水飞蓟宾通过诱导细胞自噬及凋亡双重机制抑制兔青光眼术后纤维化

Silybin inhibits fibrosis after glaucoma filtration surgery in rabbits by promoting fibroblast autophagy

摘要

目的 探讨水飞蓟宾在抑制青光眼术后纤维化的作用及其分子机制。 方法 体内动物实验：将25只健康新西兰兔随机分为对照组及不同浓度水飞蓟宾实验组（50、100、200、250 μmol/L），5只/组，左眼行小梁切除术后连续7 d进行结膜下注射。术后动态监测眼压和滤过泡形态（Krofeld分型），第28天取术眼组织进行HE、Masson染色，Fibronectin和Collagen I免疫荧光检测。体外实验：通过TGF-β1诱导兔Tenon囊成纤维细胞纤维化模型，结合Western blotting及流式细胞术分析水飞蓟宾对自噬（LC3II/LC3I、p62）与凋亡的调控作用。 结果 术后7~21 d，不同浓度水飞蓟宾实验组兔眼压均低于对照组（P<0.05）。200 μmol/L、250 μmol/L实验组兔眼压降低可维持至术后28 d（P<0.05）。术后14~21 d，随着水飞蓟宾浓度升高，功能性滤过泡数形成率升高（P<0.05），200、250 μmol/L水飞蓟宾组在术后28 d仍保持40%以上的功能性滤过泡（P<0.05）。HE和Masson染色显示，各实验组炎性细胞浸润程度和纤维细胞数量较对照组降低、胶原沉积呈浓度依赖性减少。免疫荧光实验显示，水飞蓟宾呈剂量依赖性减少Fibronectin与Collagen I阳性细胞数量（P<0.001）。体外实验显示，水飞蓟宾逆转TGF-β1诱导的成纤维细胞纤维化表型（P<0.01），上调LC3II/LC3I比值（P<0.0001），降低p62表达（P<0.0001），并促进细胞凋亡（P<0.0001）。 结论 水飞蓟宾可明显抑制青光眼术后纤维化，可能是通过激活细胞自噬及诱导细胞凋亡双重机制减少成纤维细胞活化。

Abstract

Objective To investigate the effect of silybin in inhibiting fibrosis after glaucoma filtration surgery and the underlying mechanism. Methods Twenty-five healthy rabbits undergoing unilateral trabeculectomy on the left eye were randomly assigned into 5 groups for treatment with subconjunctival injections of sterilized water (control) or 50, 100, 200, and 250 μmol/L silybin for 7 consecutive days. Postoperative intraocular pressure (IOP) and filtration bleb morphology (Krofeld classification) were monitored. On day 28, tissues samples were harvested from the operated eyes for HE staining, Masson's trichrome staining, and immunofluorescence detection of fibronectin and collagen I. In cultured rabbit Tenon's capsule fibroblasts with TGF‑β1-induced fibrosis, the effects of silybin on autophagy and apoptosis were analyzed using Western blotting (LC3II/LC3I ratio and p62 expression) and flow cytometry. Results From postoperative day 7 to day 21, the rabbits with silybin treatment showed significantly lower IOP than those in the control group, and in the 200 and 250 μmol/L silybin groups, IOP reduction was maintained up to postoperative day 28. From postoperative day 14 to day 21, silybin dose-dependently increased the formation rate of functional filtering blebs, the 200 and 250 μmol/L silybin groups maintained more than 40% functional filtering blebs from postoperative day 14 to day 28. HE staining revealed obviously lessened inflammatory cell infiltration in silybin treatment groups compared with that in the control group. Masson's trichrome staining showed progressively reduced fibroblast numbers and collagen deposition in the silybin groups. Immunofluorescence staining confirmed that silybin dose-dependently reduced fibronectin and collagen I-positive cells. In cultured rabbit Tenon's capsule fibroblasts, silybin treatment effectively reversed TGF-β1-induced fibroblast fibrotic phenotype, increased the LC3II/LC3I ratio, decreased p62 expression, and promoted apoptosis of the fibroblasts. Conclusion Silybin significantly inhibits postoperative fibrosis in rabbit models of glaucoma likely by activating cellular autophagy and inducing apoptosis to reduce fibroblast activation.

Graphical abstract

关键词

水飞蓟宾 / 青光眼滤过术 / 纤维化 / 自噬 / 凋亡 / 兔Tenons囊成纤维细胞

Key words

silybin / glaucoma filtration / fibrosis / autophagy / apoptosis / rabbit Tenons capsule fibroblasts

青光眼是全球范围内复杂的神经退行性视网膜病变，由于其不可逆的视力障碍，最终会导致失明^［1］。据预测，青光眼患者的数量将从2013年的6430万人增加到2040年的1.118亿人，其中对亚洲和非洲人群的影响尤为显著^［2］。目前，青光眼的治疗目标是降低眼内压，以减缓疾病的进展^［3］。降低眼内压通常可通过药物治疗来实现，当药物治疗无法达到理想的眼内压控制效果时，或者在与白内障联合手术的情况下，通常会考虑采用青光眼手术治疗。尽管青光眼滤过手术（GFS）作为唯一经过验证治疗青光眼的方法，能够将多余的房水排入巩膜和结膜之间的空间以降低眼压，但3年内手术失败率达30%，5年内失败率高达50%^［4］。手术失败最主要的原因仍是滤过道瘢痕形成，尤其是巩膜表层纤维化，这会导致滤过泡功能丧失。抗代谢药物5-氟尿嘧啶（5-FU）和丝裂霉素C（MMC），已被广泛用于抑制滤过部位的纤维化，但总体效果并不令人满意^［5］。MMC 作为抗代谢药物，药理作用较强，需要注意选择适当的应用质量浓度并了解其毒副作用，控制其并发症的发生，才能更好地实现其临床应用价值^［6］。因此，寻找安全、有效的方法来提高青光眼滤过性手术术后创面愈合和抑制瘢痕形成已成为提高青光眼手术成功率的当务之急。

水飞蓟宾是一种黄酮类化合物，也是从水飞蓟种子中提取的水飞蓟素中关键活性成分。水飞蓟宾可以用作肝脏保护剂，除此之外还具有强大的抗氧化、抗衰老、抗炎以及神经保护的作用^［7-9］。研究表明，水飞蓟素在对抗CCl4、酒精、肝炎和铁过载等引起的纤维化中，发挥重要抗纤维化作用^［10］。水飞蓟宾能增强赖诺普利的抗纤维化作用，降低TGF-β处理的HK-2细胞中Collagen I、α-SMA、Smad2 和 Smad3 的表达^［11］；同时增强赖诺普利在高脂饮食诱导的肾纤维化小鼠中的抗纤维化作用，通过抑制NF‑κB减轻糖尿病肾病小鼠肾组织中Collagen I、p-IκB和p-p65的表达，可能是缓解糖尿病肾病肾纤维化的潜在药物^［12］。

本课题组前期研究已报道水飞蓟宾对视网膜神经节细胞急性损伤具有保护作用，能在体外激活MEK/ERK/CREB 通路来抑制细胞炎症^［13］。然而，水飞蓟宾在GFS后抗纤维化的作用仍然未知，发挥抗纤维化的潜在作用机制也有待研究。因此，本研究主要探讨水飞蓟宾抑制GFS后瘢痕形成的能力，明确水飞蓟宾在GFS后稳定眼压、促进术后滤过泡形成和降低细胞外基质蛋白表达的作用，并进一步验证水飞蓟宾能通过调控细胞自噬或凋亡水平来减少瘢痕形成的假设，从而初步探究水飞蓟宾抗纤维化的潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取健康新西兰兔25只（赣州市畜牧水产研究所提供），体质量2.0~2.5 kg，雄性，经过检疫检验，体检健康，排除全身用药史，眼部疾病史，常规性饲养。动物实验符合内蒙古医科大学附属医院实验动物伦理规定（伦理批号：DW2025015）。

1.1.2 主要试剂与仪器

水飞蓟宾（源叶生物），DMEM培养基、Hoechst33342染料和山羊抗小鼠Alexa Fluor488二抗（上海翌圣生物科技股份有限公司），RIPA组织细胞快速裂解液（Solarbio），BCA蛋白定量试剂盒（Biosharp），MOPS-SDS Running Buffer和Future PAGE TM蛋白预制胶（ACE），StarSingal Western蛋白Marker（GeneStar），丽春红染色液、考马斯亮蓝快速染色液、QuickBlock™ Western封闭液、QuickBlock™ Western一抗稀释液和QuickBlock™ Western二抗稀释液（碧云天），LC3II抗体、p62抗体、Fibronectin抗体、Collagen I抗体和β-actin抗体（Proteintech），Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。荧光显微镜、石蜡切片机（徕克），恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司），正置光学显微镜（尼康），电泳仪（BIO－RAD），流式细胞仪（贝克曼）和超净工作台（上海鼎科科学仪器公司）。

1.2 方法

1.2.1 体内动物实验

1.2.1.1　动物模型

兔眼滤过性手术动物模型造模方法参考文献^［14］。概括方法如下：采用25%乌拉坦1 g/kg耳缘静脉麻醉，并记录基础眼压。开睑暴露手术部位，经0.25%氯霉素冲洗后做以角巩膜缘为基底的3 mm×4 mm的板层巩膜瓣，深达1/2巩膜厚度，分离至透明角膜内至少1.0 mm处，咬切巩膜后唇1.5 mm×1.5 mm组织，并行相应虹膜周边切除，10/0线缝合巩膜瓣上角各1针，缝合结膜切口。

1.2.1.2　实验分组及给药

无菌条件下将水飞蓟宾的粉末溶于无菌水，配置成50、100、200、250 μmol/L 4种浓度溶液，4 ℃保存，24 h内使用。术后将青紫蓝兔随机分为5组：水飞蓟宾实验组（50、100、200、250 μmol/L）及对照组，5只/组。术后连续7 d 、1次/d在术眼下方远离滤过泡位置的穹隆结膜下实验组注射0.2 mL不同浓度水飞蓟宾、对照组注射等量无菌水。

1.2.1.3　术后眼压观察

在不使用其他药物的情况下，分别于术前及术后第1、7、14、21、28天用Tonopen接触式眼压计测眼压，测量3次取平均值。

1.2.1.4　术后滤过泡形态观察

采用Krofeld分型系统评估滤过泡形态与功能。该分型标准为：Ⅰ型（微小囊状型）-微囊状薄壁无血管；Ⅱ型（扁平弥散型）-扁平苍白厚壁；Ⅲ型（瘢痕型）-血管增生伴结膜下纤维化；Ⅳ型（包囊型）-局限囊样空腔。本研究中定义Ⅰ/Ⅱ型为功能性滤过泡，Ⅲ/Ⅳ型为无功能滤过泡。

1.2.1.5　病理组织学染色

术后28 d完整取出眼球并保证手术区巩膜、结膜组织不受损，甲醛固定、石蜡包埋，苏木精、伊红（HE）染色以及Masson染色^［15］，并通过光学显微镜观察。

1.2.1.6　免疫荧光染色

组织固定24 h后，经蔗糖梯度脱水。滴加OCT包埋剂进行冰冻切片后经抗原修复、BSA封闭、一抗和二抗孵育、DAPI核染色、封片操作后4 ℃避光保存。通过荧光显微镜观察Fibronectin与Collagen I阳性细胞表达情况，采用Image-pro-plus6.0软件定量测量Fibronectin与Collagen I阳性细胞数。

1.2.2 体外细胞实验

1.2.2.1　细胞培养、鉴定及分组处理

取新鲜兔眼Tenons囊组织，经PBS洗涤后剪碎，加DMEM培养液（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL）充分混匀后接种于灭菌玻璃培养皿中。培养箱中培养、细胞鉴定、传代。选取处于第4代对数期的RYTF进行试验，加入TGF-β1或200 μmol/L水飞蓟宾，分成对照组、TGF-β1组、TGF-β1+200 μmol/L水飞蓟宾组，分别进行Western blotting实验和流式细胞术检测。

1.2.2.2　Western blotting实验

使用裂解液提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，将30 µg蛋白样品加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100 ℃变性处理5 min后进行凝胶电泳。电泳后将凝胶内的蛋白转移至PVDF膜上，经过洗膜、封闭、一抗稀释液（稀释比例：LC3II/LC3I 1∶2000，p62 1∶2000，GAPDH 1∶5000）孵育过夜、二抗稀释液（稀释比例：HRP-Goat anti Rabbit 1∶10 000，HRP-Goat anti Muose 1∶10 000）孵育后进行化学发光凝胶成像系统显影。

1.2.2.3　流式细胞术检测凋亡

将细胞消化后重悬，去上清。加入工作液及FITC、PI染色液。设置空白对照管和单染管，孵育15 min后，分别加入工作液。使用流式细胞仪，对样品进行上机检测。采用FLOWJIO以及统计分析软件EXCEL对凋亡数据展开分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，采用配对Student t 检验分析两个匹配样本之间的差异，采用单因素方差分析进行多组比较。P<0.05为差异具有统计学意义。所有实验独立重复3次。

2 结果

2.1 水飞蓟宾对术后眼压的影响

术后各组未出现浅前房、脉络膜脱落等严重的术后并发症以及明显的炎症反应，仅有部分术眼于术后1~2 d出现结膜下充血，后逐渐恢复。

于术前，术后第1、7、14、21、28天测量各组兔眼压。结果显示（图1，表1），术前及术后1 d对照组与各实验组差异无统计学意义。术后第7、14、21天，不同浓度实验组与对照组相比，眼压均降低（P<0.05），在术后第28天，只有200、250 μmol/L实验组眼压与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 水飞蓟宾对术后功能性滤过泡形成率的影响

功能性滤过泡计数比较显示，对照组功能性滤过泡在术后14 d消失。各实验组术后第14~28天，随着水飞蓟宾浓度升高，功能性滤过泡形成率升高（P<0.05，表2）。

2.3 病理组织学结果

2.3.1 HE染色

HE染色结果显示（图2），黄色箭头为巩膜侧，各组滤过道周围组织均存在炎性细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主，伴少量浆细胞及巨噬细胞。各实验组术区呈现疏松结缔组织形态，炎性浸润程度显著低于对照组，对照组炎性细胞聚集密集。

2.3.2 Masson染色结果

Masson染色结果显示（图3），黄色箭头为巩膜侧，对照组巩膜滤过道被大量成纤维细胞和胶原等填塞，有明显的胶原沉淀，细胞排列紊乱、不规则，滤过道周围可见炎症细胞浸润，提示纤维化严重。实验组随着水飞蓟宾浓度的升高，滤过道周围纤维细胞的数量逐渐减少，胶原沉淀逐渐减少，250 μmol/L浓度组只可见少量胶原沉淀。

2.3.3 免疫荧光染色标记纤连蛋白（Fibronectin）和I型胶原蛋白（Collagen I）

免疫荧光染色结果显示，对照组Fibronectin、Collagen I阳性细胞数最多，实验组随着水飞蓟宾浓度的升高阳性细胞数逐渐减少，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.001，图4）。

2.4 水飞蓟宾能增强兔Tenons囊成纤维细胞（RYTF）的自噬，并促进其凋亡

2.4.1 RYTF体外培养

兔Tenons囊组织体外培养后，可见细胞呈梭形或分支状，细胞核大而居中，核仁明显，细胞生长呈放射状，有一定方向性（图5）。

2.4.2 RYTF的免疫荧光鉴定

选取处于第4代对数期的RYTF进行波形蛋白和角蛋白免疫荧光染色，结果显示：RYTF波形蛋白染色显红色荧光（图6B），未见角蛋白染色的绿色荧光（图6C），细胞核被DAPI蓝染（图6A），故可排除培养细胞中混杂结膜上皮细胞的可能。

2.4.3 水飞蓟宾能抑制TGF-β1诱导的RYTF纤维化

与对照组相比，TGF-β1组的RYTF形态拉长，呈长梭状（图7A、B），长径/短径比值较对照组升高（2.8±0.3 vs 1.2±0.1，P<0.001），且细胞间排列呈现放射状束状有序分布，为典型活化形态，TGF-β1+200 μmol/L水飞蓟宾组RYTF的长径/短径比值降至1.6±0.2（P<0.01），接近对照组水平，细胞长梭状形态缩短变宽，放射状排列模式被破坏（图7C），细胞形态更趋近于未活化的基底状态。

2.4.4 水飞蓟宾能促进TGF-β1诱导活化的RYTF发生自噬

Western blotting检测结果显示（图8），与对照组相比，TGF-β1组降低了RYTF细胞的LC3II/LC3I比值（P<0.0001），同时p62表达水平升高（P<0.001），TGF-β1+200 μmol/L水飞蓟宾组的LC3II/LC3I比值高于TGF-β1组（P<0.0001），p62表达被抑制，呈相反趋势（P<0.0001）。

2.4.5 水飞蓟宾能促进TGF-β1诱导的RYTF凋亡

流式细胞术检测结果显示（图9），与对照组相比，TGF-β1组的RYTF凋亡比例降低（P<0.01）；而TGF‑β1+200 μmol/L水飞蓟宾组的凋亡比例较TGF-β1组升高，甚至超过对照组水平（P<0.0001）。

3 讨论

青光眼作为全球范围内导致不可逆性失明的主要病因之一，其病理机制复杂。术后纤维化形成，使GFS的治疗效果一直不够理想，是导致手术失败的重要因素。本研究体内实验采用兔眼滤过性手术模型发现水飞蓟宾能在GFS后促进滤过泡存活并降低眼压，体外实验证实水飞蓟宾能逆转TGF-β1诱导的成纤维细胞纤维化表型，通过上调LC3II/LC3I比值、降低p62表达激活细胞自噬，并促进细胞凋亡，揭示了水飞蓟宾通过促进细胞自噬和凋亡双重作用抑制成纤维细胞活化，从而有效减少青光眼术后滤过泡瘢痕形成的作用机制。

青光眼滤过术后常因组织纤维化，瘢痕形成过多导致滤过泡功能有所下降。以往研究发现水飞蓟宾具有抗纤维化作用，能改善延迟辐射损伤导致的小鼠皮间充质转化^［16］，减轻肺部炎症和纤维化^［17］。本实验首先进行体内研究，结果显示，兔滤过手术后1 d，眼压因手术创伤导致房水生成减少而出现下降。随着术后时间延长对照组兔眼压会在28 d内出现反弹性升高，与以往的文献报道一致^{［18， 19］}。但是，水飞蓟宾处理后能抑制兔眼压的升高，并且具有浓度依赖性，可以维持至28 d以上，表明水飞蓟宾的治疗有利于稳定GFS后眼压降低。与以往单次给予低浓度（25 μmol/L）水飞蓟宾研究不同^［20］，本研究发现在GFS后连续多次给予高浓度（200~250 μmol/L）水飞蓟宾降低眼压的效果更为明显和稳定。

Krofeld分型结果显示，对照组在术后14 d后即表现为无功能性滤过泡（Ⅲ型和Ⅳ型），这与之前的报道一致，功能性滤泡在术后14 d完全丢失^［18］。与对照组相比，术后第14~28天，随着水飞蓟宾浓度升高，功能性滤过泡数量形成率升高，且200~250 μmol/L水飞蓟宾组在术后14~28 d仍保持40%以上的功能性滤过泡，这些数据表明水飞蓟宾治疗有助于GFS后功能性滤过泡的存活。本实验中，虽然可以观察到50~100 μmol/L水飞蓟宾组具有降低兔眼压的效果，但是可能由于药物浓度低，药效不足以使功能性滤过泡存活至术后28 d之久，故眼压反弹性升高。在组织病理学中，不同浓度的实验组中炎性浸润程度显著低于对照组，纤维细胞的数量逐渐减少，胶原沉淀逐渐减少，细胞外基质蛋白表达减少。这些体内研究结果均表明水飞蓟宾可以成为GFS后抑制瘢痕形成的前瞻性候选药物。

TGF-β是参与滤过泡瘢痕形成的核心调节因子，促进成纤维细胞的增殖和活化，驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞分化^［21］。肌成纤维细胞介导伤口收缩和细胞外基质（ECM）形成，I型胶原蛋白表达增加，ECM异常沉积^［22］。GFS后随着时间推移，伤口表面纤维胶原、血管回缩、成纤维细胞大部分消失，局部组织胶原纤维重塑形成滤过泡瘢痕，降低GFS手术后质量。本研究首先在体内实验Masson染色中发现，对照组巩膜滤过道被大量成纤维细胞和胶原等填塞，有明显的胶原沉淀。而水飞蓟宾能浓度依赖性的减少滤过道周围纤维细胞的数量，减少胶原沉积。此外，免疫荧光染色显示对照组Fibronectin、Collagen I阳性细胞数最多，而随着水飞蓟宾浓度的升高阳性细胞数逐渐减少，呈浓度依赖性，进一步证实水飞蓟宾抑制了滤过道胶原的形成。这与Wu等^［23］体外研究相似，TGF-β2在体外能诱导人小梁网细胞（HTM）产生大量ECM蛋白，包括纤连蛋白和I型胶原蛋白。本研究体外实验发现，RYTF被TGF-β1诱导后呈现长梭形、放射状排列，200 μmol/L水飞蓟宾对TGF-β1诱导的RYTF有逆转作用，使其长梭形的形态缩短变宽，放射状排列模式被破坏，细胞形态更趋近于未活化的基底状态，提示水飞蓟宾对TGF-β1诱导的细胞纤维化具有抑制作用。为了预防术后瘢痕形成，目前的治疗策略或方法重点集中在开发TGF-β通路抑制剂上，也对几种抗TGF-β药物进行了缓解增生性瘢痕的临床研究，包括TGF-β2单克隆中和抗体CAT-152（lerdelimumab）以及TGF-β/SMAD信号抑制剂SB-431542^{［24， 25］}。因此，具有相似途径抑制TGF-β诱导细胞纤维化作用的水飞蓟宾，也可能是降低GFS后滤过泡瘢痕形成的潜在药物。

自噬作为细胞内稳态的重要调节机制，可通过降解泛素化蛋白抑制纤维化相关信号通路^［26］。LC3广泛用于检测自噬水平，在自噬水平增加时，细胞质中LC3I转化为膜结合的LC3II，LC3II与LC3I的比值表明形成了自噬体^［27］。但是，TGF-β1在自噬中的作用并不确切，如在人结膜下成纤维细胞（hSCF）中TGF-β1能够诱导细胞自噬水平增加^［28］，但在人Tenon成纤维细胞（HTF）中，TGF-β1能抑制HTF的自噬水平^［29］。本文体外研究实验显示，TGF-β1处理RYTF后LC3II与LC3I的比例降低，说明TGF-β1抑制了RYTF的自噬水平。此外，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，能在自噬体中被蛋白水解酶降解清除，自噬过程受损会导致p62蓄积^［30］。TGF-β1处理后，RYTF中p62表达明显增加，进一步支持TGF-β1对RYTF的自噬抑制作用。然而，水飞蓟宾可上调TGF-β1诱导活化的成纤维细胞中LC3II/LC3I比值，并降低p62表达水平，恢复TGF-β1降低的自噬水平。一项中成药青光安颗粒体内抗瘢痕研究显示^［19］，兔滤过手术后兔眼组织（包含滤过泡、结膜、Tenon囊和巩膜）中LC3II/LC3I比值降低，p62表达升高，而青光安颗粒会增加LC3II/LC3I比值，降低p62的表达诱导自噬增强。综上所述，本研究证实TGF-β1能抑制RYTF的自噬，并可通过给予水飞蓟宾恢复。水飞蓟宾促进成纤维细胞的自噬，可能通过加速清除纤维化相关的异常蛋白沉积和受损线粒体，减轻细胞损伤，延缓纤维化进程，抑制过度纤维化反应。这一发现揭示了水飞蓟宾干预纤维化的潜在新机制，为其临床应用提供了理论依据。

细胞凋亡和自噬之间的关联非常复杂，二者可由共同的上游信号触发，共享分子开关，并且细胞凋亡与自噬之间可能会发生相互作用^［31］。如槲皮素和地榆皂苷II能通过抑制AKT/mTOR通路激活自噬并诱导肝细胞癌凋亡^{［32， 33］}。本研究流式细胞术结果显示，水飞蓟宾组凋亡细胞比例增加，恢复了TGF-β1介导的凋亡抑制效应，提示水飞蓟宾可能通过拮抗TGF-β1的抗凋亡信号通路或与其激活线粒体凋亡途径有关，促进细胞凋亡进程。以往研究重点强调水飞蓟宾能抑制TGF-β1介导的人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）迁移^［20］和TGF-β2处理的人小梁网细胞（HTM）迁移，减轻TGF-β2处理的诱导的肌动蛋白和波形蛋白丝重组^［23］。本研究则重点发现水飞蓟宾通过促进自噬和凋亡协同抑制成纤维细胞的异常增殖和活化的双重作用。

综上所述，本研究证明了水飞蓟宾在GFS后抗纤维化的潜在疗效，在体内能够促进术后滤过泡存活、降低稳定眼压和降低细胞外基质蛋白表达，在体外能够促进TGF-β1诱导活化的成纤维化细胞发生自噬和凋亡，为临床提供了新的药物干预方向。本研究为水飞蓟宾在青光眼术后抗瘢痕治疗中的应用提供了坚实的实验依据，也为提高GFS成功率提供了分子生物学基础。

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金面上项目(2025MS08003)

内蒙古医科大学附属医院高层次人才培养项目“航行系列”

内蒙古医科大学“致远”人才计划-“善学”人才(ZY20242131)

内蒙古医科大学面上项目(YKD2022MS003)

内蒙古自治区专科区域医疗中心

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