柴胡疏肝散加减可改善胆囊胆固醇结石肝郁证小鼠肝郁和结石程度

Modified Chaihu Shugan Powder alleviates cholesterol gallstones in mice with liver depression syndrome by regulating gut microbiota and bile acid metabolism

摘要

目的 探讨柴胡疏肝散加减对胆囊胆固醇结石（CS）肝郁证模型小鼠的治疗作用及其可能通过调节肠道菌群与胆汁酸代谢发挥作用的机制。 方法 将60只6周龄C57BL/6雄性小鼠按体质量分区间法随机分为空白组（n=9）、模型组（n=51），模型组小鼠予2%高脂致石饲料喂养8周，建立CS小鼠模型。8周CS造模后随机取3只模型组小鼠查看胆囊结石情况，将剩余48只小鼠分为CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散组及熊去氧胆酸组，12只/组。除CS组外，其余3组采用“慢性不可预见性温和应激（CUMS）+孤养”法建立CS肝郁证小鼠模型，柴胡疏肝散组、熊去氧胆酸组分别予柴胡疏肝散加减和熊去氧胆酸浓缩液（0.02 mL/g）灌胃，其余组灌胃等量生理盐水，连续干预3周。观察肝郁证造模期间小鼠一般情况及体质量变化；造模前后对各组小鼠进行行为学实验；HE染色观察回肠组织病理学变化；ELISA检测胆汁中总胆固醇、总胆汁酸含量；q-PCR检测回肠组织中G蛋白偶联胆汁酸受体GPbar1 （TGR5）、胰高血糖素样肽-1/2的mRNA表达；16SrDNA测序与代谢组学检测小鼠粪便与肠内容物的微生物多样性与胆汁酸。 结果 与空白组及CS组比较，CS肝郁组小鼠体质量下降（P<0.01），渐趋淡漠懒动、反应迟钝；行为学指标显示旷场移动总距离、中心停留时间、糖水消耗减少（P<0.05），游泳、悬尾不动时间增加（P<0.05）；胆囊体积胀大、结石晶体明显，胆汁浑浊；肠绒毛变短、肠道形态破坏；胆汁总胆固醇含量增高（P<0.05）、总胆汁酸含量降低（P<0.05）；肠GLP1/2、TGR5的mRNA表达均升高（P<0.01）。与CS肝郁组相比，柴胡疏肝散加减组小鼠体质量升高（P<0.05）；行为学指标显示旷场移动总距离、中心停留时间、糖水消耗增加（P<0.05），游泳、悬尾不动时间减少（P<0.05）；胆囊体积缩小、结石晶体减少、胆汁清透；上述肠、胆囊病理改变恢复；胆汁总胆固醇降低（P<0.01）、总胆汁酸增高（P<0.05）；肠GLP1/2、TGR5的mRNA表达降低（P<0.01）。肠道菌群检测显示，结石组和结石肝郁组的ace指数、Shannon指数降低（P<0.01）；疣微菌门及其主要菌属阿克曼氏菌属在CS组、CS肝郁组相对丰度上调（P<0.01），拟杆菌门及其主要菌属Muribaculaceae在CS组下调（P<0.01）；胆汁酸谱分析显示，CS组牛磺脱氧胆酸、脱氧胆酸、甘脱氧胆酸上调（P<0.05），CS肝郁组胆酸、3-酮脱氧胆酸上调；相关性分析显示，促石胆汁酸与有害菌正相关，脱氧胆酸与扭瘤胃球菌群、毛螺菌科丰度呈正相关（P<0.05）；甘脱氧胆酸、GCA、牛磺脱氧胆酸与土里肠杆菌属、扭瘤胃球菌群丰度呈正相关（P<0.01）。 结论 柴胡疏肝散加减可以改善胆囊胆固醇结石肝郁证模型小鼠肝郁程度和结石程度，其机制可能与改善肠道菌群紊乱及胆汁酸代谢有关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effect of modified Chaihu Shugan San (CHSGS) in mice with cholesterol gallstones (CS) and liver depression syndrome and its potential mechanism. Methods Sixty male C57BL/6 mice were randomly divided into blank group (n=9) and model group (n=51) with CS induced by high-lithogenic diet feeding. After verification of successful modeling in 3 mice, the remaining 48 mouse models were divided into CS group, CS-liver depression (CS-LD) group, CHSGS group, and ursodeoxycholic acid (UDCA) group, and the latter 3 groups were subjected to CS-LD modeling by chronic unpredictable mild stress (CUMS) and solitary raising and treated with saline, CHSGS or UDCA gavage for 3 weeks. The mice were assessed for general state, body weight, depressive behavior, ileal pathologies, biliary total cholesterol (TC) and total bile acid (TBA) levels, and ileal mRNA expressions of TGR5, GLP-1, and GLP-2 using q-PCR. 16S rDNA sequencing and metabolomics studies were used to analyze fecal microbiota and bile acids of the mice. Results Compared to the blank control and CS mice, the CS-LD mouse models showed decreased body weight, depressive behaviors, enlarged gallbladder with crystals, intestinal villi damage, increased biliary TC, decreased TBA, and increased ileal GLP-1/2 and TGR5 mRNA expressions, which were obviously improved by CHSGS treatment. Microbiota analysis revealed decreased alpha diversity in CS and CS-LD groups, with altered abundances of Verrucomicrobiota, Akkermansia, Bacteroidota, and Muribaculaceae. Bile acid profiling revealed significant upregulation of TDCA, DCA, and GDCA in CS group and increased CA and 3-ketodeoxycholic acid levels in CS-LD group. Correlation analysis suggested positive correlations between pro-lithogenic bile acids and the harmful gut bacteria. Conclusion Modified CHSGS alleviates liver depression and cholesterol gallstones in mice likely by ameliorating gut microbiota dysbiosis and bile acid metabolism disorders.

Graphical abstract

胆囊胆固醇结石（CS）是胆囊结石中最常见的类型，在胆固醇、胆红素、钙盐及混合型结石等类型划分中约占80%，是临床常见的消化系统疾病，成人患病率达6%~10%^［1］。其发生发展是遗传、代谢、环境等多因素相互作用的结果，女性、肥胖及快速减肥者风险尤高^［2］。CS不仅引发胆绞痛等并发症，患者还常伴有焦虑、抑郁等异常情绪状态。现有治疗常采用“金标准”腹腔镜下胆囊切除术和保胆取石术两种治疗方式，又随着“保胆”到“切胆”治疗理念的日益转变，胆囊切除现为治疗胆结石的首选方法，两者分别存在术后肝功能异常、术后残石率及复发率等问题^{［3， 4］}。因此探寻非手术疗法，尤其从发病机制入手探索有效干预策略具有重要意义。

中医学将CS归属于“胆石症”范畴，认为其病位在胆，肝郁为其核心病机^［5］。情志不畅，肝失疏泄，则胆腑通降失常，胆汁淤积，久郁成石，即“肝郁致石”之理论^［6］。临床患者的焦虑抑郁状态，正是肝郁证的外在表现。柴胡疏肝散加减作为疏肝理气、利胆排石的经典方剂，临床加减应用对缓解CS患者肝郁症状及促进排石具有良好效果^［7］。

研究发现，肠道菌群稳态与胆汁酸代谢的精密调控在CS形成中扮演核心角色^［8］。肝脏合成的初级胆汁酸进入肠道后，其代谢转化高度依赖于肠道菌群：具有胆盐水解酶活性的细菌（如拟杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属等）将其去结合化生成游离胆汁酸；继而由具有7α-脱羟基酶活性的特定细菌（如梭菌属某些菌种）将其转化为次级胆汁酸^［9］。肠道菌群紊乱可打破胆汁酸代谢平衡，影响胆汁胆固醇溶解度，从而促进CS形成。中医“肝郁”状态与现代医学所指的应激、神经内分泌调节异常密切相关，可显著影响肠道菌群组成与功能及胆汁酸代谢通路。这为理解“肝郁”与“结石”之间的生物学桥梁提供了新视角。

课题组前期及相关研究表明^［10-13］，柴胡疏肝散加减及其单味药如柴胡、白芍能够通过增强胆囊收缩功能，缓解临床胆石症患者诸如胁肋腹胀痛、口苦等相关症状，促石排出。但柴胡疏肝散加减是否通过“肠道菌群–胆汁酸代谢”轴发挥整体调节作用，目前尚缺乏系统研究。因此，本研究立足于“肝郁–结石–菌群–胆汁酸”机制，建立CS肝郁证小鼠模型，从行为表现、病理改变、菌群结构、胆汁酸代谢及相关信号通路等多角度，系统探讨柴胡疏肝散加减方的治疗效应及其机制，以明确其是否通过调节肠道菌群与胆汁酸代谢发挥疏肝利胆、解郁排石的作用，为中医药防治胆石症提供新的实验依据和治疗思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只6周龄C57BL/6雄性小鼠，体质量18±2 g，购于北京华阜康动物有限责任公司［许可证编号：SCXK（京）2019-0008，合格证编号：110322231103290958］。小鼠饲养于福建中医药大学实验动物研究中心SPF级屏障系统（SYXK（闽）2023-0004），环境温度18~22 ℃，湿度50%~55%，光照12 h/d。小鼠适应性喂养普通饲料和自由饮用水1周后，无不良反应且饮食正常者纳入实验。实验操作遵循动物伦理审查标准（伦理批号：FJTCM IACUC 2023343）。

1.2 饲料及药物

普通饲料含60%碳水化合物、22%蛋白质、10%脂肪、8%纤维（福建中医药大学实验动物中心）；高脂致石饲料含15%脂肪、1.25%胆固醇、0.5%胆盐（南通特洛菲饲料科技有限公司）。所有实验动物饲料在准入SPF级屏障前，需完成高温消毒和紫外线消毒2道处理程序。

药物根据（急、慢性）胆囊炎、胆石症中医诊疗专家共识（2023）^［14］中胆石症肝郁证推荐汤剂以及课题组前期研究用药^［15］选用柴胡疏肝散加减方：柴胡15 g、白芍30 g、枳壳10 g、香附9 g、川芎9 g、陈皮9 g、金钱草15 g、炙甘草6 g（福建中医药大学附属第三人民医院中药房）。熊去氧胆酸胶囊（Dr.Falk Pharma GmbH公司），熊去氧胆酸溶液的配置浓度为2.5 mg/mL^［16］。

1.3 主要试剂及仪器

小鼠胆固醇（CH）ELISA检测试剂盒、小鼠胆固醇（TBA）ELISA检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司），RNAex柱式法RNA提取试剂、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒SYBR® Green Pro Taq HS、引物（福州瑞真生物技术有限公司）。

LRH-800-GSI型人工气候箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；EG1150H型生物组织包埋机、RM2245型石蜡切片机（Leica）；Illumina Nova Seq型机器（illumina）；Axio Imager A2型显微镜（Carl Zeiss）。

1.4 分组、造模及干预方法

将SPF级雄性C57BL/6雄性小鼠 60只，按体质量分区间法随机分成空白组（n=9）、CS模型组（n=51），其中空白组普通饲料喂养，CS模型组予以高脂致石饲料，8周CS造模后随机取3只模型组小鼠查看胆囊结石情况。成功构建CS模型后，将模型组剩余48只小鼠随机分为CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散加减组和熊去氧胆酸组，12只/组，继续以2%高脂致石饲料喂养，其中CS肝郁组、柴胡疏肝散组和熊去氧胆酸组小鼠每只单独鼠笼喂养，并进行周期为21 d的慢性不可预见性温和应激（CUMS）^［17］。

CUMS干预包括多种不同的应激方式，本实验采用的干预方法为：10 min悬尾、10 min热光刺激、10 min夹尾、2~5 h锯末移除、12 h 45°鼠笼倾斜、24 h湿垫料环境、12 h食水剥夺。每天随机选择上述中1种应激方式，且同一应激方法不能连续2 d使用。在肝郁证模型构建期间，持续监测小鼠的一般状况，进行1次/周体质量测量。在模型构建的前后阶段，对所有实验组小鼠进行行为学测试，包括旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验，用以评估肝郁证模型是否构建成功^［18］。

根据60 kg成人体质量进行等效药物剂量换算与干预，制备柴胡疏肝散加减与熊去氧胆酸浓缩液（分别为1.06 g/mL、2.5 mg/mL生药浓度，相当于成人临床使用剂量12倍的浓缩液）。连续21 d（每日单次给药），分别予柴胡疏肝散加减组与熊去氧胆酸组按0.02 mL/g体质量进行灌胃干预，其余各组灌胃等体积的生理盐水。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 一般情况

自造模起每周观察记录小鼠活动度、精神状态、饮食及体质量等情况。

1.5.2 行为学实验

肝郁证造模前后记录旷场实验移动总距离、中心停留时间、直立次数，强迫游泳实验静止不动时间，糖水偏好实验糖水消耗率，悬尾实验静止不动时间，以评估CS肝郁证小鼠模型是否成功。

1.5.2.1　旷场实验

将小鼠依次轻放于50 cm×50 cm×50 cm旷场箱中心，设定中央区为20 cm×20 cm区域，记录小鼠运动路程和穿越次数。

1.5.2.2　强迫游泳实验

准备高30 cm、直径20 cm的圆柱形透明水缸，水缸中加入自来水，温度控制在25 ℃左右，液面高度15 cm也可根据动物大小调整，共6 min，前2 min让小鼠适应环境，记录后4 min内小鼠不动时间。

1.5.2.3　糖水偏好试验

正式实验前小鼠需适应1%蔗糖水（2瓶/笼）。在正式实验阶段，小鼠被单独安置在饲养笼中，并接受12 h的禁食禁水，然后提供1%蔗糖水和纯水各1瓶，允许小鼠自由饮用1 h，对剩余液体进行称重，交换位置后再次称质量并详细记录。糖水偏好率（%）=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。

1.5.2.4　悬尾实验

使小鼠头部向下，用医用胶带将小鼠尾部悬挂固定在横杆上，前2 min用于让小鼠适应环境，记录后4 min内小鼠不动时间（共6 min）。小鼠在无法逃脱的情况下会逐渐放弃挣扎，表现出间断性不动状态。

1.5.3 结石情况观察

小鼠脱颈处死，摘下完整的胆囊，体视镜拍照。

1.5.4 HE染色法观察回肠组织病理学变化

解剖后摘取3 cm回肠组织并用生理盐水清理干净，将回肠组织切成形状规整的方形组织块，泡在4%多聚甲醛固定液中。将泡在固定液中的回肠组织进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明后，浸蜡包埋，切片，再经脱蜡、水化后，苏木素染色5~10 min，伊红染色20~30 s，最后制成封片放于显微镜下观察组织的病理变化。

1.5.5 胆汁检测

胆囊拍照后，收集胆汁存放于200 μL的微型离心管内。根据ELISA试剂盒说明，检测胆汁中TC和TBA水平。

1.5.6 RT-qPCR检测回肠组织中TGR5、GLP1/2的mRNA水平

将回肠组织研磨匀浆按照试剂盒说明书提取组织总核糖核酸。按照逆转录试剂盒说明书在50 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s条件下进行逆转录反应，将总核糖核酸逆转录成cDNA 抗体。随后参照试剂盒说明书配制q-聚合酶链反应体系，进行聚合酶链反应扩增。引物由福州瑞真生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

1.5.7 肠道微生物群分析

小鼠粪便样本采集完成后委托上海百趣生物科技有限公司开展肠道菌群16S rDNA测序工作，采用经典的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法，提取小鼠粪便样本中的微生物组总DNA，并经2%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。定量分析则借助紫外分光光度计完成。

选择16SrDNA常用扩增片段V3-V4区上下游引物分别为341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'），扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳确证，并由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics）、Qubit（Invitrogen）分别进行纯化和定量，采用AMPure XT beads试剂盒回收。

1.5.8 肠内容物胆汁酸高通量靶标定量检测

胆汁酸代谢定量与方法学考察肠道微生物群与宿主代谢之间存在相互作用，对空白组、CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散组、熊去氧胆酸组的肠道内容物样本进行靶标胆汁酸代谢组学研究。称取25 mg样品，混合1000 μL提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1）涡旋30 s，钢珠研磨35 Hz/4 min，超声处理5 min并重复3次（冰水浴），-40 ℃静置1 h，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液至液相色谱进样瓶用于分析。标准溶液配制：精确称量标准品，配制1 mg/mL储备液，稀释成混合标准溶液，逐级稀释得校准溶液（含同位素标记内标）。

通过Vanquish超高效液相色谱仪配合Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（150×2.1 mm，1.7 μm）进行目标化合物分离。流动相A：5 mmol/L乙酸铵水溶液，B：乙腈。设置柱温45 ℃-样品盘4 ℃-进样量1 μL。质谱分析则使用OrbitraP ExPloris 120高分辨质谱仪，平行反应监测（PRM）模式。离子源参数如下：SPray voltage=+3500/-3200 V，Sheath gas（N2）flow rate=40，Aux gas（N2）flow rate=15，SweeP gas（N2）flow rate=0，Aux gas（N2）temPerature=350 ℃，CaPillary temPerature=320 ℃。

数据收集后上传美吉云平台（cloud.majorbio.com）分析。数据矩阵按80%规则去除缺失值（保留非零值≥80%的变量），用最小值填补空缺值，再用总和归一化法处理质谱峰响应强度，删除RSD>30%的变量，进行log10对数化处理，得到用于后续分析的数据矩阵。用R语言roPls包（Version 1.6.2）进行OPLS-DA分析，通过7折交叉验证评估模型稳定性。KEGG数据库注释差异代谢物的相关代谢通路，通路富集采用Python的sciPy.stats包进行分析，最后采用Fisher精确检验确定与实验处理最相关的生物学途径。

1.6 统计学分析

使用GraPhPad Prism和SPSS 25.00软件分析数据。计量资料符合正态分布以均数±标准差表示，两组比较用独立样本t检验，多组比较用单因素方差分析。组间比较时，方差齐用LSD法，方差不齐用Games-Howell法。若计量资料为非正态分布则以中位数（四分位数间距）表示，组间差异采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义，所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 一般情况比较

在1~8周胆囊胆固醇结石造模期间，与空白组比较，CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散加减组和熊去氧胆酸组小鼠在此期间饮食量较大，体质量增长较快；在8周最后1 d，CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散加减组和熊去氧胆酸组小鼠经高脂致石饲料喂养后体质量增长率均大于空白组（P<0.05）；上述4组间差异无统计学意义（P>0.05）。

9~12周肝郁证造模期间，与空白组比较，CS肝郁组的小鼠逐渐表现为淡漠懒动、反应迟钝、活动缓慢，被抓取时放弃挣扎抵抗等抑郁样行为。造模结束后测量体质量，与空白组比较，CS组体质量增长率升高；与CS肝郁组和熊去氧胆酸组比较，柴胡疏肝散加减组体质量增长率升高（P<0.05，图1、表2）。

2.2 行为学实验结果

2.2.1 旷场实验结果

在肝郁证造模前，各组小鼠旷场实验的移动总距离和中心停留时间差异无统计学意义（P>0.05）。造模完成后，与空白组比较，CS组的移动总距离和中心停留时间降低（P<0.01）；与CS组比较，CS肝郁组的移动总距离和中心停留时间进一步减少（P<0.05）；与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散加减组的移动总距离和中心停留时间均增加（P<0.05）；与熊去氧胆酸组比较，柴胡疏肝散加减组的移动总距离增加（P<0.05，表3）。

2.2.2 强迫游泳实验结果

肝郁证造模前，不同组别小鼠强迫游泳实验不动时间差异无统计学意义（P>0.05）。肝郁证造模结束后，与CS组比较，CS肝郁组不动时间增加（P<0.05）；与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散加减组不动时间减少（P<0.05，表4）。

2.2.3 糖水偏好实验结果

肝郁证造模前，不同组别小鼠糖水偏好率差异无统计学意义（P>0.05）。肝郁证造模结束后，与CS组比较，CS肝郁组糖水消耗率减少（P<0.01）；与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散加减组糖水消耗率增加（P<0.01）；与熊去氧胆酸组比较，柴胡疏肝散加减组糖水消耗率增加（P<0.05，表5）。

2.2.4 悬尾实验结果

肝郁证造模前，不同组别小鼠悬尾实验不动时间差异无统计学意义（P>0.05）。肝郁证造模结束后，与CS组比较，CS肝郁组悬尾不动时间增加（P<0.05）；与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散加减组与熊去氧胆酸组悬尾不动时间减少（P<0.05，表6）。

2.3 结石情况

肝郁证造模结束后观察各组小鼠结石情况，空白组胆囊形态正常，胆汁清透呈黄绿色；CS组胆囊见颗粒样圆形晶体及泥沙样物质沉淀，胆汁浑浊；CS肝郁组胆囊体积明显胀大，结石样晶体更为明显呈真胆结石；柴胡疏肝散加减组与熊去氧胆酸组胆囊体积缩小，结石晶体有不同程度的减少，其中柴胡疏肝散加减组较熊去氧胆酸组胆囊回缩更为明显且胆汁清透（图2）。

2.4 肠组织HE染色结果

空白组小鼠的肠绒毛和隐窝结构完整且排列整齐，肠绒毛光滑，无脱落现象，固有层未见充血或水肿；CS组小鼠的肠道绒毛松散短小且排列杂乱，肠道形态遭到破坏；CS肝郁组小鼠的肠组织黏膜及肠隐窝出现损伤，肠道通透性升高；柴胡疏肝散加减组和熊去氧胆酸组小鼠的肠绒毛密度增加，肠隐窝状况得到一定程度的恢复，其中柴胡疏肝散加减组小鼠的肠组织病理形态改善更为显著（图3）。

2.5 胆汁中TC和TBA水平

与空白组比较，CS组小鼠的胆汁TC含量增高（P<0.01）、胆汁TBA含量降低（P<0.01）；与CS组比较，CS肝郁组胆汁TC含量增高（P<0.01）、胆汁TBA含量降低（P<0.01）；与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散加减组和熊去氧胆酸组小鼠胆汁TC降低（P<0.01）、TBA增高（P<0.01，表7）。

2.6 TGR5、GLP1/2的mRNA水平

与空白组比较，CS组小鼠回肠组织中GLP1/2 mRNA表达升高（P<0.01）。与CS组比较，CS肝郁组小鼠回肠组织中GLP1/2、TGR5表达增高（P<0.01）。与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散加减组和熊去氧胆酸组回肠组织GLP1/2、TGR5 mRNA表达降低（P<0.01，表8）。

2.7 肠道菌群16SrDNA测序结果分析

2.7.1 AlPha多样性分析

分别选取样品群落中物种的丰富度（ace）和多样性（Shannon）指数进行多样性分析。与空白组比较，CS组、CS肝郁组ace指数、Shannon指数均降低（P<0.01）；与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散加减组ace指数、Shannon指数升高（P<0.05）；与熊去氧胆酸组比较，柴胡疏肝散加减组ace指数、Shannon指数均升高（P<0.05，图4，表9）。

2.7.2 Beta多样性分析

基于ASV集与各组间属水平相对丰度作PCoA分析，结果显示，CS组和CS肝郁组的点与空白组明显分离，证实高脂饲料和应激造模不仅诱发疾病，也导致肠道菌群的紊乱。柴胡疏肝散组和熊去氧胆酸组的点与CS肝郁组分离，并向空白组方向靠拢，证明柴胡疏肝散能够逆转模型引起的肠道菌群失调，使其恢复至接近正常的状态。柴胡疏肝散组与熊去氧胆酸组并不完全重合，提示柴胡疏肝散调节菌群的方式可能与熊去氧胆酸有所不同（图5）。

2.7.3 群落组成分析

从门水平上分析各组ToP10肠道菌群群落组成，疣微菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门在各组中为优势菌门，相对丰度较高。其中，疣微菌门、厚壁菌门经CS组、CS肝郁组造模处理后，相对丰度都上调，经柴胡疏肝散加减组、熊去氧胆酸组干预后疣微菌门的相对丰度都不同程度下调。拟杆菌门在空白组中为优势菌占比62.45%，经CS组、CS肝郁组造模处理后，相对丰度都下调；柴胡疏肝散加减组、熊去氧胆酸组干预后相对丰度都上调。变形菌门相较上述3大菌门在各组中群落占比较低，在空白组、CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散加减组与熊去氧胆酸组中相对丰度分别为3.35%、4.64%、5.37%、14.22%、5.64%（图6、表10）。

从属水平上重点研究各组小鼠肠道菌群Top30的菌属。就优势菌属而言，其中阿克曼氏菌属在CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散加减组与熊去氧胆酸组中为优势菌属，由于其属疣微菌门，其相对丰度与门水平相同，相较空白组相对丰度值变化趋势也同门水平。Muribaculaceae属在空白组中为优势菌，经CS组、CS肝郁组造模处理后相对丰度分别下调；柴胡疏肝散加减组、熊去氧胆酸组干预后相对丰度分别上调。LachnosPiraceae属是在各组中均为占比前5的菌属，相对丰度相较与空白组，CS组、CS肝郁组呈上调趋势，柴胡疏肝散加减组、熊去氧胆酸组干预后下调。此外，乳酸杆菌属在空白组与CS组中为优势菌，在CS肝郁组中相对丰度下调；考拉杆菌属在柴胡疏肝散加减组中为优势菌属；扭瘤胃球菌群在CS组、CS肝郁组中属优势菌属，与空白组相比呈上调趋势（图7、表11）。

2.7.4 LEfSe多层级物种判别分析

空白组显著差异物种有拟杆菌门、乳杆菌科、乳杆菌科；CS组显著差异物种有丹毒丝菌科、土里肠杆菌属扭瘤胃球菌群；CS肝郁组疣微菌门、阿克曼氏菌属；柴胡疏肝散加减组为考拉杆菌属；熊去氧胆酸组显著差异物种为变形杆菌属（图8）。

2.8 肠内容物胆汁酸代谢物定量结果

采用UHPLC-PRM-MS/MS的方法，针对30例小鼠肠内容物样品中的70种胆汁酸类目标化合物进行检测分析，共计检出65种胆汁酸类化合物。

2.8.1 胆汁酸代谢PLS-DA分析

PLS-DA结果显示，各组样品呈分离分布，说明分类效果显著。PLS-DA模型置换检验（200次）结果显示，Q²回归线与Y纵轴的截距为-0.2065<0，表明模型稳健可靠，未发生过拟合。模型拟合良好，可预测性强，适合后续数据分析（图9）。

2.8.2 KEGG富集分析

CS组与空白组的差异代谢物中显著富集的KEGG通路有4条，分别为胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成、胆固醇代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢；CS肝郁组与CS组、柴胡疏肝散加减组与CS肝郁组、熊去氧胆酸组与CS肝郁组、柴胡疏肝散加减组与熊去氧胆酸组均有3条KEGG通路，分别为胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成、胆固醇代谢。KEGG富集分析网络图显示胆汁分泌通路有次级胆汁酸：DCA、石胆酸；胆汁分泌与初级胆汁酸生物合成通路：CA、鹅脱氧胆酸；胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成与胆固醇代谢通路有：TCDCA与结合型胆汁酸甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸；结合型胆汁牛磺胆酸则在4条通路上均存在差异分布（图10）。

2.8.3 差异胆汁酸与肠道菌群的相关性分析

DCA与扭瘤胃球菌、Lachnospiraceae丰度呈正相关（P<0.05），与毛螺菌科NK4A136菌群呈负相关（P<0.05）；DCA的甘氨酸及牛磺酸结合物如GDCA、GCA、TDCA与土里肠杆菌属及扭瘤胃球菌群丰度呈正相关（P<0.01），与Muribaculaceae、梭菌属、臭杆菌属呈负相关（P<0.01）。游离型及结合型次级胆汁酸可能受相关肠道菌群调节并影响CS发生（图11、表12） 。

3 讨论

情志不畅、肝失疏泄是胆囊结石的核心病机，会导致胆汁排泄不畅、湿热痰瘀互结成石^［19］ 。本研究中，结石肝郁组小鼠经 “CUMS + 孤养” 处理后，出现显著抑郁样行为：旷场实验移动距离缩短、糖水消耗率下降，强迫游泳和悬尾不动时间延长，同时伴随体质量增长迟缓，与临床肝郁证患者 “情绪低落、神疲懒动” 的表现高度吻合。而柴胡疏肝散加减干预后，上述行为学指标均得到改善，且效果优于熊去氧胆酸组，提示其能通过疏肝理气调节情志活动。同时研究还观察到柴胡疏肝散加减干预后胆囊体积回缩、胆汁清透度改善，TC水平下降，TBA水平回升。而结石肝郁组中TC升高，当TC过度升高或TBA相对不足时，胆固醇呈过饱和状态，易析出结晶，成为胆结石形成的物质基础。这些变化直观体现了柴胡疏肝散加减“疏肝利胆”、促进胆汁正常排泄以缓解结石形成的功效，为临床应用柴胡疏肝散加减方提供了坚实的实验依据。

肠道菌群作为大量微生物在肠道所构建的微生态系统，能够在肝郁证候生物学基础所囊括的内分泌、代谢等多人体系统中发挥调控作用^［20］。肠道菌群通过调节神经内分泌和代谢、促进营养吸收、维持肠道免疫平衡，与肝脏调畅情志、脾胃运化水谷以及升清防卫的生理功能相互呼应^［21］。现代医学指出肠道菌群-胆汁酸轴的每个环节^［22］，一旦发生紊乱，都可能导致与该轴相关的疾病发生，这与中医所说的“正邪相互拮抗与制约”原理相契合。作为肠道中目前已知的最丰富的两种菌门，厚壁菌门和拟杆菌门在维持人体代谢平衡方面发挥着关键作用^［23］。与以往研究一致^{［24，25］}，本研究发现高脂致石饲料可导致小鼠拟杆菌门丰度降低、厚壁菌门丰度升高，F/B比值上升，提示菌群紊乱与胆固醇代谢异常密切相关。不同于以往单纯高脂造模研究，本研究进一步结合CUMS+孤养构建肝郁证模型，发现结石肝郁组在菌群失调基础上，疣微菌门及阿克曼氏菌异常富集，拟杆菌门和Muribaculaceae减少，表明“肝郁”状态确实存在特异性菌群特征，这与杨炀等^［26］关于肝郁证菌群结构变化的报道部分吻合，本研究进一步在胆囊结石肝郁证模型中系统揭示了阿克曼氏菌属与次级胆汁酸代谢的正相关关系。

胆汁酸代谢失衡是胆固醇结石形成的核心环节。肠道菌群深度参与胆固醇-胆汁酸的肠肝循环代谢，是影响胆汁酸池组成和胆固醇稳态的核心因素^［27］。肠道微生物群失调可以通过调节胆汁酸代谢和胆汁分泌来促进胆固醇结石的形成^［28］。初级胆汁酸在肠道内经菌群酶（如胆汁酸盐水解酶BSH和7α-脱羟基酶）作用转化为次级胆汁酸（如DCA， 石胆酸），其中大部分被重吸收回肝脏^［29］。肠道菌群失调可破坏此平衡：一方面增加次级胆汁酸生成，另一方面损害胆汁酸结合与重吸收。研究结果显示，在结石肝郁组中肠道菌群α多样性（ACE， Shannon指数）显著降低；特征性菌群失调包括疣微菌门及阿克曼氏菌属异常富集，拟杆菌门和Muribaculaceae减少。这种失调直接扰乱了胆汁酸代谢： 阿克曼氏菌属富集可增强BSH活性，提高游离胆汁酸比例；而Muribaculaceae减少削弱了胆汁酸结合能力。LEfSe分析进一步证实，结石肝郁组的标志菌属（如阿克曼氏菌属）与次级胆汁酸（DCA， TDCA）水平呈正相关，与研究^［10］提出的肠道菌群通过BSH和7α-脱羟基酶调控胆汁酸代谢的观点一致。本研究在胆囊胆固醇结石肝郁证中进一步发现柴胡疏肝散加减能有效下调这些与次级胆汁酸生成正相关的菌属（如阿克曼氏菌属），从而间接调控胆汁酸代谢谱，减少促结石形成的次级胆汁酸，这为“疏肝利胆”治法提供了新的微生物-代谢轴证据。

柴胡疏肝散对肠道菌群的调节作用是其多靶点治疗效应的核心组成部分。药理研究中，柴胡疏肝散有1，072种次生代谢产物，主要包括苯丙素类、萜类、黄酮类和生物碱类，其中黄酮类与胆汁酸代谢密切相关^［30］。临床研究中，在治疗后胆固醇结石复发方面，柴胡疏肝散显著降低了结石复发率，不良反应最小^［30］，已被用于治疗多种代谢性胃肠病学和肝胆疾病^［31］。在应用上，有研究认为稳定期以肝郁证为要，治当疏肝理气、疏肝利胆，用柴胡疏肝散加减^［32］。韩丽霞承师韩臣子“调中焦，清源流，治结石”的思想，提出调中消石、木郁达之的胆石症治则，以柴胡疏肝散化裁，自拟调中达郁汤辨证加减治疗胆石症，疗效良好。本研究中柴胡疏肝散加减能逆转CS肝郁组小鼠的菌群紊乱：主要包括下调与肥胖、高胆固醇、炎症及抑郁呈正相关的Lachnoclostridium属丰度^［33］；同时上调有益菌属如Muribaculaceae、考拉杆菌属、产粪甾醇真杆菌群和Turicibacter^［34］。Lachnoclostridium具有将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸的能力，其过度增殖不仅与代谢紊乱相关，也与抑郁症状加重高度关联。综上所述，柴胡疏肝散通过重塑菌群结构，特别是抑制有害菌（如Lachnoclostridium）和促进有益菌生长，为改善肝郁症状和胆汁酸代谢异常提供了微生物学基础^［35］。

在分子机制方面，本研究显示CS肝郁组回肠组织中TGR5和GLP-1/2的mRNA表达升高。TGR5是G蛋白偶联受体家族中的胆汁酸膜受体，在肝脏、胆囊、肠道及骨骼肌中广泛表达，在协调胆囊运动、调节免疫炎症、维持能量代谢方面发挥重要作用。TGR5可以在回肠黏膜上皮细胞表达，当胆汁酸激活TGR5时，可促进肠L细胞分泌GLP-1/2。GLP-1抑制患者餐后胆囊收缩素（CCK）分泌，进而导致胆囊运动和排空受到抑制。GLP-2也能抑制进食后诱发的胆囊排空。胆囊收缩减弱导致胆汁在胆囊中淤积时间延长，这大大增加了胆固醇结晶析出、聚集并最终形成结石的风险。这是TGR5/GLP-1影响胆结石的最主要机制。在相关研究中，乳酸杆菌可以通过完全激活肝脏和回肠TGR5信号通路来阻止胆固醇结石的形成^{［36，37］}。本研究中柴胡疏肝散能下调TGR5和GLP-1/2表达，恢复胆汁酸受体信号通路的稳态，从而改善胆汁排泄和糖脂代谢。

本研究从“肝郁证-肠道菌群-胆汁酸代谢”的角度，深入探讨了柴胡疏肝散加减治疗胆囊胆固醇结石肝郁证的作用机制。结果表明，该方剂通过调节肠道菌群结构，如抑制促炎菌Lachnoclostridium、阿克曼氏菌属，促进Muribaculaceae等有益菌，有效改善菌群紊乱，进而纠正胆汁酸代谢失衡（减少次级胆汁酸DCA/TDCA生成，恢复TGR5/GLP-1信号），最终达到缓解肝郁症状、减轻肠道病理损伤、抑制胆结石形成的目的。不仅为“疏肝利胆”治法提供现代科学依据，也有益于开发基于“菌群-胆汁酸轴”的中药干预策略。但本研究仍存在一定局限，如尚未开展菌群移植或基因敲除等验证实验，今后可进一步结合粪菌移植、代谢组学与转录组学联用等技术，深入揭示柴胡疏肝散的作用靶点与信号网络。

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