黄芩清热除痹胶囊调控LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX轴抑制JAK/STAT通路介导的类风湿关节炎滑膜血管新生

Huangqin Qingre Chubi Capsule inhibits JAK/STAT-driven synovial angiogenesis in rheumatoid arthritis by suppressing the LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX axis

摘要

目的 研究黄芩清热除痹胶囊（HQC）调控LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX 轴干预类风湿关节炎（RA）中JAK/STAT驱动的滑膜血管生成的作用机制。 方法 通过优化干预策略构建类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞/人脐静脉内皮细胞（RA-FLS/HUVEC）协同培养模型，采用梯度浓度含HQC血清（2.5%~30%，干预24~72 h）、LncRNA EBLN3P过表达及基因-药物联合处理，利用CCK-8法筛选共培养体系的最佳血清浓度与干预时长。通过EdU增殖实验、Transwell侵袭实验及细胞划痕实验评估HQC对RA-FLS病理活化的抑制作用，ELISA定量分析血管生成因子（VEGF、FGF2）及基质金属蛋白酶（MMP9、MMP2）表达水平，管腔形成实验联合免疫荧光技术检测RA-FLS诱导的HUVEC血管生成能力及内皮标志物（CD34、CD105）表达变化，qRT-PCR及Western blotting解析信号通路关键分子（LncEBLN3P、miR-369-3p、NFIX、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3）的mRNA或蛋白表达动态。 结果 共培养体系优化作用条件（细胞比例5：1，时间48 h）模型中，与对照组相比，模型组RA-FLS的恶性行为（增殖、侵袭及迁移能力）显著增强（P<0.01），促血管生成因子（VEGF、FGF2）与基质降解酶（MMP2、MMP9）表达显著上调（P<0.01），LncEBLN3P/miR-369-3p/NFIX轴异常激活，miR-369-3p表达受抑制（P<0.01），而LncEBLN3P、NFIX及下游JAK2/STAT3通路关键分子（JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3）表达均显著升高（P<0.01）。经HQC干预后，模型组RA-FLS恶性行为受抑（P<0.01），促血管因子及基质降解酶表达下调（P<0.01），且LncEBLN3P/miR-369-3p/NFIX-JAK/STAT轴被抑制（miR-369-3p表达升高，P<0.01；LncEBLN3P、NFIX、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3表达均下调，P<0.01）。在LncRNA EBLN3P过表达（OE-Lnc）模型中，HQC仍可部分逆转其诱导的病理表型及通路激活（P<0.01 vs OE-Lnc组），但与单纯HQC处理组相比，OE-Lnc+HQC联合处理组对细胞恶性行为及通路活化的抑制作用显著减弱（P<0.01）。 结论 HQC含药血清可能通过靶向LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX轴抑制JAK/STAT通路，从而抑制RA-FLS的促血管生成功能。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which Huangqin Qingre Chubi Capsule (HQC) inhibits synovial angiogenesis mediated by the JAK/STAT pathway in rheumatoid arthritis (RA). Methods An optimized co-culture model of RA-derived fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was treated with gradient concentrations of HQC-medicated serum with or without plasmid transfection for LncRNA EBLN3P overexpression. The inhibitory effects of HQC on pathological behaviors of RA-FLS were assessed using EdU assay, Transwell invasion assay, and scratch wound healing assay. Cellular secretions of pro-angiogenic factors (VEGF and FGF2) and matrix metalloproteinases (MMP2 and MMP9) were measured by ELISA. HUVEC tube formation capacity and expressions of the endothelial markers CD34 and CD105 were evaluated, and the expressions of molecules in the LncEBLN3P/miR-369-3p/NFIX axis and the JAK2/STAT3 pathway were detected using qRT-PCR and Western blotting. Results The RA-FLS exhibited significantly enhanced proliferation, invasion, and migration with upregulated expressions of VEGF, FGF2, MMP2, and MMP9 and dysregulation of tthe LncEBLN3P/miR-369-3p/NFIX axis, as shown by decreased miR-369-3p and increased expressions of LncEBLN3P, NFIX, JAK2, STAT3, p-JAK2, and p-STAT3. Treatment with HQC-medicated serum effectively reversed these pathological changes, suppressed malignant phenotype of the cells, downregulated angiogenic and matrix-degrading factors, and inhibited the axis and pathway activity. In the LncRNA EBLN3P overexpression (OE-Lnc) model, HQC treatment less effectively reversed the pathological phenotype and pathway activation in the cells as compared to its effect in the non-overexpression setting. Conclusion HQC inhibits pro-angiogenic function of RA-FLS likely by targeting the LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX axis, thereby suppressing the downstream JAK/STAT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

类风湿关节炎 / 黄芩清热除痹胶囊 / 滑膜血管新生 / 竞争性内源RNA

Key words

rheumatoid arthritis / Huangqin Qingre Chubi Capsules / synovial neovascularization / competitive endogenous RNAs

类风湿关节炎（RA）是一种以慢性滑膜炎性病变为特征的全身性自身免疫疾病，其核心病理表现为持续性滑膜炎症及进行性关节破坏，最终导致软骨侵蚀与骨损伤^［1，2］。在RA病理进程中，成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）的异常活化发挥关键作用，生理状态下，FLS通过分泌滑液成分维持关节稳态；而在RA中，其表型转化为促炎性，通过侵袭性增殖和炎性介质释放驱动滑膜炎症与关节破坏^［3］。这一过程与促炎/抗炎细胞因子失衡密切相关——JAK/STAT信号通路可被多种细胞因子激活，通过“细胞因子-受体-STAT磷酸化”级联反应，诱导促炎因子及基质降解酶（如MMPs）的过度表达，进一步放大炎症反应并加剧骨侵蚀^［4，5］。研究发现长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源性RNA（ceRNA），通过与miRNA、假基因及环状RNA（circRNA）的交互作用，形成lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，参与自身免疫性疾病等病理过程^［6-9］。值得注意的是，lncRNA可通过调控FLS的炎性激活、侵袭迁移等病理行为影响JAK/STAT通路活性，提示其作为RA治疗靶点的潜在价值。黄芩清热除痹胶囊（HQC）是安徽中医药大学第一附属医院研制的治疗RA的中药复方制剂。其组成包括黄芩、栀子、薏苡仁、桃仁、铁线莲五味中药^［10］。拥有中国合法的生产许可证（安徽医药系统：Z20200001），并已获得国家发明专利（专利号：ZL201110095718HQC）^［11］。

本研究首次揭示HQC通过靶向LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX-JAK/STAT调控轴抑制类风湿关节炎滑膜血管新生的创新机制。我们团队前期的研究工作已提供了充分的体内实验证据：在佐剂性关节炎（AA）大鼠^{［12，13］}和胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠^{［10， 14］}等标准模型中，通过严谨的实验证实了HQC可显著抑制关节炎的进展和滑膜病理改变。本研究的核心科学问题，旨在超越对药效的重复验证，深入揭示HQC的作用机制。LncRNA EBLN3P的功能在RA中尚未被探索，其已知功能也多局限于肿瘤领域^{［15， 16］}。本研究首次提出并验证HQC通过调控“LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX”轴影响JAK/STAT信号通路，进而抑制RA滑膜血管新生的创新机制。与已知的LncRNA通过ceRNA机制发挥作用不同^{［17， 18］}，本研究发现EBLN3P可直接调控转录因子NFIX的表达，进而影响JAK/STAT信号通路的活性。基于RA-FLS/HUVEC共培养体系模拟滑膜血管新生病理过程，旨在通过解析LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX调控轴对JAK/STAT信号通路的影响，系统阐明HQC抑制RA滑膜血管新生的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

药物与试剂：HQC（每粒含生药0.4 g）由安徽中医药大学第一附属医院提供。细胞培养与功能检测试剂：CCK-8试剂盒、DMEM高糖培养基、SYBR Green qPCR预混液（Servicebio）。HUVEC专用培养基（上海赛百慷基因技术有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS）、Transwell小室（LABSELECT）基质胶（Matrigel）（索莱宝科技有限公司）。分子生物学试剂：TRIzol试剂（Life Technologies），反转录试剂盒（TaKaRa），pcDNA3.1-LncRNA EBLN3P过表达质粒及空载对照（Gene Pharma）。蛋白分析试剂：RIPA裂解液、PMSF（Biosharp），预染蛋白Marker（Thermo）。膜表面标记抗体：PE标记抗CD105抗体、FITC标记抗CD34抗体（联科生物技术股份有限公司）。信号通路及功能蛋白抗体：抗AKT、p-AKT、PI3K、VEGF、bFGF抗体（Affinity）。内参及二抗：抗β-actin抗体、HRP标记山羊抗小鼠/兔IgG（Zs-BIO）。细胞核染色试剂：DAPI、皂苷（Beyotime）。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备

将20只清洁级雄性大鼠适应性培养， 随机分为空白组组和含药血清组， 空白组给与0.9%生理盐水（2 mL/100 g/d）灌胃，根据既往报告^［19］，含药血清组予HQC混悬液（6.48 g·kg^-1·d^-1，按体表面积折算为临床等效剂量20倍）灌胃，连续灌胃7 d，末次给药2 h后经戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg），无菌条件下采集腹主动脉全血，3000 r/min离心15 min。取血清，56 ℃水浴灭活30 min后分装，-80 ℃保存备用。

1.2.2 RA-FLS/HUVEC共培养条件优化实验

为建立稳定的RA-FLS/HUVEC共培养体系并优化HQC的干预参数，进行了以下2组CCK-8实验：共培养比例与时间优化：将HUVEC细胞以1×10⁵ /mL的密度接种于96孔板。接种完成后，将培养板置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中孵育过夜使细胞贴壁。将不同数量的RA-FLS细胞（以达成1∶1，2∶1，5∶1，10∶1等共培养比例）接种于Transwell上室中。分别于共培养24、48、72 h后，移除上室，向下室每孔中加入10 μL含10% CCK-8试剂，继续孵育1 h。使用酶标仪于测定各孔吸光度值A_{450 nm}，以评估不同条件下HUVEC的细胞活力。

HQC在共培养体系中的浓度-时间效应：基于上述优化的共培养比例（5∶1）和时间（48 h），在共培养开始时，向培养基中加入不同终浓度（25-400 mL/L）的HQC含药血清。干预48 h后，同上法采用CCK-8法检测共培养体系中HUVEC的细胞活力。

1.2.3 基于优化条件的Transwell共培养模型建立

基于CCK-8实验的优化结果建立后续功能实验所需的Transwell共培养模型。具体操作如下：将经过不同处理的FLS及RA-FLS细胞重悬，调整密度至5×10⁶/mL，取0.5 mL该细胞悬液（即2.5×10⁶细胞）加入Transwell小室的上层。同时，将HUVEC细胞重悬，调整密度至1×10⁶/mL，取0.5 mL该细胞悬液（即5×10⁵细胞）接种于专用的下层六孔板培养板中，将接种完成的Transwell板置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中进行过夜培养，使细胞充分贴壁。将Transwell小室放入下层孔板中，确保FLS与HUVEC通过培养基进行间接接触，继续共培养48 h。

具体分组如下：正常FLS（未处理对照），RA-FLS模型组（疾病对照），RA-FLS+20%含药血清处理48 h（药物干预组），RA-FLS+pcDNA3.1-LncRNA EBLN3P过表达质粒转染（基因干预组），RA-FLS+pcDNA3.1-LncRNA EBLN3P过表达质粒转染，转染6 h换液成含有20%含药血清的培养基（基因+药物联合干预组），RA-FLS+空载质粒转染（阴性对照组），各组加入0.5 mL悬液于Transwell小室，置于正常培养的HUVEC细胞上共培养48 h。

1.2.4 Edu细胞增殖

各组细胞按实验设计处理后，加入10 μmol/L EDU 染料，确保完全覆盖细胞层，37 ℃孵育 2 h。弃去 EDU 培养基，用 PBS 清洗细胞后加入4%多聚甲醛（PFA），室温固定30 min。弃去固定液，用 PBS 清洗后加入 0.5% Triton X-100（PBS 配制），室温通透 20 min。按照试剂盒说明书配制 Click 反应液，将反应液加入细胞培养板中，避光条件下室温反应 30 min。反应完成后，弃去反应液，用PBS清洗3 次。加入1 μg/mL DAPI 工作液，避光室温孵育 10 min。弃去 DAPI 溶液，用PBS清洗3次。在荧光显微镜下观察 EDU和 DAPI信号。

1.2.5 Transwell侵袭实验

用 4 ℃预冷的无血清培养基将 Matrigel 稀释至 1 mg/mL。取 100 μL 稀释后的 Matrigel 加入 Transwell 上室底部，均匀覆盖膜表面，37 ℃ 孵育4~5 h。制备0.5×10⁵/mL 的细胞悬液，下室加入 600 μL 含 10% 胎牛血清的完全培养基，上室加入 100 μL 细胞悬液，37 ℃、5% CO₂ 培养 24 h。吸弃上室培养基，将小室移至含 1 mL 4% 多聚甲醛的孔中，室温固定 30 min。将小室移至含 1 mL 0.5% 结晶紫的孔中，室温染色20 min。

1.2.6 细胞划痕实验

在6孔板中加入约1×10⁶细胞，具体接种密度需根据细胞类型进行调整，以确保细胞在培养过夜后能够形成单层贴壁。用PBS洗细胞3次，以去除未贴壁的细胞，清洗完毕后，更换为无血清培养基。将培养板置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中进行培养。分别在接种后0 h和24 h时间点，采用倒置相差显微镜观察并记录细胞的迁移情况。

1.2.7 管腔形成实验

将基质胶（10 mg/mL，35 μL/孔）铺在 96 孔板的底部，37 ℃孵育45 min使其固化。随后，使用预冷枪头，吸取等量Matrigel基质胶，垂直加入预冷的96孔板中，37 ℃继续孵育1 h形成稳定凝胶。待凝胶完全凝固后，消化处理各组细胞，用含血清培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁵/mL。将调整好浓度的细胞悬液加入已铺Matrigel（10 mg/mL，35 μL/孔）的孔中，每孔加入200 μL，37 ℃、5%CO₂条件下培养8 h。吸除培养基后用PBS洗涤1次。每孔加入200 μL PBS，在显微镜下随机选取3个视野进行细胞计数，并统计实验结果。

1.2.8 免疫荧光实验报告

向培养孔板中加入 200 μL Saponin 溶液，随后加入等体积 3% BSA 封闭液覆盖细胞层，室温封闭 20 min。滴加 200 μL用 PBS 稀释的一抗CD34（1∶200，Affinity）、CD105（1∶100，SciBen）。移除一抗，滴加 200 μL 相应种属的二抗（1∶400），37 ℃ 避光孵育 30 min。洗涤后，滴加 200 μL DAPI 染液，室温避光孵育 5 min。洗涤去除未结合染料，滴加抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.9 qRT-PCR

使用 Trizol 试剂盒提取 HUVEC 细胞总RNA。以 1 μg RNA为模板，用 PrimeScript RT 试剂盒合成 cDNA。cDNA 扩增程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。以 β-actin 和 U6为内参，采用 2^-∆∆Ct 法分析数据。引物由 Sangon Biotech 合成，序列见表 1。

1.2.10 蛋白质印迹 （Western blotting） 分析

在6孔板中加入 100 μL RIPA 裂解液（含 1 mmol/L PMSF），冰上裂解 30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，收集上清用于电泳。电泳后，以 300 mA 恒流转膜，用5%脱脂奶粉（磷酸化蛋白用 5% BSA）室温封闭2 h。加入一抗，4 ℃缓慢摇动孵育过夜。加入 HRP 标记的二抗，室温孵育2 h。将 ECL 化学发光试剂 A 液与 B 液等体积混合，均匀覆盖膜表面，根据信号强度优化曝光时间，采集蛋白条带图像，所用抗体的详细信息见表2。

1.2.11 ELISA

根据试剂盒说明书要求，将VEGF、FGF2、MMP9和MMP2标准品用稀释液进行系列稀释，制备7个浓度梯度（0、62.5、125、250、500、1000、2000 pg/mL）。使用稀释液（1% BSA 的 PBS）进行稀释。按说明书对预先包被抗体的96孔微孔板进行封闭。每孔加入上清孵育。每组设置 3 个复孔。孵育结束后，弃去孔内液体，洗涤。加入TMB显色底物室温避光反应后，加入终止液，并按照说明书测量 VEGF、FGF2、MMP9、MMP2的浓度。

1.2.12 统计分析

本研究采用体外细胞模型进行实验，每组设置6次独立细胞实验重复（n=6），以确保实验结果的可靠性。根据预实验结果（效应量d=1.66，α=0.05，检验效能=80%），通过G*Power 3.1软件进行样本量估算，结果显示每组至少需要5个独立样本即可检测到显著性差异。因此，本研究设置的样本量（n=6）满足统计学要求。使用 SPSS 26.0 软件对实验数据进行统计分析，GraphPad Prism 9.1.0 软件用于图像生成。数据以均数±标准差表示，组间差异采用 Student's t检验或单因素方差分析进行比较。对于非正态分布的数据，以中位数（四分位间距）［M（P25，P75）］表示。以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 RA-FLS/HUVEC共培养体系建立及HQC给药参数优化

CCK-8实验优化共培养条件，结果显示，HUVEC细胞活力与RA-FLS共培养比例及时间密切相关。当RA-FLS与HUVEC以5∶1的比例共培养48 h时，HUVEC细胞活力达到峰值（P<0.0001，n=6，图1A），故确立此条件用于后续实验。

进一步在此优化体系（5∶1， 48 h）中评估HQC的效应。发现HQC含药血清以时间-浓度依赖性的方式抑制HUVEC细胞活力。其中，200 mL/L HQC处理48 h对HUVEC活力的抑制率达50%（P<0.0001，n=6，图1B），故选定此浓度为后续实验的最佳给药参数。

2.2 HQC通过调控LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX轴抑制RA-FLS的炎性活化及侵袭性

EdU细胞增殖检测、Transwell侵袭实验及划痕愈合实验结果显示，相较于正常对照组，模型组细胞增殖活性显著增强（P<0.0001，n=3），侵袭细胞数增加（P<0.0001，n=3），划痕愈合率提升（P<0.001，n=3，图2A~F）。经HQC含药血清干预后，细胞增殖、侵袭及迁移能力均呈现显著性抑制（P<0.05）。在Lnc过表达（OE-Lnc）的RA-FLS模型中，HQC含药血清干预可显著逆转OE-Lnc诱导的细胞恶性表型（P<0.01）。HQC含药血清在OE-Lnc模型中的抑制作用显著减弱（P<0.05）。

ELISA分析进一步显示，与对照组相比，模型组血管生成相关因子（VEGF、FGF2）及基质降解关键酶（MMP9、MMP2）的蛋白表达水平显著上升（P<0.0001， n=6），HQC含药血清干预可显著下调RA-FLS中VEGF、FGF2、MMP9、MMP2的表达水平（P<0.0001，图2G~J）。进一步分析显示，在OE-Lnc组模型中，上述因子的表达水平显著上升（P<0.0001），而HQC可有效逆转OE-Lnc对上述因子的促表达效应（P<0.0001）。在OE-Lnc模型中，HQC含药血清对细胞恶性表型的抑制作用显著减弱 （P<0.0001）。

2.3 HQC通过阻断LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX信号抑制RA-FLS诱导的HUVEC血管生成

模型组管腔形成数量较正常对照组增加（P<0.0001，n=3），血管内皮标志物CD34（P<0.0001，n=3）和CD105（P<0.0001，n=3）表达显著上调（图3）。经HQC含药血清干预后，模型组血管生成活性被抑制，管腔数量减少，CD34和CD105表达量较模型组下降（P<0.0001）。在OE-Lnc组模型中，上述因子的表达水平显著上升（P<0.0001），HQC含药血清干预可显著逆转OE-Lnc诱导的管腔形成数量和血管内皮标志物表达量（P<0.0001）。 OE-Lnc可部分拮抗HQC的抑制效应，与单纯HQC处理组相比，OE-Lnc+HQC联合处理组的管腔形成数量回升，CD34和CD105表达量均有所恢复（P<0.0001）。

2.4 HQC经由NFIX调控JAK/STAT信号通路核心基因的转录

与正常对照组相比，模型组LncEBLN3P表达量升高（P<0.0001），而miR-369-3p表达被抑制（P<0.0001），导致转录因子NFIX、JAK2及STAT3显著上调（P<0.0001，图4A~E，n=6）。经HQC含药血清干预后，模型组中异常升高的LncEBLN3P表达被显著下调（P<0.0001，P<0.001），同时逆转了miR-369-3p的抑制状态（P<0.0001），进而有效抑制了NFIX、JAK2及STAT3的过度激活（P<0.0001）。在OE-Lnc模型中，该调控轴呈现协同放大效应：LncEBLN3P表达量进一步升高，miR-369-3p表达被深度抑制，进而导致NFIX、JAK2及STAT3均显著高于空载对照组（P<0.0001或P<0.01）。HQC干预可有效逆转该协同效应：LncEBLN3P表达下调，miR-369-3p表达上升，NFIX、JAK2及STAT3均显著降低（P<0.0001，P<0.01）。OE-Lnc可部分拮抗OE-Lnc+HQC联合处理组的协同效应（P<0.0001）。

2.5 HQC通过LncRNA EBLN3P/miR-369-3p/NFIX轴抑制JAK/STAT通路关键蛋白的磷酸化激活

与正常对照组相比，模型组转录因子NFIX、JAK2、STAT3及p-JAK2、p-STAT3水平显著上调（P<0.01，图5B~F，n=3），经HQC干预后，上述因子水平被显著逆转（P<0.0001，P<0.001，P<0.01）。在OE-Lnc模型中，转录因子NFIX、JAK2、STAT3及p-JAK2、p-STAT3均显著高于空载对照组（P<0.001，P<0.001）。HQC含药血清干预可使NFIX、JAK2、p-JAK2及STAT3、p-STAT3均显著降低（P<0.001，P<0.01）。另外，与单纯HQC处理组相比，OE-Lnc+HQC联合处理组NFIX、JAK2、p-JAK2及STAT3、p-STAT3的水平有所恢复（P<0.001，P<0.001或P<0.01）。

3 讨论

RA是一种慢性、免疫介导的疾病，其特征包括滑膜内膜增生、血管翳形成以及软骨和骨破坏^［20］。在RA中，RA-FLS是增生性和侵袭性滑膜组织中的关键效应细胞，通过产生多种致病介质，在驱动滑膜炎症、软骨损伤和关节破坏中发挥核心作用^［21-23］。此外，RA-FLS表现出异常的病理表型，导致滑膜过度增生并增强其对软骨和骨骼的侵袭能力，从而加剧关节破坏^［24］。值得注意的是，促炎细胞因子会刺激滑膜中的FLS，导致其过度产生促血管生成因子（如VEGF和MMPs）。这些因子一方面通过增强内皮细胞的增殖和迁移促进病理性血管新生，另一方面直接降解关节的软骨和骨基质（细胞外基质），共同造成不可逆的关节结构破坏^{［25， 26］}。既往研究表明，在RA关节微环境中，高表达的促炎细胞因子通过结合其细胞膜受体，激活 Janus 激酶 2 （JAK2），进而磷酸化下游转录因子信号转导与转录激活因子 3 （STAT3）。活化的 STAT3 入核调控靶基因表达，驱动一系列关键病理进程，包括诱导滑膜炎症、促进 RA-FLS的异常增殖并赋予其抗凋亡特性、增强 RA-FLS 的迁移与侵袭能力，最终导致病理性血管翳的形成^{［20， 27］}。

lncRNA是长度超过 200 个核苷酸但不编码蛋白质的 RNA转录本，在自身免疫性疾病中协调炎症和免疫调节中起关键作用^［28］。lncRNA是炎症反应的调节因子，并且在机制上与炎症关节病理学相关，已被确定并用作 RA 的关键临床诊断生物标志物^{［29， 30］}。在这其中，LncRNA HOTAIR展现出显著的保护作用，已有研究发现，在RA中，HOTAIR通过竞争性吸附miRNA-106b-5p，解除其对下游靶基因的抑制作用，从而有效减缓FLS的异常增殖和侵袭，最终抑制RA的疾病进展。这一发现揭示了HOTAIR通过ceRNA机制在RA中发挥保护性作用的具体分子途径^［31］。该研究表明，特定lncRNA（MALAT1、UCA1、FAM211A-AS1和AC000111.6）的基因多态性与RA的遗传易感性相关，提示这些lncRNA可能通过调控基因表达或免疫炎症通路参与RA的发病机制^［32］。该研究发现，在RA中，lncRNA TUG1通过吸附miR-34a-5p解除其对乳酸脱氢酶A（LDHA）的抑制作用，从而促进FLS的糖酵解活化和异常增殖，加剧RA的滑膜炎症和关节破坏。这表明TUG1/miR-34a-5p/LDHA轴通过调控细胞代谢重编程参与RA发病机制^［33］。该研究发现，在RA中，lncRNA GAS5通过吸附miR-222-3p解除其对Sirt1基因的抑制作用，从而增强Sirt1介导的抗炎和抗氧化作用，减轻FLS的炎症反应和关节损伤。这表明GAS5/miR-222-3p/Sirt1信号轴通过调控细胞应激和炎症反应发挥RA保护作用^［34］。关于长链非编码RNA EBLN3P的研究主要集中于肿瘤发生发展机制领域，其在血管生成中的作用尚未阐明。现有研究表明，EBLN3P通过不同的分子机制参与多种恶性肿瘤的进展：在骨肉瘤中，EBLN3P通过吸附miR-224-5p解除对Rab10的抑制，促进肿瘤细胞增殖和转移^［35］；在非小细胞肺癌中，EBLN3P通过调控TNPO1表达增强肿瘤细胞的放疗抵抗性^［36］；在结直肠癌中，EBLNN3P/miR-323a-3p/UHMK1信号轴通过ceRNA机制加速肿瘤进展^［37］。然而，值得注意的是，尽管EBLN3P在肿瘤生物学中的功能已得到初步阐明，目前尚未见其在RA发病机制中的相关研究报道。

HQC由黄芩、栀子、威灵仙、薏苡仁和桃仁组成。基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的成分分析表明，HQC的主要活性成分为黄酮类化合物，包括黄芩苷、木犀草素和槲皮素等，这些成分被证实具有显著的抗炎与免疫调节活性^［38］。进一步研究证实，HQC通过靶向抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低IκBα磷酸化水平、抑制NF-κB核转位及其DNA结合活性，从而有效阻遏FLS的增殖、迁移与侵袭能力，同时双向调节炎性细胞因子平衡，最终改善RA患者的疾病活动度^［39］。此外，HQC还可通过重编程巨噬细胞极化表型实现双途径免疫调控，进一步协同缓解RA的病理进展^［40］。

然而，目前关于HQC通过调控lncRNA信号通路在RA中发挥作用的研究尚未见报道。本研究基于前期发现——即LncRNA EBLN3P可通过竞争性吸附miR-369-3p解除其对NFIX的转录抑制，从而激活JAK/STAT通路，促进RA-FLS的增殖、迁移、侵袭及促血管生成因子分泌^［41］，在体外共培养体系中进一步探讨了HQC对这一明确致病轴的调控作用。通过建立RA-FLS与HUVEC的共培养模型，本研究揭示了HQC含药血清通过靶向EBLN3P/miR-369-3p/NFIX调控轴，抑制RA-FLS病理活化及后续血管生成的新机制。研究结果显示，HQC能够以时间与浓度依赖性的方式，显著抑制RA-FLS的增殖、迁移及侵袭能力，并同时下调其分泌的关键血管生成因子（VEGF、FGF2）及基质降解酶（MMP2、MMP9）。在机制层面，我们证实HQC的核心作用始于特异性下调EBLN3P的表达，此举解除其对miR-369-3p的“分子海绵”效应，使miR-369-3p得以抑制NFIX的翻译，进而阻断了NFIX介导的JAK2/STAT3信号通路活化，最终导致HUVEC血管生成表型及特异性内皮标志物（CD34、CD105）表达的减弱。本研究最为关键的证据来自于功能获得性实验：当在HQC干预的同时过表达EBLN3P，可以显著削弱HQC对RA-FLS增殖、侵袭及促血管功能的多重抑制作用。这一发现强有力地在体外系统层面建立了因果关系，将HQC的药效直接锚定于EBLN3P这一特定的分子事件，证实了该lncRNA是HQC发挥药理作用的核心靶点，而非次要或伴随现象。综上所述，本研究不仅首次报道了HQC通过EBLN3P/miR-369-3p/NFIX轴调控JAK/STAT通路的新机制，深化了对该复方在转录后及表观遗传层面作用的理解，也为未来开发以lncRNA为靶点的类风湿关节炎精准治疗策略提供了重要的理论依据与实验基础。

必须指出的是，本研究的核心结论主要基于细胞层面的实验证据。尽管我们在体外体系中明确了HQC通过EBLN3P/miR-369-3p/NFIX轴调控JAK/STAT通路的作用，但目前仍缺乏在体内水平直接操作EBLN3P轴并观察HQC效应的实验验证。 RA作为一种复杂的全身性免疫疾病，其病理过程涉及多种免疫细胞与组织微环境的相互作用。因此，未来在动物模型中，例如通过关节内注射EBLN3P过表达病毒等方式，直接评估该轴在整体疾病背景下的功能及HQC的干预效果，将是后续研究方向。

参考文献

[1] Jang S, Kwon EJ, Lee JJ. Rheumatoid arthritis: pathogenic roles of diverse immune cells[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(2): 905. doi：10.3390/ijms23020905

[2] Zheng YX, Wei K, Jiang P, et al. Macrophage polarization in rheumatoid arthritis: signaling pathways, metabolic reprogramming, and crosstalk with synovial fibroblasts[J]. Front Immunol, 2024, 15: 1394108. doi：10.3389/fimmu.2024.1394108

[3] Tsaltskan V, Firestein GS. Targeting fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis[J]. Curr Opin Pharmacol, 2022, 67: 102304. doi：10.1016/j.coph.2022.102304

[4] Simon LS, Taylor PC, Choy EH, et al. The Jak/STAT pathway: a focus on pain in rheumatoid arthritis[J]. Semin Arthritis Rheum, 2021, 51(1): 278-84. doi：10.1016/j.semarthrit.2020.10.008

[5] Xia X, He C, Xue Z, et al. Single cell immunoprofile of synovial fluid in rheumatoid arthritis with TNF/JAK inhibitor treatment[J]. Nat Commun, 2025, 16(1): 2152. doi：10.1038/s41467-025-57361-0

[6] Xu D, Jiang Y, Yang L, et al. Long noncoding RNAs expression profile and functional networks in rheumatoid arthritis[J]. Oncotarget, 2017, 8(56): 95280-92. doi：10.18632/oncotarget.20036

[7] Chan JJ, Tay Y. Noncoding RNA: RNA regulatory networks in cancer[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(5): E1310. doi：10.3390/ijms19051310

[8] Fan Z, Gao S, Chen Y, et al. Integrative analysis of competing endogenous RNA networks reveals the functional lncRNAs in heart failure[J]. J Cell Mol Med, 2018, 22(10): 4818-29. doi：10.1111/jcmm.13739

[9] Li LJ, Zhao W, Tao SS, et al. Competitive endogenous RNA network: potential implication for systemic lupus erythematosus[J]. Expert Opin Ther Targets, 2017, 21(6): 639-48. doi：10.1080/14728222.2017.1319938

[10] Hu Y, Liu J, Xin L, et al. Huangqin Qingre chubi capsule is associated with reduced risk of readmission in patients with rheumatoid arthritis: a real-world retrospective cohort study[J]. Int J Gen Med, 2023, 16: 4819-34. doi：10.2147/ijgm.s431124

[11] 王玉亭, 吴雅婕, 黄玉蓉, 等. 基于METTL3-SFRP4/Wnt/β-catenin通路探讨黄芩清热除痹胶囊改善类风湿性关节炎的机制[J]. 2024(11): 3081-94.

[12] 周婉婉. 黄芩清热除痹胶囊通过FZD8: Wnt/β: catenin信号通路改善类风湿性关节炎的机制研究[D]. 合肥: 安徽中医药大学, 2023.

[13] Peng Y, Huang Y, Li H, et al. Huangqin Qingre Chubi Capsule inhibits rheumatoid arthritis by regulating intestinal flora and improving intestinal barrier[J]. Front Pharmacol, 2024, 15: 1422245. doi：10.3389/fphar.2024.1422245

[14] Wang X, Chang J, Zhou G, et al. The traditional Chinese medicine compound Huangqin Qingre chubi capsule inhibits the pathogenesis of rheumatoid arthritis through the CUL4B/wnt pathway[J]. Front Pharmacol, 2021, 12: 750233. doi：10.3389/fphar.2021.750233

[15] Wang ST, Zeng XX, Gui P, et al. LncRNA EBLN3P facilitates osteosarcoma metastasis by enhancing annexin A3 mRNA stability and recruiting HuR[J]. Ann Surg Oncol, 2023, 30(13): 8690-703. doi：10.1245/s10434-023-14032-y

[16] Sun MX, An HY, Sun YB, et al. LncRNA EBLN3P attributes methotrexate resistance in osteosarcoma cells through miR-200a-3p/O-GlcNAc transferase pathway[J]. J Orthop Surg Res, 2022, 17(1): 557. doi：10.1186/s13018-022-03449-y

[17] Cieśla M, Darmochwał‑Kolarz D, Pałka A, et al. Expression of NEAT1, PACERR, and GAS5 circulating long noncoding RNAs can be associated with disease activity in rheumatoid arthritis patients[J]. Pol Arch Intern Med, 2024, 134(12): 16866. doi：10.20452/pamw.16866

[18] Wang Y, Hou L, Yuan X, et al. LncRNA NEAT1 targets fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis via the miR-410-3p/YY1 axis[J]. Front Immunol, 2020, 11: 1975. doi：10.3389/fimmu.2020.01975

[19] Zhou Q, Liu J, Qi Y, et al. Jianpi Qingre Tongluo prescription alleviates the senescence-associated secretory phenotype with osteoarthritis by regulating STAG1/TP53/P21 signaling pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2025, 337(pt 3): 118953. doi：10.1016/j.jep.2024.118953

[20] Yan Y, Zhang LB, Ma R, et al. Jolkinolide B ameliorates rheumatoid arthritis by regulating the JAK2/STAT3 signaling pathway[J]. Phytomedicine, 2024, 124: 155311. doi：10.1016/j.phymed.2023.155311

[21] Molendijk M, Hazes JM, Lubberts E. From patients with arthralgia, pre-RA and recently diagnosed RA: what is the current status of understanding RA pathogenesis[J]? RMD Open, 2018, 4(1): e000256. doi：10.1136/rmdopen-2016-000256

[22] Mor A, Abramson SB, Pillinger MH. The fibroblast-like synovial cell in rheumatoid arthritis: a key player in inflammation and joint destruction[J]. Clin Immunol, 2005, 115(2): 118-28. doi：10.1016/j.clim.2004.12.009

[23] Masoumi M, Bashiri H, Khorramdelazad H, et al. Destructive roles of fibroblast-like synoviocytes in chronic inflammation and joint damage in rheumatoid arthritis[J]. Inflammation, 2021, 44(2): 466-79. doi：10.1007/s10753-020-01371-1

[24] Giannini D, Antonucci M, Petrelli F, Bilia S, Alunno A, Puxeddu I. One year in review 2020: pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol, 2020, 38(3): 387-97. doi：10.55563/clinexprheumatol/j1l5l3

[25] Chen ZF, Guo X, Wu SM, et al. Huayu Tongbi formula attenuates rheumatoid arthritis by inhibiting the HIF1A/VEGFA/ANGPT axis and suppressing angiogenesis[J]. Phytomedicine, 2025, 139: 156479. doi：10.1016/j.phymed.2025.156479

[26] Aihaiti Y, Song Cai Y, Tuerhong X, et al. Therapeutic effects of naringin in rheumatoid arthritis: network pharmacology and experimental validation[J]. Front Pharmacol, 2021, 12: 672054. doi：10.3389/fphar.2021.672054

[27] Baldini C, Moriconi FR, Galimberti S, Libby P, De Caterina R. The JAK-STAT pathway: an emerging target for cardiovascular disease in rheumatoid arthritis and myeloproliferative neoplasms. Eur Heart J. 2021，42(42):4389-4400. doi：10.1093/eurheartj/ehab447

[28] Bridges MC, Daulagala AC, Kourtidis A. LNCcation: lncRNA localization and function[J]. J Cell Biol, 2021, 220(2): e202009045. doi：10.1083/jcb.202009045

[29] Sun L, Yang K, Wang L, et al. LncRNA MIAT suppresses inflammation in LPS-induced J774A.1 macrophages by promoting autophagy through miR-30a-5p/SOCS1 axi[J]. Sci Rep, 2024, 14(1): 22608. doi：10.1038/s41598-024-73607-1

[30] Selim AM, Elsabagh YA, El-Sawalhi MM, et al. Serum lncRNA ITGB2-AS1 and ICAM-1 as novel biomarkers for rheumatoid arthritis and osteoarthritis diagnosis[J]. BMC Med Genom, 2024, 17(1): 247. doi：10.1186/s12920-024-01993-6

[31] Qiu H, Liu M, Shi X, et al. LncRNA HOTAIR inhibits the progression of fibroblast-like synoviocytes by sponging miRNA-106b-5p in rheumatoid arthritis[J]. Autoimmunity, 2022, 55(8): 567-76. doi：10.1080/08916934.2022.2126460

[32] Zhang Z, Zhang W, Wen QW, et al. Associations of genetic polymorphisms within MALAT1, UCA1, FAM211A-AS1 and AC000111.6 with genetic susceptibility to rheumatoid arthritis. Autoimmunity. 2020，53(7):408-414. doi：10.1080/08916934.2020.1818230

[33] Zhang M, Lu N, Guo XY, et al. Influences of the lncRNA TUG1-miRNA-34a-5p network on fibroblast-like synoviocytes (FLSs) dysfunction in rheumatoid arthritis through targeting the lactate dehydrogenase A (LDHA)[J]. J Clin Lab Anal, 2021, 35(9): e23969. doi：10.1002/jcla.23969

[34] Yang Z, Lin SD, Zhan F, et al. LncRNA GAS5 alleviates rheumatoid arthritis through regulating miR-222-3p/Sirt1 signalling axis[J]. Autoimmunity, 2021, 54(1): 13-22. doi：10.1080/08916934.2020.1846183

[35] Dai S, Li N, Zhou M, et al. LncRNA EBLN3P promotes the progression of osteosarcoma through modifying the miR-224-5p/Rab10 signaling axis[J]. Sci Rep, 2021, 11(1): 1992. doi：10.1038/s41598-021-81641-6

[36] Tang H, Huang H, Guo Z, et al. Heavy ion-responsive lncRNA EBLN3P functions in the radiosensitization of non-small cell lung cancer cells mediated by TNPO1[J]. Cancers: Basel, 2023, 15(2): 511. doi：10.3390/cancers15020511

[37] Xu XH, Song W, Li JH, et al. Long non-coding RNA EBLN3P regulates UHMK1 expression by sponging miR-323a-3p and promotes colorectal cancer progression[J]. Front Med: Lausanne, 2021, 8: 651600. doi：10.3389/fmed.2021.651600

[38] 陈瑞莲, 刘 健, 汪 元, 等. 黄芩清热除痹胶囊对湿热痹阻型类风湿关节炎患者临床疗效观察[J]. 中药药理与临床, 2025, 41(8): 78-81.

[39] 徐昌萍, 曹云祥, 刘 健, 等. 黄芩清热除痹胶囊抑制TLR4/NF-κB信号通路对活动期类风湿关节炎的影响和机制[J]. 中华中医药杂志, 2025, 40(4): 2042-6.

[40] 李 舒, 万 磊, 赵 磊, 等. 黄芩清热除痹胶囊治疗类风湿关节炎临床观察及对血清M1、M2型炎症因子影响[J]. 中药药理与临床, 2022, 38(2): 190-4.

[41] SunMengyu, Yuan Wang, LIU FEIFEI, et al. LncRNA EBLN3P regulates the JAK/STAT signaling pathway through the miR-369-3p/NFIX axis: a potential therapeutic target for synovial revascul-arization in rheumatoid arthritis. Authorea. April 06, 2025. doi: 10.22541/au.174395356.60440021/v1 .

基金资助

安徽省自然科学基金面上项目(2208085MH268)

安徽省高等学校科学研究项目(2023AH050810)

安徽省临床医学研究转化专项项目任务书(202304295107020110)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021