrene-7, 8-dihydrodiol-9, 10-epoxide (BPDE) Induces Ferroptosis in Rat Cortical Neurons via p53-SLC7A11-ALOX12/p53-SAT1-ALOX15 Pathways[J]. J Appl Toxicol, 2025, 45(8): 1637-48. doi：10.1002/jat.4798

[31] Liu L, Wen T, Xiao Y, et al. Sea buckthorn extract mitigates chronic obstructive pulmonary disease by suppression of ferroptosis via scavenging ROS and blocking p53/MAPK pathways[J]. J Ethnopharmacol, 2025, 336: 118726. doi：10.1016/j.jep.2024.118726

[32] Chen F, Su MH, Han D, et al. METTL14 depletion ameliorates ferroptosis in severe acute pancreatitis by increasing the N6-methyladenosine modification of ACSL4 and STA1[J]. Int Immunopharmacol, 2024, 128: 111495. doi：10.1016/j.intimp.2024.111495

[33] Jia B, Li J, Song Y, et al. ACSL4-mediated ferroptosis and its potential role in central nervous system diseases and injuries[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(12): 10021. doi：10.3390/ijms241210021

[34] Hou Y, Tang G, Wang Q, et al. Transferrin receptor 1 nuclear translocation facilitates tumor progression via p53-mediated chromatin interactions and genome-wide alterations[J]. Signal Transduct Target Ther, 2025, 10(1): 212. doi：10.1038/s41392-025-02297-6

[35] Wang X, Shen T, Lian J, et al. Resveratrol reduces ROS-induced ferroptosis by activating SIRT3 and compensating the GSH/GPX4 pathway[J]. Mol Med, 2023, 29(1): 137. doi：10.1186/s10020-023-00730-6

基金资助

国家自然科学基金(32460218)

国家自然科学基金(31960194)

昆明医科大学博士研究生创新基金(J114150330296)

大学生创新训练计划基金(2024CYD038)

大学生创新训练计划基金(S202410674118)

大学生创新训练计划基金(S202510674161)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021