益气解毒方通过抑制NF-κB通路的过度激活改善小鼠肝癌免疫微环境

Yiqi Jiedu Formula regulates immune microenvironment of liver cancer in mice by inhibiting overactivation of NF-κB signaling pathway

摘要

目的 探究益气解毒方对Hep3B肝癌小鼠模型中免疫微环境的调控机制。 方法 选取40只SPF级雄性小鼠，小鼠腋下注射Hep3B肿瘤细胞，建立异位小鼠模型，将小鼠随机分为模型组（生理盐水0.2 g/kg），华蟾素片组（0.22 g/kg），益气解毒方低（0.5 g/kg）、中（1 g/kg）、高（2 g/kg）剂量组，8只/组。连续灌胃给药28 d，每7 d记录各组小鼠瘤重、体积。给药结束后计算抑瘤率，通过HE染色观察小鼠肿瘤组织病理变化，流式细胞术检测肿瘤组织中M1/M2型巨噬细胞极化比例，免疫荧光术检测CD86、CD206蛋白表达，Western blotting检测小鼠瘤体组织中iNOS、Arg-1、p65、p50蛋白表达，q-PCR检测iNOS、Arg-1、p65、p50 mRNA表达，ELISA法检测血清IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ、TNF-α、TGF-β1水平。 结果 与模型组比较，益气解毒方各组小鼠肿瘤质量、体积减小；肿瘤细胞数量减少，细胞核缩小，坏死区域增大；M1型巨噬细胞比例升高，M2型巨噬细胞比例降低；肿瘤组织中CD86表达上升，CD206表达下降；iNOS、Arg-1、p65、p50蛋白及mRNA表达降低；血清IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β1水平降低，IL-6、INF-γ水平升高（P<0.05）。 结论 益气解毒方能有效抑制Hep3B肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长，逆转肿瘤相关巨噬细胞的极化状态，将M1/M2比例从M2主导调整至M1主导，从而改善肿瘤免疫抑制微环境，增强抗肿瘤效应，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的过度激活有关。

Abstract

Objective To investigate the regulatory mechanism of Yiqi Jiedu Formula on immune microenvironment of hepatocellular carcinoma (HCC) in mice. Methods Forty male BALB/c mice bearing subcutaneous Hep3B cell xenografts were randomized equally into model group (with normal saline treatment), Huachansu Tablet group, and low- (0.5 g/kg), medium- (1 g/kg), and high-dose (2 g/kg) Yiqi Jiedu Formula groups. All the mice received daily gavage of the corresponding treatments for 28 consecutive days, and the changes in tumor weight and volume were recorded every 7 days, and tumor inhibition rate was calculated after the final administration. Histopathological changes in the tumor tissues were observed with HE staining, and polarization of M1/M2 macrophages was analyzed with flow cytometry. The mRNA and protein expressions of iNOS, Arg-1, p65, and p50 in the tumor tissues were detected using q-PCR and Western blotting, and CD86 and CD206 protein expressions were observed with immunofluorescence staining. Serum levels of IL-4, IL-6, IL-10, IFN‑γ, TNF‑α, and TGF‑β1 of the mice were measured using ELISA. Results The mice in the 3 Yiqi Jiedu Formula groups showed significant reductions in tumor weight and volume with decreased tumor cell count, increased tumor cell apoptosis, increased percentage of M1 macrophages, and decreased percentage of M2 macrophages. The treatment obviously upregulated CD86 and downregulated CD206 expression in the tumor tissue, lowered the protein and mRNA expressions of iNOS, Arg-1, p65, and p50, reduced serum levels of IL-4, IL-10, TNF‑α, and TGF-β1, and increased serum levels of IL-6 and IFN-γ in the tumor-bearing mice. Conclusion Yiqi Jiedu Formula effectively inhibits Hep3B cell xenograft growth in mice and induces a shift of M1/M2 ratio by promoting M1 polarization, thereby ameliorating the immunosuppressive tumor microenvironment and enhancing anti-tumor immunity possibly in association with inhibition of NF-κB signaling pathway overactivation.

Graphical abstract

关键词

原发性肝癌 / 益气解毒方 / 巨噬细胞 / 免疫微环境 / 信号通路

Key words

primary liver cancer / Yiqi Jiedu Formula / macrophages / immune microenvironment / signaling pathway

原发性肝癌（PLC）最常见病理类型为肝细胞癌（HCC），其发生与慢性肝病背景下的病毒性肝炎、酒精或非酒精性脂肪性肝炎密切相关，慢性乙型病毒性肝炎是PLC最主要的病因^［1］。2020年中国PLC发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居第2位，死亡39.1万例^［2］。中医学将肝癌归于“肝积”“胁痛”“积聚”等范畴，认为正气不足为发病之本，癌毒侵袭为标，情志、饮食及慢性肝病迁延可促进炎癌转化，日久成疾^［3］。现代研究揭示，HCC作为经典的炎症相关肿瘤，其各阶段都受到慢性炎症的影响；肿瘤相关慢性炎症的核心特征为：异常分泌细胞因子（如生长因子、细胞因子和趋化因子）以及炎症细胞向肿瘤部位的募集，而炎症的持续存在形成一种适合肿瘤存活的肿瘤微环境（TME），有利于HCC的发生^［4］。

在HCC的TME中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）扮演核心角色，巨噬细胞可分为两种不同的极化状态：经典活化的M1巨噬细胞和交替活化的M2巨噬细胞，其中M2巨噬细胞占主导地位^［5-7］。M2巨噬细胞能通过调控血管生成、介导免疫抑制及促进化疗耐药等多种机制，显著支持肿瘤生长和免疫逃逸，而M1巨噬细胞表现相反^{［8， 9］}。除常规手术外，现有系统疗法如靶向药物（索拉非尼、仑伐替尼）及免疫检查点抑制剂（PD-1/PD-L1单抗）的客观缓解率不足30%，且普遍面临获得性耐药挑战^［10］。这些治疗困境进一步强调深入解析TME调控机制，特别是靶向关键免疫细胞如TAMs的必要性。

益气解毒方是本课题组针对肝癌“正虚毒结”病机特点研发的复方制剂，以“扶正祛邪”为原则，前期课题组研究证实其可通过多靶点、多通路抑制HepG2肝癌细胞活力，并初步显示其具有调节机体免疫功能、影响肿瘤免疫微环境的潜力^［11-13］。这些研究提示益气解毒方可能通过干预免疫微环境，特别是影响TAMs的功能状态，来发挥其抗肝癌作用。

尽管TAMs在HCC炎癌转化及进展中的关键作用已被广泛认识^［14］，且NF-κB信号通路作为调控炎症反应和免疫应答的核心通路，在TAMs的极化与功能中扮演着枢纽角色^［15-18］。但对于中药复方如何通过调控NF-κB等关键炎症信号通路特异性调节TAMs极化，进而影响HCC炎癌转化以重塑免疫抑制性TME的机制研究尚不足。因此，本研究聚焦于肿瘤相关巨噬细胞及NF-κB信号通路，深入探索益气解毒方对炎癌转化的干预作用，阐明益气解毒方调控TAMs极化的作用机制，揭示其是否通过干预NF-κB信号通路来影响TME的炎症状态和免疫平衡，为改善HCC免疫失衡状态、延缓疾病进展提供新的理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

BALB/c裸鼠40只，SPF级，6~7周龄，雄性，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司［实验动物生产许可证号SCXK（豫）2020-0005］，饲养环境温度23±2 ℃，相对湿度（60±10）%，自由进食饮水，饮用水为灭菌二级超纯水，饮用水质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》 （GB5749-2006）的规定，适应性饲养1周。该实验方案经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准（伦理批号：2021026）。

1.2 细胞株与实验药物

Hep3B细胞株（CL-0102）。益气解毒方：生黄芪30 g，炒白术20 g，白花蛇舌草12 g，半枝莲12 g，川芎10 g，半边莲15 g，枸杞子15 g。药品由安徽中医药大学第一附属医院药房提供，并经医院中药房专家鉴定。中药液采用水煎法，由安徽中医药大学第一附属医院中药房煎煮制备，生药浓度为2 g/mL，4 ℃保存。华蟾素（Z20050846），由安徽中医药大学第一附属医院西药房提供。

1.3 主要实验试剂及仪器

戊巴比妥钠（MERCK，P3761）；F4/80，CD80，CD206（ELabscience，E-AB-F0995C、E-AB-F0992E、E-AB-F1135D）；CD86，CD206（武汉三鹰，13395-1-AP、18704-1-AP）；一抗iNOS，Arg-1，P65（Affinity，AF0199、DF6657、AF5006），p50（万类生物，WL01917），β-actin（武汉三鹰，20536-1-AP）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥，ZB-2301）；小鼠IL-4、IL-10、TGF-β1酶联免疫吸附检测试剂盒（武汉科鹿生物，ELK1153、ELK1143、ELK1186），Mouse Interferon γ，IFN-γ ELISA Kit（华美生物，CSB-E04578m），小鼠白介素6（IL-6）ELISA试剂盒、Mouse TNF-α ELISA kit（酶联生物，ml098430、mIC50536-1）；SYBR Green qPCR Mix（BiosharP，BL697A）。

显微镜（CIC，XSP-C204）；酶标仪（无锡华卫德朗，DR-200Bc）；常温/冷冻离心机（SCILOGEX，CF1524R）；台式高速冷冻离心机、台式低速离心机（上海卢湘仪，H1650R，TDZ6B-WS）；电泳系统、凝胶成像仪（Mini-Proten Tetra System、ChemiDoc XRS+System，Bio-RAD）；超微量分光光度计（IMPLEN，T51491）；Real-time PCR仪（罗氏，LightCycler 480）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模、分组及给药

37 ℃、5% CO₂条件下常规培养细胞Hep3B，2~3 d传代1次，胰酶消化后离心（1800 r/min，离心5 min）收集癌细胞；取对数生长期的肝癌细胞，调整细胞悬液密度为1×10⁷/mL，取40只进行癌细胞接种，以0.1 mL/只接种于裸鼠，建立小鼠皮下癌移植瘤模型。10 d后，用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径。将40只肝癌小鼠随机分为5组：模型组，华蟾素片组，益气解毒方（低、中、高）剂量组，8只/组。根据《中药药理研究方法学》“人和动物体表面积折算等效剂量比率”换算益气解毒方低、中、高剂量组生药浓度分别为：2、1、0.5 g/kg，华蟾素片组浓度为0.22 g/kg，模型组予以生理盐水0.2 g/kg灌胃。连续给药28 d，摘眼球取血，并5 min、3000 r/min离心取上清，置于-80 ℃保存。

1.4.2 肿瘤质量、体积及抑瘤率测定

用游标卡尺测量裸鼠移植瘤长径和横径，计算肿瘤体积（V），V=1/2×长径×短径²。计算其体积，绘制肿瘤生长曲线，游标卡尺测量肿瘤，末次给药后24 h，肿瘤标本取样并称质量。肿瘤生长抑制率=（模型组平均瘤重－给药组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%。

1.4.3 HE染色观察小鼠肿瘤组织变化

采用在4%多聚甲醛将瘤体组织充分固定，HE染色法观察各组小鼠瘤体组织形态学变化。将固定好的瘤体组织梯度脱水透明后石蜡包埋，切5 μm厚片，60 ℃ 温箱中烤片后，二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水，置苏木素染缸中染色，盐酸乙醇分化后自来水冲洗返蓝，将切片置伊红染缸中染色2 min，脱水透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察并采集图像。

1.4.4 流式检测TAMs分型（M1/M2）

将收集的小鼠血液，1200 r/min离心5 min，去除血清。在血浆中加入4 mL红细胞裂解液，混匀放置5 min。隔2 min混匀一次。1200 r/min离心5 min，去液体。在底部沉淀中再加4 mL红细胞裂解液，混匀放置5 min。隔2 min混匀一次。1200 r/min离心5 min，去液体。加入1 mL PBS，混匀，1200 r/min离心5 min，去液体。加入500 μL流式缓冲液，重悬细胞。在每组样本中加入5 μL流式抗体，避光4 ℃孵育2 h，流式细胞仪上机检测。

1.4.5 免疫荧光术检测

石蜡切片脱蜡至水，组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（pH6.0）抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加 BSA 孵育30 min，轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS配好一抗，2种一抗按一定稀释比例混合［CD86（1∶200）、CD206（1∶200）］，滴加到组织上，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，5 min/次，加入二抗［超敏兔鼠通用二抗（1∶400）］，室温避光孵育1 h，DAPI复染细胞核，切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂 5 min，流水冲洗10 min，用抗荧光淬灭，封片剂封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.4.6 Western blotting检测

将小鼠瘤体组织液氮研磨后加入含PMSF的单去污剂裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心取上清分装保存；用BCA法测定蛋白浓度，以标准牛血清蛋白制作梯度并稀释样品，加入BCA工作液（A∶B=50∶1）37 ℃显色30 min后测定562 nm吸光度计算浓度；配置10%分离胶和5%浓缩胶，聚合后处理样品（5×上样缓冲液煮沸5 min冰浴冷却），按30 μg/孔上样，25 mA恒流电泳至溴酚蓝迁移浓缩胶后转30 mA分离胶电泳；将PVDF膜甲醇活化后与凝胶组成转膜夹层（膜在阳极侧），200 mA稳流转膜（1 min/kDa）；5%脱脂奶粉/TBST室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜［抗体稀释比例分别为iNOS（1∶1000）、Arg-1（1∶1000）、p65（1∶1000）、p50（1∶1000）、β-actin（1∶2000）］，TBST洗膜3次后室温孵育二抗2 h［辣根酶标记山羊抗兔IgG（1∶10 000）］，再次TBST洗膜3次，ECL发光液（A+B等体积混合）覆盖膜面后化学发光成像。

1.4.7 q-PCR检测

取小鼠瘤体组织样本，液氮研磨后加入TRI Reagent裂解（贴壁细胞1 mL/10 cm²，悬浮/血液1 mL/5×10⁶细胞，动植物组织1 mL/50 mg），室温静置5 min；加入0.2 mL氯仿/mL裂解液，涡旋后4 ℃ 12 000 g离心15 min，取上层水相加等体积异丙醇沉淀RNA（小RNA需-70 ℃过夜），4 ℃ 12 000 g离心10 min后75%乙醇洗涤，DEPC水溶解；RNA经gDNA清除剂（42 ℃ 2 min）去除基因组DNA，逆转录体系（Oligo（dT）/随机引物、Hifair II酶）25 ℃ 5 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min合成cDNA；采用SYBR Green法进行qPCR，体系含5 μL Mix、0.5 μL F/R引物、1 μL cDNA模板，程序：95 ℃ 3 min预变性，40循环（95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s），检测iNOS、Arg1、P65 mRNA表达并分析Ct值。实验重复3次，以β-actin为内参，采用 2^-ΔΔCt 法计算相对量。引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.4.8 ELISA法检测

将小鼠血清100 μL加入酶标板，37 ℃孵育80 min后弃液，洗板3次（200 μL/孔，1~2 min/次）并拍干；加100 μL生物素抗体工作液（1∶100），37 ℃孵育50 min，弃液洗板3次；加100 μL酶结合物工作液，37 ℃孵育50 min，弃液洗板5次；避光加入90 μL TMB显色液，37 ℃避光显色20 min，按相同顺序加入50 μL终止液终止反应，立即用酶标仪检测吸光度A_{450 nm}。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时采用LSD法进行事后比较，方差不齐时则采用Welch校正方差分析，并以Tamhane's T₂检验进行事后分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 益气解毒方对小鼠肿瘤质量、体积及抑瘤率的影响

与模型组相比，益气解毒方高剂量组肿瘤质量、体积减小（P<0.01），抑瘤率为60.13%；益气解毒方中剂量组肿瘤质量减小（P<0.05）、体积减小（P<0.01），抑瘤率为43.99%；益气解毒方低剂量组肿瘤质量、体积减小（P<0.05，表2，图1）。

2.2 益气解毒方对Hep3B肝癌小鼠肿瘤组织病理的影响

模型组Hep3B肝癌小鼠肿瘤组织模型组Hep3B肿瘤组织细胞核完整密集、排列整齐，显示高增殖活性。与模型组相比，益气解毒方各剂量组肿瘤组织细胞核体积缩小、数量减少，嗜酸性区域扩大，以及肿瘤细胞破坏、胞质外溢和核碎裂，肿瘤细胞增殖受到抑制，且益气解毒方高剂量组效果更为明显（图2）。

2.3 益气解毒方对Hep3B肝癌小鼠M1/M2巨噬细胞极化的影响

与模型组相比，益气解毒方各组增加M1型巨噬细胞（P<0.01）；中、高剂量组减少M2型巨噬细胞（P<0.01，图3）。

2.4 益气解毒方对Hep3B肝癌小鼠M1/M2巨噬细胞标记物CD86，CD206的影响

免疫荧光技术观察显示，M1型标志物CD86呈绿色荧光，M2型标志物CD206呈红色荧光，细胞核经DAPI染为蓝色（图4）。与模型组相比，益气解毒方低、中、高剂量组肿瘤组织M1型巨噬细胞标志物CD86增多（P<0.01），M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达减少（P<0.01，图5）。

2.5 Western blotting检测益气解毒方对Hep3B肝癌小鼠巨噬细胞极化相关蛋白的影响

与模型组相比，益气解毒方各剂量组对iNOS、Arg-1、p65、p50的蛋白表达皆呈抑制作用（P<0.01，图6）。

2.6 q-PCR检测益气解毒方对Hep3B肝癌小鼠巨噬细胞极化相关mRNA的影响

与模型组相比，益气解毒方高剂量组对iNOS、Arg-1、p65、p50 mRNA表达呈抑制作用（P<0.01）。益气解毒方中剂量组对Arg-1、p65、p50 mRNA表达呈抑制作用（P<0.01）。益气解毒方低剂量组对Arg-1、p50 mRNA表达呈抑制作用（P<0.01），对p65 mRNA表达呈抑制作用（P<0.05，图7）。

2.7 益气解毒方对Hep3B肝癌小鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ、TNF-α、TGF-β1水平的影响

与模型组相比，益气解毒方高剂量组能够降低IL-4、IL-10水平，升高IL-6、TNF-α（P<0.01）；降低TGF-β1水平，升高INF-γ水平（P<0.05）。益气解毒方中剂量组能降低IL-10水平，升高IL-6、TNF-α水平（P<0.01）。益气解毒方低剂量组能降低IL-10水平（P<0.01，图8）。

3 讨论

益气解毒方源于张国梁教授长期临床实践，以“扶正解毒”为法，其组方思路深受中医经典理论启发。现代研究表明，益气解毒方中多味药材有抗肿瘤、抗病毒等作用^［11-13］。方中重用黄芪，为君药，可大补脾胃之气，以资气血生化之源，兼有托毒外出、固护卫表之功，使正气充盛而邪不可干，为全方“扶正”之核心。臣药为白术，白花蛇舌草，半枝莲。白术燥湿健脾益气，与黄芪相配，共奏益气之效，白花蛇舌草、半枝莲、半边莲三药均为清热解毒之良药，三者合用，清热解毒之力倍增，针对“毒”之病机。此为“解毒”之主攻。川芎，枸杞子两药协同为佐药，川芎为血中气药，擅长活血行气，使补而不滞，气血流通；同时“气为血之帅”，气足则可行血，有“化瘀以解毒”之妙。枸杞子滋补肝肾，益精养血。寓“扶正”于“攻邪”之中，照顾到正气之根本。

本研究通过构建Hep3B肝癌小鼠模型，证实益气解毒方能有效减缓肿瘤进展，研究发现益气解毒方能有效重塑TME，其核心作用在于调控TAMs的极化状态和功能。实验表明：模型组M2型巨噬细胞显著高于M1型巨噬细胞，说明其肿瘤微环境以免疫抑制状态主导，促进肿瘤进展。益气解毒方组M1型巨噬细胞比例显著增加，而M2型巨噬细胞比例显著降低，使得M1/M2比值向抗肿瘤方向倾斜。同时，益气解毒方组减少免疫抑制性细胞因子（IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β1）水平，升高促炎的细胞因子（INF-γ、IL-6）水平。证明益气解毒方通过调节TAMs极化来逆转HCC免疫抑制性TME的假说。

M2型巨噬细胞通过分泌IL-10、TGF-β诱导Treg分化，抑制CD8⁺ T细胞功能^［19］，导致免疫抑制增强，从而抑制宿主的抗肿瘤免疫反应，而M1型巨噬细胞通过分泌IL-12、TNF-α及iNOS发挥抗肿瘤作用^{［20，21］}。研究发现^［22-25］，TAMs向M2型极化是HCC免疫逃逸的关键机制，诱导其向M1型复极化是极具前景的治疗策略，M1极化可抑制相关促肿瘤信号通路，阻断脂质代谢介导的免疫抑制，增强PD-1/PD-L1抑制剂效果。本研究延续并深化了课题组的既往工作，在益气解毒方可抑制Treg细胞分化的基础上^［11］，进一步系统性地揭示了该方在小鼠模型中调控TAMs极化的新能力，为中药免疫调节提供了新证据。

NF-κB通路是调控炎症反应、细胞存活和免疫细胞功能的中心枢纽。NF-κB通过不同二聚体调控TAMs功能异质性^［26］；在TME中，通常驱动TAMs向M2型极化并维持免疫抑制状态^［15］。研究进一步揭示了益气解毒方调节TAMs极化的潜在分子机制与抑制NF-κB经典信号通路密切相关。本实验结果显示，益气解毒方处理降低了NF-κB关键亚基p65 （RelA）和p50的蛋白及mRNA表达水平，并伴随其下游效应分子iNOS和Arg-1表达的下降，证明益气解毒方同步抑制p65和p50亚基的表达。而p65/p50异源二聚体是经典NF-κB通路的主要活性形式，调控包括促炎反应在内的多种基因表达^［27］；p50同源二聚体缺乏转录激活域，通常与转录抑制复合物结合，以促进抗炎反应和M2型TAMs^［28］。相关研究表明^{［29， 30］}，减少p50可促进M2型TAMs向M1型TAMs转化。因此，推测益气解毒方可能是通过削弱经典NF-κB通路过度活化，调节M1型TAMs的过度炎症反应；减少促M2型TAMs极化的p50同源二聚体形成，抑制M2型TAMs的分化与功能，并促进其向M1型转化。

HE染色组织发现炎症浸润及肿瘤细胞减少。综合以上结果表明，益气解毒方通过抑制NF-κB信号通路关键亚基p65和p50的蛋白这种双重作用协同阻断了NF-κB通路的异常激活，最终实现对TAMs极化状态的有效调控，使肿瘤相关巨噬细胞向M1极化，抑制M2型巨噬细胞，下调iNOS和Arg-1的表达，重塑肿瘤免疫微环境，使其从免疫抑制状态转向免疫支持状态。在抑制肝癌细胞增殖的同时，减轻过度炎症反应和纤维化进程，从而抑制肝脏损伤，延缓肿瘤生长。本研究进一步明确了益气解毒方治疗PLC的作用机制，为其临床应用提供分子生物学依据。

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全国名中医肝胆系疾病学术思想传承及特色方药的临床开发研究(202204295107020040)

国家中医药管理局全国名老中医药专家传承工作室建设项目（国中医药人教函(2022175号)

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