珠子草素通过拮抗肠上皮细胞凋亡与调控肠道Th1/Th2免疫平衡改善克罗恩病样小鼠结肠炎

Niranthin ameliorates Crohn's disease-like colitis in mice via antagonizing intestinal epithelial cell apoptosis and regulating intestinal Th1/Th2 immune homeostasis

摘要

目的 探究珠子草素（Nir）对克罗恩病样结肠炎的作用与机制。 方法 建立2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，2.5%）诱导的结肠炎小鼠模型，通过疾病活动度活动（DAI）评分、体质量改变、结肠长度、病理学检测评估结肠炎症状改变，AB-PAS、免疫荧光和免疫印迹评估肠屏障功能，TUNEL染色和免疫印迹评估细胞凋亡，流式细胞术分析肠系膜淋巴结中T淋巴细胞亚群（Th1/Th2）变化；ELISA检测TNF-α和IL-10表达水平变化。体外实验采用脂多糖诱导小鼠结肠类器官炎症模型，检测类器官出芽数及屏障蛋白表达。通过网络药理学和体内实验探索验证Nir拮抗结肠炎的潜在机制。 结果 体内实验显示，Nir可改善TNBS诱导结肠炎小鼠体质量下降、DAI升高、结直肠缩短等表型，降低组织炎症评分，减少杯状细胞丢失（P<0.05）及肠上皮凋亡细胞数量。体外实验表明，Nir能增加结肠类器官出芽数目（P<0.05）。免疫荧光和免疫印迹证实，Nir可恢复体内外实验结肠组织紧密连接蛋白（ZO-1、claudin-1）水平，下调促凋亡蛋白C-caspase3和BAX表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2（P<0.05）；流式细胞术显示，Nir可降低小鼠肠系膜淋巴结Th1比例，升高Th2比例，改善Th1/Th2失衡，同时下调结肠组织TNF-α、上调IL-10水平（P<0.05）；网络药理学预测Nir作用与PI3K/AKT通路相关；免疫印迹发现，Nir可下调p-PI3K、p-AKT和p-p65表达（P<0.05）。并且PI3K/AKT通路激活剂Recilisib可逆转Nir拮抗肠上皮细胞凋亡和调节Th1/Th2平衡的作用。 结论 Nir通过拮抗肠上皮细胞凋亡与调控Th1/Th2平衡来改善克罗恩病样结肠炎，其作用机制与抑制PI3K/AKT通路活性，进而调控下游凋亡信号和炎症免疫分子表达有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of niranthin (Nir) in mice with Crohn's disease (CD)‑like colitis and its therapeutic mechanism. Methods In a mouse model of CD-like colitis induced using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, the effects of niranthin on colitis symptoms were evaluated by measuring changes in disease activity index (DAI) score, body weight, colon length, and colonic pathologies. Intestinal barrier function and cell apoptosis were evaluated using AB-PAS staining, immunofluorescence staining, Western blotting, and TUNEL staining. The changes in Th1 and Th2 cells in the mesenteric lymph nodes and colonic TNF-α and IL-10 expression levels were determined with flow cytometry and ELISA. In lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse colon organoids, the effects of niranthin on organoid budding number and barrier protein expressions were observed. Network pharmacology and in vivo experiments were employed to explore and verify the therapeutic mechanism of niranthin on colitis. Results In the mouse models of CD-like colitis, niranthin treatment obviously improved weight loss, DAI scores, and colorectal shortening and significantly reduced tissue inflammation scores, goblet cell loss, and intestinal epithelial cell apoptosis. Niranthin significantly increased the budding number in LPS-induced mouse colon organoids. In both mouse colon tissues and LPS-induced mouse colon organoids, niranthin obviously increased the expressions of ZO-1 and claudin-1, downregulated the expressions of cleaved caspase-3 and BAX, and upregulated Bcl‑2 expression. The niranthin-treated mouse models showed significantly ameliorated Th1/Th2 imbalance in the mesenteric lymph nodes, downregulated TNF‑α and upregulated IL‑10 levels in the colon tissues. Network pharmacology predicted that the therapeutic mechanism of niranthin for CD-like colitis involved the PI3K/AKT pathway, which was validated in the mouse models treated with niranthin and the PI3K/AKT pathway activator Recilisib. Conclusion Niranthin ameliorates colitis in mice by antagonizing epithelial apoptosis and regulating Th1/Th2 balance via inhibiting the PI3K/AKT pathway.

Graphical abstract

关键词

克罗恩病 / 珠子草素 / 肠屏障 / 凋亡 / Th1/Th2 / PI3K/AKT

Key words

Crohn's disease / niranthin / intestinal barrier / apoptosis / Th1/Th2 / PI3K/AKT

克罗恩病（CD）是可发病于全消化道的慢性肠道炎症疾病，其具有慢性复发性、致残性及不可治愈性等特点^［1-4］。尽管CD的发病率在全球范围内持续上升，但其复杂的病因与发病机制目前尚未明确^［5］。肠屏障功能缺陷和肠道免疫失衡是其重要致病因素^{［6， 7］}。肠上皮细胞作为肠道机械屏障主要构成，通过紧密连接、黏附连接和桥粒等阻挡细菌、病毒及内毒素进入，而炎症会加剧肠上皮细胞凋亡从而损害肠屏障功能与结构^{［7， 8］}。并且以Th1/Th2比例失调为特征的肠黏膜免疫失衡是CD的核心病理改变，也是重要干预靶标^［1］。药物治疗是CD的主流策略，但其临床应用仍受限于毒副作用显著和靶向性低下等缺陷^{［2， 3， 5］}。因此急需研究更安全、更有效的新型药物。近年研究表明，植物来源天然产物凭借其多通路调节特性及显著的安全性优势，在CD治疗领域呈现突出潜力^［9］。珠子草作为一种传统草药，常被用于治疗肝炎、黄疸、痢疾和泌尿道感染等。现代植物化学研究表明，珠子草的活性成分复杂多样，包括木脂素类、黄酮类和生物碱等，而珠子草素（Nir）是木脂素类的关键成分^［10］，其具有抗炎、抗氧化应激和调节免疫等多种生物学功能^［11-16］。研究表明，Nir在足肿胀模型中表现出显著的治疗效果^［12］，其可以通过下调NF-kB/MAPKs/PI3K-Akt信号通路来发挥抗炎作用^{［13， 15-17］}。此外，Nir可以调节细胞内拓扑异构酶I介导的DNA蛋白复合物形成，从而调节细胞凋亡，并且纠正Th1/Th2平衡偏移，恢复免疫平衡^［18］。尽管Nir在炎症通路调控、细胞凋亡和免疫平衡调节中表现出显著治疗潜力，但在CD领域的研究仍属空白。为阐明其药理机制，本研究采用TNBS诱导的结肠炎小鼠模型和LPS诱导的结肠类器官炎症模型探究Nir对CD的干预效果，并通过网络药理学挖掘其核心作用靶点及调控机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与仪器试剂

本研究采用C57BL/6J小鼠（雄性，8~10周龄，江苏集萃药康）；TNBS，脂多糖（LPS）（Sigma）；珠子草素（TargetMol）；小鼠类器官培养基（STEMCELL）；基质胶（康宁）；RPMI 1640培养基（Gibco）；AB-PAS染色试剂盒（索莱宝）；GAPDH、ZO-1、Claudin-1抗体、p65、p-p65（Abcam）；p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、C-caspase3、BAX、Bcl-2、HRP标记山羊抗鼠/兔IgG（Cell Signaling Technology）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（塞维尔生物）；TNF-α和IL-10小鼠ELISA试剂盒（博士德生物）；Recilisib（MCE）；流式细胞仪（FACSCalibur，BD）；细胞刺激混合物（Invitrogen）；Alexa Fluor 700标记的CD3、BV605标记的CD4、PE标记的IFN-γ、Alexa Fluor 488标记的IL-4（Invitrogen）。

1.2 动物模型和干预方法

C57BL/6小鼠随机分为3组：空白对照组（WT组）、疾病对照组（TNBS组）和Nir干预治疗组（Nir组），6只/组。TNBS和Nir组接受TNBS（2.5%）干预构建结肠炎模型^［19］。Nir组小鼠给予Nir干预（40 mg/kg，灌胃，7 d），WT组和TNBS组则给予等量生理盐水^{［11， 18］}。造模后第8天行安乐死，采集结直肠组织及肠系膜淋巴结固定与冻存。为验证PI3K/AKT通路在Nir抗肠炎中的调控机制，将小鼠分为TNBS组、Nir组和Recilisib组，6只/组。3组皆接受TNBS（2.5%）干预，其中Recilisib组小鼠给予Nir和Recilisib干预（Nir同上；Recilisib，10 mg/kg，腹腔注射，7 d），标本采集和处理同上^［20］。本实验经蚌埠医科大学伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字［2024］第371号）。

1.3 结肠类器官提取和干预

取检6只小鼠新鲜结肠组织，去除结肠内容物并剪碎，使用低温DPBS反复冲洗至液体澄清透明。使用细胞解离液重悬肠组织，4 ℃孵育50 min，经70 μm细胞筛过滤，滤液于4 ℃、3000 r/min离心5 min收集隐窝沉淀。用类器官完全培养基和基质胶混合液重悬隐窝，并接种于预冷24孔板，37 ℃静置15 min成胶后，沿孔壁加入500 μL预热培养基，置于37 ℃、5 % CO₂培养箱中培养。将以上类器官分为3组：对照组、LPS组（LPS，100 μg/mL），Nir组（LPS，100 μg/mL；Nir，25 μmol/L）^{［15， 17］}。孵育24 h后收集样本固定与冻存。

1.4 结肠炎体征和病理损伤评估

从造模开始前至取检当日每日称量并记录小鼠体质量，观察小鼠体质量变化；取检时测量小鼠结肠长度；疾病活动度评分（DAI）量化小鼠体质量变化、粪便性状和便血情况，分值0~4分，评分越高提示肠炎症状越严重^［21］。

结肠组织经福尔马林固定后，脱水包埋制成蜡块、切成3 μm石蜡切片，HE染色后，使用组织炎症评分对结肠组织炎症细胞浸润程度、隐窝结构、黏膜增生和黏膜溃疡情况评估，分值0~4分，评分越高提示肠炎病理损伤越严重^［22］。

1.5 肠屏障功能评估

1.5.1 AB-PAS染色检测杯状细胞数量和黏液分泌水平

AB-PAS染色：将小鼠结肠组织蜡块切片进行脱蜡和水化后，按顺序进行阿利新蓝染色、氧化、Schiff染色、苏木素复染、酸性分化和Scott蓝化处理，随后逐级乙醇脱水、二甲苯透明和封片。图像采集后使用Image J软件分析杯状细胞数量变化。

1.5.2 免疫荧光检测紧密连接蛋白空间定位与表达情况

小鼠结肠组织石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复（95 ℃，20min），5% BSA室温孵育30 min，阻断非特异性结合位点，一抗孵育4 ℃湿盒孵育过夜（ZO-1，1∶200；Claudin-1，1∶400）、FITC标记山羊抗兔IgG（1∶1000）室温避光孵育1 h，DAPI（1 μg/mL）染色10 min，最后抗荧光淬灭剂封片采集图像。结肠类器官处理同上。

1.5.3 免疫印迹检测紧密连接蛋白表达水平

将小鼠结肠组织与RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合并于冰上低温研磨，并离心收集上清。采用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，以等量蛋白（5 μg）与上样缓冲液混合，95 ℃热变性5 min。电泳分离蛋白并通过湿式转膜法将蛋白转移至PVDF膜。随后室温封闭1 h（5%脱脂奶粉），并一抗4℃孵育过夜（ZO-1，Claudin-1，1∶1000；GAPDH，1∶3000），TBST洗膜，封闭二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠/兔IgG，1∶3000），化学发光法显影并拍照，使用Image J软件分析结果。结肠类器官处理同上。

1.6 肠上皮细胞凋亡情况评估

将小鼠结肠组织蜡块切片进行脱蜡和水化后，进行TUNEL染色：Proteinase K通透、样本洗涤、平衡、标记反应、样本洗涤和DAPI染核，然后抗荧光淬灭剂封片并镜检采集图像。使用免疫印迹技术检测凋亡蛋白C-caspase3（1∶1000）、BAX（1∶2000）和Bcl-2（1∶1000）表达量，方法同1.5.3。结肠类器官免疫印迹技术检测同上。

1.7 流式细胞术检测肠系膜淋巴结Th1和Th2比例变化

将小鼠新鲜肠系膜淋巴结低温研磨后清洗过滤（预冷RPMI 1640），制成单细胞悬液；离心并使用加入细胞刺激剂的完全培养基重悬，于37 ℃孵育6 h。收集细胞，加入抗CD3-Alexa Fluor 700和抗CD4-BV605室温避光染色30 min，清洗后使用IC buffer固定和permeabilization buffer破膜，随后加入抗IFN-γ-PE和抗IL-4-Alexa Fluor 488分别染色标记Th1（CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺）和Th2（CD3⁺CD4⁺IL-4⁺）细胞，清洗后重悬并使用流式细胞仪检测Th1和Th2比例，使用FlowJo V10.8.1软件分析处理数据。

1.8 ELISA检测结肠组织炎症介质水平

收集各组小鼠结肠组织并称取质量，按质量加入预冷RIPA裂解液冰上匀浆后，4 ℃孵育30 min，12 000 r/min离心收集上清。按TNF-α和IL-10试剂盒说明书检测炎症因子表达水平。

1.9 网络药理学和免疫印迹分析作用机制

以“Crohn's disease”为检索关键词于公共生物信息库（DisGeNet、DrugBank、TTD、PharmGKB及GeneCards）中筛选疾病相关靶标。通过药物靶点预测平台（Super-PRED、Swiss Target Prediction及SEA）输入Nir的SMILES公式解析其潜在作用靶点。取上述疾病靶点与药物靶点的韦恩分析交集作为共同靶标基因，并进行KEGG通路与GO功能富集分析（DAVID数据库），解析潜在生物学机制，并利用微生信云平台实现可视化。分子验证实验采用免疫印迹技术检测PI3K/AKT信号通路关键蛋白及其下游通路关键蛋白（方法同实验方法1.5.3）：p-PI3K（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-AKT（1∶2000）、AKT（1∶1000）、p-p65（1∶2000）和p65（1∶1000）的表达水平。

1.10 统计学分析

所有实验数据采用SPSS26.0软件分析。计量数据先经Shapiro-Wilk检验正态性、Bartlett检验方差齐性。符合正态分布且方差齐的数据以均数±标准差表示，多组比较采用One-way ANOVA，事后两两比较用Tukey's HSD检验；不符合者以中位数（25%分位数，75%分位数）表示，多组比较采用Kruskal-Wallis H检验，事后比较用Dunn's检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nir干预缓解TNBS诱导的结肠炎表型

与模型组相比，Nir干预有效抑制了TNBS结肠炎小鼠的体质量下降趋势（P<0.05，图1A），降低DAI评分（P<0.05，图1B），缓解结直肠缩短（P<0.05，图1C、D），改善炎症细胞浸润和结肠组织结构损伤（P<0.05，图1E、G）以及杯状细胞丢失（P<0.05，图1F、H）。

2.2 Nir改善TNBS诱导结肠炎小鼠的肠屏障功能

免疫荧光定位分析及免疫印迹定量检测表明，Nir干预恢复了TNBS小鼠肠上皮紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的表达水平（P<0.05，图2A~C）。

2.3 Nir抑制TNBS诱导结肠炎小鼠的结肠组织细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，Nir组结肠组织中细胞核DNA断裂数目明显低于TNBS组（P<0.05，图3A），提示Nir可以抑制肠上皮细胞的凋亡。免疫印迹检测凋亡通路关键蛋白表明，TNBS刺激后促凋亡因子C-caspase3及BAX表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，而Nir干预逆转了上述蛋白表达失衡（P<0.05，图3B、C）。

2.4 Nir抑制结肠类器官炎症模型的肠上皮细胞凋亡

经LPS诱导的结肠类器官在Nir干预后，隐窝出芽数量增加（P<0.05，图4A、B），提示肠上皮细胞增殖活性增强。免疫印迹分析显示，Nir处理组中凋亡效应蛋白（C-caspase3和BAX）表达下调，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调（P<0.05，图4C、D），与体内实验相互验证。

2.5 Nir改善LPS诱导的结肠类器官的肠屏障功能

免疫荧光定位分析显示，Nir干预后LPS损伤的结肠类器官中紧密连接蛋白ZO-1与Claudin-1沿细胞膜连续性分布增强；免疫印迹定量结果进一步证实Nir促进ZO-1和Claudin-1的表达（P<0.05，图5），有效修复LPS诱导的肠上皮屏障损伤。

2.6 Nir改善TNBS模型小鼠Th1/Th2失衡和炎症因子水平

流式细胞检测结果表明，TNBS诱导上调了小鼠肠系膜淋巴结中Th1的比例，而Nir干预逆转了这一变化（P<0.05，图6A、B），并促进Th2比例的升高（P<0.05，图6C、D），明显改善了TNBS小鼠的Th1/Th2失衡（P<0.05，图6E）。ELISA检测结果也证实了这些变化，与TNBS组相比，Nir干预降低了结肠组织中促炎因子TNF-α的水平，并提高了抗炎因子IL-10的水平（P<0.05，图6F、G）。

2.7 Nir对肠炎的改善作用可能与PI3K/AKT通路相关

基于DisGeNet、DrugBank等数据库筛选获得2368个CD疾病相关靶点和244个Nir作用靶点，经韦恩图取交集鉴定出123个核心靶点基因。KEGG和GO富集分析显示，这些基因富集于PI3K-AKT信号通路和细胞凋亡负调控生物过程（图7A~C）。此外，免疫印迹分析结果显示，Nir组p-PI3K和p-AKT蛋白表达在体内外实验中均下调（P<0.05，图7D~G）。

2.8 Nir可以通过负调控PI3K/AKT通路恢复免疫稳态与屏障完整性

免疫印迹结果显示，相较于Nir处理组，PI3K/AKT通路激活剂Recilisib干预后，小鼠结直肠组织中p-PI3K和p-AKT蛋白表达上调，提示Recilisib有效逆转了Nir对PI3K/AKT通路的抑制作用（P<0.05，图8A、C）。进一步检测凋亡相关蛋白发现，Recilisib干预后，促凋亡因子C-caspase3及BAX表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，逆转了Nir介导的肠上皮细胞抗凋亡效应（P<0.05，图8B、D）。此外，流式细胞术分析小鼠肠系膜淋巴结中T细胞亚群比例显示，与Nir组相比，Recilisib干预后Th1比例升高，Th2比例降低，Th1/Th2比例出现明显失衡（P<0.05，图8E~I）。免疫印迹进一步检测PI3K/AKT下游炎症调控分子发现，Nir处理可降低结直肠组织中p-p65的表达水平，而Recilisib干预则逆转了该调效应（P<0.05，图8J~K）。

3 讨论

本研究通过体内外实验结合的方式，证实了Nir不仅可以缓解结肠炎症状和肠屏障损伤，而且具有减少肠上皮细胞凋亡和调节肠黏膜免疫平衡（Th1/Th2）的作用。根据网络药理学富集分析结果的提示，本研究进一步证实了Nir调控凋亡与免疫平衡的作用与其介导的PI3K/AKT信号抑制相关。

克罗恩病作为一种慢性透壁性炎症疾病，其病程时间长，病变范围广，常表现为腹泻、体质量下降和营养不良^{［1， 3， 23］}。本研究采用TNBS诱导的小鼠结肠炎模型与LPS诱导的结肠类器官炎症模型，综合评估Nir对克罗恩病样肠炎的作用。动物实验结果表明，在宏观症状方面，Nir显著逆转了TNBS诱导引起的小鼠疾病活动指数评分上升、体质量下降和结直肠缩短；在微观病理方面，HE染色结果显示结肠组织炎症细胞浸润和结构损伤在Nir干预后得到显著改善。另外，既往研究表明杯状细胞是粘液分泌的核心细胞，CD炎症导致的杯状细胞数量减少、分布异常以及分泌功能障碍使得肠道黏液层变薄或缺失，从而削弱肠屏障功能^{［23， 24］}。因此，我们观察了Nir对结肠组织杯状细胞数量的影响。AB-PAS结果显示Nir显著逆转了结肠炎小鼠杯状细胞数量的下降。此外，炎症因子介导的上皮细胞间紧密连接破坏是CD常见的病理变化^{［25， 26］}，所以我们使用免疫荧光和免疫印记技术对小鼠结肠组织和类器官中紧密连接蛋白进行了检测，结果发现Nir组的ZO-1和claudin-1的表达显著升高，以上表明了Nir可以有效缓解结肠炎肠屏障功能的受损。

肠屏障作为克罗恩病的核心病理靶点，其稳态与肠上皮凋亡和局部免疫微环境平衡密切相关^{［6， 27， 28］}。研究表明，肠上皮细胞凋亡是肠道稳态维持的重要机制，其通过清除衰老或损伤细胞促进组织更新，但是凋亡过度会导致屏障破坏^{［29， 30］}。并且，既往研究发现，Nir在治疗利什曼病过程中表现出调节细胞凋亡的特性^［18］。因此，为进一步探究Nir对肠屏障功能的作用途径，我们进行了相关凋亡指标的检测。TUNEL染色结果显示，Nir显著降低了肠上皮凋亡细胞数量。体外实验还发现Nir可以增加类器官出芽数目。此外，研究表明Bax、Caspase-3和Bcl-2是凋亡调控网络的核心分子，Bcl-2通过结合Bax形成异源二聚体，维持线粒体膜完整性，抑制Caspase-3活性，从而抑制凋亡^{［31， 32］}。我们对以上凋亡相关蛋白进行检测发现，Nir干预后结肠组织和类器官中Bax和Caspase-3表达明显下调，而Bcl-2则明显上调，以上表明Nir可以抑制肠上皮细胞凋亡。另外，局部免疫微环境与肠屏障的相互作用是维持肠道稳态的核心机制，Th1/Th2细胞亚群在此过程中发挥关键调控作用^{［28， 33］}。研究表明Th1过度活化导致TNF-α等促炎因子释放，破坏TJs结构，增加肠道通透性^［34］。并且已有研究发现，Nir可以调节受到利什曼原虫感染小鼠的Th1/Th2失衡^［18］。因此，我们通过流式细胞术进一步探究其在CD中对Th1/Th2平衡的影响。实验结果显示Nir干预显著降低了结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中Th1细胞的比例，同时促进Th2比例升高，有效逆转了Th1/Th2免疫失衡状态。此外，ELISA对TNF-α和IL-10的检测结果也验证了Nir对Th1/Th2平衡的改善。以上结果表明，Nir可以通过抑制肠上皮细胞凋亡与恢复Th1/Th2免疫平衡，从而修复肠屏障功能来缓解结肠炎。

为解析Nir发挥抗肠炎作用的机制，我们借助在线数据库进行了网络药理学分析并验证。KEGG富集分析显示PI3K/AKT信号通路与Nir干预克罗恩病的密切相关。既往研究证实，PI3K/AKT持续性激活通过促进Bcl-2/Bax二聚体解离，激活caspase-3级联反应，驱动肠上皮细胞凋亡^{［31， 32］}以及上调T-bet转录因子，促进IFN-γ分泌并抑制GATA-3介导的IL-4表达，导致Th1/Th2比值升高^{［35， 36］}，从而促进炎症的发生发展^［37］。因此，我们进行了实验验证，发现Nir组结肠炎小鼠结肠组织和类器官的p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平显著下调，更为重要的是在使用PI3K/AKT通路激活剂后，Nir拮抗结肠炎小鼠肠上皮细胞凋亡和调节Th1/Th2免疫平衡的作用显著减弱。与此同时，我们进一步探究PI3K/AKT通路的下游效应机制，检测了其经典下游炎症调控通路NF-κB的关键激活分子p-p65^［38］，发现Nir可以降低p-p65表达水平，而PI3K/AKT通路激活剂可有效逆转该下调效应。以上结果表明了Nir通过抑制肠上皮细胞凋亡、重建Th1/Th2免疫稳态以发挥抗结肠炎作用，其核心机制与抑制PI3K/AKT通路活性，进而调控下游凋亡信号和炎症免疫分子表达有关。

本研究首次证实Nir对CD的治疗潜力，揭示并验证其核心作用途径：抑制肠上皮细胞凋亡并重建Th1/Th2平衡，进而修复肠道屏障功能，并且其作用可能与拮抗PI3K/AKT信号通路激活有关，为临床提供了基于肠屏障-免疫调控的新治疗策略。然而，本研究也存在一些局限性。首先，TNBS诱导的小鼠结肠炎虽能模拟CD黏膜炎症及屏障损伤，但无法重现人类CD的透壁性病变及狭窄并发症。其次，Nir可能通过多通路协同起效，机制未全覆盖。

综上所述，Nir可以通过介导PI3K/AKT信号抑制来调控肠上皮细胞凋亡与Th1/Th2平衡，从而保护肠道屏障功能来缓解克罗恩病样结肠炎。

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基金资助

安徽省高校科研项目(2023AH051953)

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