胞葬相关基因UCP2、EGLN3、IL1B对骨关节炎的诊断价值及中药治疗预测：基于生物信息学及机器学习

Identification of efferocytosis-related genes in osteoarthritis and prediction of traditional Chinese medicines based on bioinformatics and machine learning

摘要

目的 基于生物信息学与机器学习法，筛选骨关节炎中与胞葬作用相关的关键基因，探讨其诊断价值、免疫微环境特征及潜在中药治疗靶点。 方法 从GEO数据库获取骨关节炎数据集GSE55235、GSE55457和GSE117999，其中GSE55235作为训练集，GSE55457和GSE117999作为验证集。从GeneCards数据库获取胞葬相关基因集。通过差异表达分析筛选骨关节炎差异基因，并与胞葬基因取交集获得胞葬相关差异基因。对差异基因进行GO和KEGG富集分析。采用随机森林、LASSO回归和SVM三种机器学习算法筛选特征基因，并通过ROC曲线评估其诊断效能。通过qRT-PCR实验在大鼠骨关节炎模型中验证特征基因表达，利用CIBERSORT解析免疫细胞浸润情况，采用GSEA分析特征基因相关通路，运用Coremine数据库预测与特征基因相关的中药。 结果 共筛选出959个OA差异基因，其中15个与胞葬作用相关。GO和KEGG分析显示这些基因主要富集于白细胞迁移、细胞外基质、炎症通路等。机器学习筛选出UCP2、EGLN3和IL1B三个特征基因，其在训练集和验证集中均表现出良好的诊断能力。qRT-PCR显示部分特征基因表达趋势存在差异（P<0.05）。免疫浸润分析显示静止肥大细胞、休眠记忆CD4⁺ T细胞和活化的肥大细胞在骨关节炎患者和健康人群的浸润差异显著（P<0.05）。GSEA提示特征基因与脂肪细胞因子信号通路、硫代谢和剪接体通路密切相关。中药预测获得100味中药，以补虚、清热、活血化瘀类为主，包括枸杞子、淫羊藿、生地黄、苦参、川芎、牛膝等。 结论 胞葬相关基因在骨关节炎发病中起重要作用，UCP2、EGLN3、IL1B基因对骨关节炎具有诊断价值，预测出的枸杞子、淫羊藿、生地黄、苦参、川芎、牛膝等中药可能是防治骨关节炎的潜在药物。

Abstract

Objective To screen key genes related to efferocytosis in osteoarthritis (OA) based on bioinformatics and machine learning methods, and explore their diagnostic value, immune microenvironment characteristics, and potential therapeutic targets of traditional Chinese medicines (TCM). Methods OA-related datasets GSE55235, GSE55457, and GSE117999 were obtained from the GEO database. An efferocytosis-related gene set was retrieved from GeneCards. Differential expression analysis was performed to identify OA-related differentially expressed genes (DEGs) and their intersection with efferocytosis-related genes, followed by GO and KEGG enrichment analyses. Three machine learning algorithms (Random Forest, LASSO regression, and SVM) were used to screen feature genes, and their diagnostic efficacy was evaluated using ROC curves. qRT-PCR was used to validate the feature gene expressions in a rat OA model. Immune cell infiltration was analyzed using CIBERSORT, GSEA was used to explore the related pathways, and the Coremine database was utilized to predict TCMs associated with the feature genes. Results A total of 959 OA-related DEGs were identified, including 15 efferocytosis-related genes, which were enriched in leukocyte migration, extracellular matrix, and inflammatory pathways. Machine learning identified 3 feature genes, namely UCP2, EGLN3, and IL1B, which showed good diagnostic performance in both the training (GSE55235) and validation sets (GSE55457 and GSE117999) and varying expression patterns in the mouse models. Immune infiltration analysis showed significant differences in resting mast cells, resting memory CD4⁺ T cells, and activated mast cells between OA patients and healthy controls. The feature genes were closely associated with the adipocytokine signaling pathway, sulfur metabolism, and spliceosome pathway. A total of 100 TCMs were predicted, which were primarily herbs for tonifying deficiency, clearing heat, and promoting blood circulation, such as Lycium barbarum, Epimedium brevicornu, Rehmannia glutinosa, Sophora flavescens, Ligusticum chuanxiong, and Achyranthes bidentata. Conclusion Efferocytosis-related genes play important roles in OA pathogenesis. UCP2, EGLN3, and IL1B have diagnostic value for OA. The predicted TCMs may serve as potential agents for OA prevention and treatment.

Graphical abstract

关键词

骨关节炎 / 胞葬作用 / 生物信息学 / 机器学习 / 中药预测

Key words

osteoarthritis / efferocytosis / bioinformatics / machine learning / prediction of traditional Chinese medicines

骨关节炎（OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病，以关节软骨的进行性破坏、软骨下骨硬化及骨赘形成为主要病理特征，临床表现为关节疼痛、肿胀和功能障碍，严重影响患者的生活质量^［1］。随着全球人口老龄化加剧，OA的发病率持续攀升，已成为重要的公共卫生问题。目前OA的治疗手段主要包括非甾体抗炎药、镇痛药、物理疗法及手术治疗等，但这些方法多侧重于缓解症状，难以逆转疾病进程，且长期用药常伴随胃肠道、肝肾等不良反应^{［2， 3］}。因此，深入探索OA的发病机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点，具有重要的临床意义。

近年来，胞葬作用作为机体清除凋亡细胞的重要生理过程，在维持组织稳态和免疫调节中的作用日益受到关注。胞葬功能异常可能导致凋亡细胞积累，引发继发性坏死和慢性炎症，进而参与多种疾病包括OA的发生与发展^{［4， 5］}。尽管已有研究提示胞葬功能异常可能与OA相关，但目前针对OA中胞葬相关基因的系统性筛选及其在诊断、免疫微环境调控和中药干预中的潜在价值尚未见深入报道。深入研究胞葬在OA中的作用机制，对于揭示OA的病理过程以及开发新型诊断与治疗方法具有重要意义。

本研究基于生物信息学与机器学习方法，整合GEO数据库中的OA转录组数据与胞葬相关基因集，通过差异表达分析、富集分析、多种机器学习算法筛选关键基因，并结合qRT-PCR实验验证、免疫浸润分析、GSEA通路富集及中药预测，系统揭示胞葬相关基因在OA中的作用机制及其中药干预潜力。

1 材料和方法

1.1 数据获取

通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基因表达数据库（GEO）检索与OA相关的数据集，筛选标准为OA患者样本和健康人群样本，排除动物系模型，最终下载符合要求的数据集GSE55235、GSE55457和GSE117999。GSE55235用作训练集，测序平台为GPL96，包括20例样本，其中10例OA患者样本，10例健康人群样本。GSE55457和GSE117999用作验证集，测序平台分别为GPL96和GPL20844。GSE55457包括20例样本，其中10例OA患者样本、10例健康人群样本；GSE117999包括24例样本，其中12例OA患者样本，12例健康人群样本（表1）。通过GeneCards数据库获取并整理与胞葬相关的基因集，获得胞葬相关基因149个。

1.2 实验动物

12周龄雄性SD大鼠6只，体质量300±20 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供［（许可证号：SCXK（辽）2020-0001）］。所有动物饲养于广西中医药大学实验动物中心的SPF级动物房内，实验操作环境符合屏障系统标准，室内温度维持在22~24 ℃，相对湿度控制在50%~60%，保持12 h明暗循环。动物自由摄食饮水，适应性饲养1周后用于实验。采用随机数字表法将大鼠分为正常组和模型组，3只/组。模型组通过前交叉韧带横断术联合内侧半月板切除术建立膝骨关节炎模型，正常组仅打开关节腔后缝合。于造模后第6周采用安乐死方式处死大鼠，取大鼠膝关节后投入液氮再转入-80 ℃冰箱保存，后续取膝关节软骨组织进行检测。本研究所有动物实验程序均严格遵守中国实验动物使用与管理规范，并经广西中医药大学实验动物伦理审查委员会批准（伦理批号：DW20230830-169）。

1.3 数据差异分析

利用R软件中的Limma包对GSE55235样本数据集进行差异表达分析，将筛选标准设定为|log2foldchange（FC）|>1以及P<0.05。通过热图和火山图可视化展示差异表达分析结果。将满足筛选条件的差异基因与胞葬基因集进行交集运算，以获取与胞葬相关的差异基因，并绘制韦恩图。

1.4 GO、KEGG分析

为揭示OA差异基因潜在的生物学功能和潜在机制，使用R软件clusterProfiler包对OA差异基因进行了基因本体（GO）和京都基因和基因百科全书（KEGG）富集分析。其中GO分析主要包括生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3大部分。

1.5 筛选特征基因

为从OA胞葬相关差异基因中筛选出关键的特征基因，本研究分别采用随机森林（RF）、LASSO回归以及支持向量机（SVM）3种机器学习算法。RF模型首先生成100棵决策树，通过计算袋外误差确定最优树数目，以基尼系数作为特征重要性度量，保留重要性得分大于1的基因。LASSO回归采用五折交叉验证确定最优惩罚系数λ，并选择使交叉验证误差最小的λ值下系数非零的基因。SVM分析采用基于递归特征消除的SVM-RFE算法，通过五折交叉验证评估特征子集的分类性能。最终，将3种算法分别筛选出的基因列表取交集，获得一组共识的特征基因用于后续分析。

1.6 特征基因验证与模型性能评估

为全面评估特征基因的诊断价值，本研究采用多维度性能指标对模型进行分类性能评估。首先，在训练集和验证集上分别计算受试者工作特征曲线下面积 （AUC），以评估特征基因组合的整体判别能力。同时，为更全面反映模型分类性能，计算准确率、精确率、召回率和F1分数。此外，通过绘制箱型图比较筛选出的特征基因在健康人群与OA患者之间的表达水平差异，从表达层面验证特征基因的生物学意义。

1.7 qRT-PCR验证

使用RNA提取液（Servicebio）提取大鼠膝关节软骨总RNA，使用逆转录试剂盒（Servicebio）将RNA逆转录为cDNA。设计并合成针对特征基因及OA相关标志物基因MMP13、COL2A1的特异性引物，以GAPDH作为内参基因，引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成（表2）。采用SYBR Green荧光定量PCR方法进行扩增反应。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、SYBR Green荧光染料（Servicebio）、PCR缓冲液等，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为95 ℃预变性30 s，随后进行40个循环的扩增反应，每个循环包括95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s。通过分析扩增曲线和熔解曲线评估扩增特异性，并采用2^-ΔΔCt法计算特征基因以及MMP13和COL2A1在模型组和正常组中的相对表达量，进一步确定这些关键基因在两组间表达差异的可靠性。

1.8 免疫浸润分析

免疫浸润分析在疾病病程和治疗效果的预测中具有重要作用^［7］。为具体评估OA样本中免疫细胞的浸润情况，运用R软件中的CIBERSORT包，采用CIBERSORT反卷积算法对OA表达矩阵进行免疫浸润分析。该方法基于基因表达谱数据，能够精确地识别和定量22种不同的免疫细胞亚型。所得结果使用ggplot2包进行可视化，以直观展示免疫细胞在不同样本中的浸润情况。最后对特征基因与22种免疫细胞进行相关性分析，以了解特征基因在OA免疫微环境的潜在联系，同时将分析的结果通过热图进行可视化展示。

1.9 基因集富集（GSEA）分析

为深入探究OA中胞葬作用相关的特征基因所参与的生物通路和功能，本研究采用GSEA方法，将筛选出的特征基因高表达和低表达情况进行GSEA分析。

1.10 中药预测

采用Coremine数据库（https：//www.coremine.com/medical）对与胞葬相关基因治疗OA的潜在中药进行预测。通过生物信息学及机器学习方法分析确定特征基因，后利用Coremine数据库筛选与之相关的中药。筛选的中药参照《中国药典》和《中华本草》进行规范化处理，删除未收录的中药，并对处理后的中药进行性味、归经及功效信息查询。

1.11 统计学分析

所有数据采用GraphPad Prism 10.1.2软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示。两组间比较采用非配对t检验或Mann-Whitney U检验；多组间比较采用单因素方差分析及相应的多重比较检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据差异分析结果

对数据集GSE55235进行数据差异表达分析，共找出959个差异基因，其中526个为表达上调基因，433个为表达下调基因，数据用热图及火山图进行可视化展示（图1A、B）。将差异基因与胞葬基因集取交集后获得15个胞葬相关差异基因（图1C），并将其在火山图上进行可视化展示（图1B）。

2.2 GO、KEGG分析结果

GO富集分析显示，在BP部分，这些基因主要富集在白细胞迁移、白细胞黏附、白细胞趋化反应等生物学过程；在CC部分，这些基因主要富集在含胶原蛋白的细胞外基质、内质网内腔、胞吞泡等细胞组分；在MF部分，这些基因主要富集在糖胺聚糖结合、细胞外基质结构组成、肝素结合等分子功能（图2A）。KEGG富集分析显示，OA差异基因主要与类风湿性关节炎、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素17信号通路等相关（图2B）。

2.3 特征基因筛选结果

通过3种机器学习算法筛选特征基因，RF分析结果以重要性得分大于1共获得3个基因（图3A、B）；LASSO回归筛选出7个基因（图3C、D）；SVM筛选出15个基因（图3E、F）。3种机器学习算法筛选出的基因进行取交集处理，共得到3个特征基因（图3G），分别是UCP2、EGLN3、IL1B。

2.4 特征基因验证与模型性能评估

基于UCP2、EGLN3和IL1B三个特征基因构建的诊断模型在训练集和验证集中均表现出良好的诊断性能。在训练集中，模型准确率为1.000，精确率为1.000，召回率为1.000，F1分数为1.000，ROC曲线下面积为1.000（表3，图4A~C）；在外部验证集GSE55457中，模型准确率为0.850，精确率为0.818，召回率为0.900，F1分数为0.857，ROC曲线下面积为0.900（表3，图4D~F）；在外部验证集GSE117999中，模型准确率为0.850，精确率为0.818，召回率为0.900，F1分数为0.857，ROC曲线下面积为0.910（表3，图4G~I）。3个特征基因在OA患者与健康人群中的差异表达分析显示，OA患者中UCP2的表达水平高于健康人群，而EGLN3、IL1B的表达水平低于健康人群（图4J~L）。

2.5 qRT-PCR验证结果

qRT-PCR检测结果显示，模型组中UCP2、EGLN3、IL1B、MMP13基因的mRNA表达水平均高于正常组，而COL2A1基因的mRNA表达水平低于正常组（P<0.001，图5）。EGLN3和IL1B基因在qRT-PCR验证中的表达趋势与生物信息学分析中的表达趋势不一致。

Fig.5 qRT-PCR validation results of the key genes. The figure shows the relative mRNA expression levels of the genes in rat knee joint cartilage detected by qRT-PCR in the normal group and OA model group. A: UCP2; B: EGLN3; C: IL1B; D: MMP13; E: COL2A1.***P<0.001, ****P<0.0001.

2.6 免疫浸润分析结果

免疫浸润分析结果显示，OA患者样本与健康人群样本之间有5种免疫细胞存在显著差异。其中浆细胞、滤泡辅助性T细胞、静止肥大细胞在OA患者样本中浸润水平升高；休眠记忆CD4⁺T细胞、活化的肥大细胞在OA患者样本中浸润水平降低（P<0.001，图6A、B）。对特征基因与22种免疫细胞进行相关性分析发现，UCP2与静止肥大细胞、浆细胞等呈正相关，与活化的肥大细胞、休眠记忆CD4⁺T细胞等呈负相关；EGLN3与活化的肥大细胞、初始B细胞等呈正相关，与静止肥大细胞、未极化巨噬细胞等呈负相关；IL1B与活化的肥大细胞、休眠记忆CD4⁺T细胞等呈正相关，与静止肥大细胞、未极化巨噬细胞等呈负相关（图6C）。

2.7 特征基因GSEA分析结果

将特征基因进行GSEA富集分析。UCP2的分析结果显示，其高表达主要富集在硫代谢、其他聚糖降解和O-糖链生物合成等，低表达主要富集在剪接体、氨基酸-tRNA生物合成和核糖体等（图7A）；EGLN3的分析结果显示，其高表达主要富集在膀胱癌、脂肪细胞因子信号通路和JAK-STAT信号通路等，低表达主要富集在其他聚糖降解、失配修正和氧化磷酸化等（图7B）；IL1B的分析结果显示，其高表达主要富集在哺乳动物昼夜节律、剪接体和脂肪细胞因子信号通路等，低表达主要富集在硫代谢、其他聚糖降解和溶酶体等（图7C）。

2.8 中药预测结果

经筛选后共获得100味中药，这些中药的四气以寒、温为主，五味以苦、甘、辛为主，归经以肝、肺、肾为主，功效以补虚、清热、活血化瘀为主（表4、图8）。

3 讨论

OA作为一种常见的退行性关节疾病，其发病机制复杂，涉及炎症反应、细胞凋亡、细胞外基质降解及免疫微环境紊乱等多个方面。近年来，胞葬作用作为清除凋亡细胞、维持组织稳态的关键过程，在OA中的作用逐渐受到关注。本研究结合生物信息学与机器学习方法，筛选出与OA胞葬作用相关的关键基因UCP2、EGLN3和IL1B，并对其诊断价值、免疫微环境特征及潜在中药干预靶点进行了系统分析。

本研究对OA基因进行差异分析后共得出959个OA差异基因，将其与胞葬基因取交集后共得到15个胞葬相关差异基因。通过对OA差异基因进行GO富集分析发现，在BP部分，这些基因主要富集在白细胞迁移、白细胞黏附、白细胞趋化反应等生物学过程。这些过程都与慢性炎症反应有关，也正是OA的重要特征^［6］。白细胞迁移是炎症反应过程中的重要环节，当身体发生炎症时，白细胞会被迁移到炎症部位^［7］，研究发现正向调控白细胞迁移的趋化因子在OA中扮演了重要角色^［8］。白细胞粘附在OA等慢性炎症性疾病的发展和持续中起着重要作用，研究发现，ELAM-1、VCAM-1和ICAM-1可能参与介导白细胞进入OA和类风湿性关节炎患者的滑膜^［9］，且ICAM-1已被认为是导致病变关节内组织粘连，关节活动僵硬的主要因素之一^［10］。白细胞趋化反应是白细胞在化学信号物质的引导下，向着炎症部位迁移的现象。CX3CL1是一种独特的趋化因子，其结合了趋化和粘附分子的特性，CX3CL1/CX3CR1信号转导在OA病理生理中非常重要，并且CX3CL1很可能被作为确定OA严重程度或监测治疗效果的有用标记物^［11］。在CC部分，这些基因主要富集在含胶原蛋白的细胞外基质、内质网内腔、胞吞泡等细胞组分，提示OA的发病机制与细胞外基质降解重塑以及细胞内应激反应等密切相关。在MF部分，这些基因主要富集在糖胺聚糖结合、细胞外基质结构组成、肝素结合等分子功能。软骨细胞分化和软骨内成骨障碍是骨骼发生疾病的主要潜在因素，糖胺聚糖是软骨细胞外基质的重要组成部分，其参与介导Wnt、TGF-β、FGF、Ih-PTHrP和O-GlcNAc糖基化等途径，与转录因子SOX9、BMPs、TGF-β和Runx2相互作用，调节软骨细胞分化和软骨内成骨^［12］。KEGG富集分析显示OA差异基因主要与类风湿性关节炎、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素17信号通路等相关。类风湿性关节炎和OA虽然都是常见的慢性关节疾病，但它们的发病机制有所不同。然而，在临床表现和分子基础方面，两者之间却存在一定的相似性^［13］，且两者均表现为关节疼痛、功能障碍、关节间隙变窄等特征^［14］。其次，在OA的病理过程中，肿瘤坏死因子信号通路可以通过影响JNK蛋白激酶的激活以及半胱天冬酶家族介导的细胞凋亡，加剧OA的病理性改变^［15］。白细胞介素17作为促炎因子，在类风湿性关节炎中研究较为深入。近年来研究发现，其在OA患者的血液和滑膜组织中也高表达^［16］。这表明，白细胞介素17信号通路在类风湿性关节炎和OA的发病机制上具有一定的相似性，尤其在炎症因子的作用上。通过这些研究，为深入探讨OA的发病机制及治疗策略提供了重要线索。未来研究可在此基础上，进一步探讨这些通路在OA中的作用机制，以期寻找更有效的治疗手段。

本研究通过机器学习方法筛选出3个具有诊断潜力的基因UCP2、EGLN3和IL1B，并在训练集和外部验证集中均表现出良好的诊断性能。值得注意的是，本研究的训练集（GSE55235）与外部验证集（GSE117999）之间存在批次效应的技术性差异。这种由不同实验平台和流程引入的系统偏差，是导致生物信息学模型在独立数据集中性能出现合理波动的常见原因之一。为评估本研究所筛选特征基因在未经校正的真实异质数据环境下的诊断稳健性，特未进行跨数据集的批次效应校正，以此模拟其在未来临床转化中可能遇到的实际场景。UCP2作为线粒体解耦蛋白，其能通过减少活性氧的产生来改善线粒体功能^［17］，并在吞噬细胞中，通过调控能量代谢对凋亡细胞的持续清除过程起到关键支持作用^［18］，提示其在OA中可能通过调控胞葬作用影响疾病进展。其次，EGLN3（也称为PHD3）在调节关节软骨细胞代谢方面具有重要意义。EGLN3能够通过调节HIF-1α的稳定性来影响软骨细胞的存活。HIF-1α在软骨细胞存活中起重要作用，其介导的线粒体自噬有助于缓解OA^{［19， 20］}。氧气充足的条件下，EGLN3能够羟基化HIF-1α亚基以泛素化降解^［21］。研究发现，EGLN3的失活可能会影响巨噬细胞的迁移、胞葬作用和M2型巨噬细胞极化，进而影响免疫应答和炎症过程^{［22， 23］}。最后，IL1B作为促炎细胞因子之一，与炎症性疼痛高度相关^［24］。IL1B在OA中起关键介质作用，是OA的关键介质，常用于模拟体外病理条件^［25］。IL1B刺激的OA软骨细胞表现出活性氧过量产生、MMP崩溃、受损线粒体积累和细胞凋亡增加^［26］。此外，研究发现，IL1B与OA中的免疫募集、调节和巨噬细胞激活密切相关，被确定为重要基因^［27］。

本研究通过qRT-PCR实验验证了特征基因在大鼠OA模型中的表达，MMP13和COL2A1基因的表达趋势证明了模型构建的成功^［28］。然而，EGLN3和IL1B的表达趋势与生物信息学分析结果存在差异。在GSE55235数据集中，OA患者滑膜组织中EGLN3和IL1B的表达水平显著低于健康人群，而在大鼠OA模型中，两者的mRNA表达水平却显著升高。这种矛盾现象可能由多种因素共同导致。生物信息学分析所采用的人类样本来源于接受关节置换术的终末期OA患者滑膜组织，其病理状态处于慢性炎症耗竭阶段，而大鼠OA模型在造模后第6周取材可能更代表疾病的早中期活跃炎症阶段。疾病发展阶段的异质性可能是导致基因表达趋势不一致的重要原因。基于以上分析，我们推测晚期OA滑膜微环境可能已从活跃炎症期转入炎症耗竭状态，这解释了IL1B在人类终末期样本中表达降低的现象，同时EGLN3作为缺氧与代谢调节基因，其表达也可能随疾病阶段发生动态变化。因此，EGLN3和IL1B在OA中的表达可能具有明显的阶段特异性，未来研究需要结合多时间点、多组织来源的样本进一步阐明其在OA自然病程中的时空表达规律。综上所述，本研究筛选的特征基因不仅为OA诊断提供了潜在标志物，也揭示了OA疾病进程中的动态分子变化。UCP2可能作为OA治疗的稳定靶点，而EGLN3和IL1B则需结合疾病分期进行针对性干预。

本研究通过免疫浸润分析发现，OA患者滑膜组织中浆细胞、滤泡辅助性T细胞及静止肥大细胞浸润水平显著升高，而休眠记忆CD4⁺ T细胞与活化肥大细胞浸润水平显著降低，其中肥大细胞亚群与休眠记忆CD4⁺ T细胞的差异尤为显著。肥大细胞作为滑膜组织中的重要免疫细胞，通常通过释放组胺、类胰蛋白酶及TNF-α等炎症介质参与OA的炎症反应进程^［29］。然而，本研究中观察到的静止肥大细胞增多与活化肥大细胞减少的现象，与典型炎症状态下肥大细胞的广泛活化特征不符，推测其反映了终末期OA独特的免疫微环境状态。在OA早期阶段，肥大细胞被激活并参与炎症启动；随着疾病慢性进展，持续的组织损伤刺激可能导致其活化能力衰竭，转而呈现静止表型，标志着疾病由急性炎症阶段向慢性炎症状态的转变^{［30， 31］}。肥大细胞功能状态的变化与胞葬过程密切相关，其分泌的TNF-α、IL-8等细胞因子能够影响巨噬细胞的募集与极化，进而调控胞葬效率^{［32， 33］}。本研究同时发现IL1B表达下调与肥大细胞活化状态的改变并存，提示终末期OA中免疫细胞功能紊乱可能伴随胞葬清除能力受损，导致凋亡细胞积累与继发性坏死，从而维持慢性炎症微环境^［34］。此外，休眠记忆CD4⁺ T细胞的浸润减少进一步表明终末期OA中存在T细胞免疫功能失调，可能与持续抗原刺激导致的免疫应答衰竭有关^［35］。综上所述，终末期OA滑膜组织呈现以静止肥大细胞增多、活化肥大细胞与记忆T细胞减少为特征的免疫微环境模式，体现了OA疾病进程中免疫应答的阶段特异性变化。后续研究应当深入探索不同疾病阶段免疫细胞亚群的动态变化规律，并评估通过调控肥大细胞活化状态以改善胞葬功能、促进炎症消退的潜在治疗价值。

本研究后续对3个特征基因进行了GSEA分析，以探讨它们在OA治疗中的潜在作用。通过GSEA分析发现这3个特征基因主要与脂肪细胞因子信号通路、硫代谢以及剪接体等通路密切相关。肥胖是OA患者面临的最有影响力和可改变的风险因素之一。脂肪细胞因子，如脂联素和瘦素，已被证明可以调节软骨中的炎症免疫反应^［36］。临床数据也表明，患有膝关节炎的老年女性滑膜脂肪因子水平与OA活性指数呈正相关^［37］。硫代谢是生物体内硫元素的转化和利用过程，近年来研究发现，硫代谢受损可能在OA的发病机制中发挥重要作用^［38］。小核仁RNA（SnoRNA）通过直接对RNA底物进行化学修饰，微调剪接体和rRNA功能，以适应健康和疾病期间剪接和蛋白质合成不断变化的要求。SnoRNA可能影响软骨细胞的代谢和功能，其在OA中的具体作用尚不完全清楚，需要继续探索^［39］。此外，CLKs属于双特异性蛋白激酶家族，在调节转录物剪接、催化剪接体分子机制以及调节非剪接蛋白的活性或表达中发挥关键作用。CLKs的不规则剪接或表达涉及多种人类疾病，其中就包括OA^［40］。

OA属于中医学“痹症”范畴，其基本病机为本虚标实，以肝肾亏虚为本，风寒湿瘀为标^［41］。本研究基于胞葬相关特征基因预测出100味潜在中药，其药性以寒、温为主，药味以苦、甘、辛为主，归经以肝、肺、肾为主，功效以补虚、清热、活血化瘀为主，与OA病机高度吻合，体现了中药多成分、多靶点的治疗优势。中老年OA患者多表现为肝肾亏虚、精血不足，本研究预测的补虚药物主要有枸杞子、淫羊藿等。枸杞子有滋补肝肾、益精明目的功效。枸杞子中枸杞多糖的含量较高，其具备抗氧化、降血糖、免疫调节等生物活性，且能够降低OA软骨细胞炎性细胞因子水平，抑制NF-κB信号通路，从而改善OA损伤^{［42， 43］}，还可抑制OA中CD151和基质金属蛋白酶3的高表达，从而减缓OA的发生^［44］。淫羊藿有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，在临床上常被用于治疗关节痹痛、筋骨微软等症，其中淫羊藿苷是从中药淫羊藿中分离出的中药单体，研究发现，淫羊藿苷通过抑制NF-κB来激活自噬，进而抑制炎性细胞因子并减少细胞凋亡，从而对OA起到保护作用^［45］，并且淫羊藿苷通过调节TDP-43信号通路抑制软骨细胞凋亡和血管生成，从而对OA起到保护作用^［46］。本研究预测的清热药物主要有生地黄、苦参等。生地黄有清热凉血，养阴生津的功效。地黄梓醇是从地黄中提取的主要活性成分，具有多种药理作用，包括抗细胞凋亡、抗炎等药理作用，且能降低白细胞介素-1β诱导的软骨细胞基质分解代谢、细胞凋亡和炎症反应，抑制软骨退变^{［47， 48］}。苦参有清热燥湿、杀虫止痒，利尿的功效。苦参提取物苦参碱可能有益于OA的治疗，其能通过抑制人软骨细胞中MAPK和NF-κB的激活来抑制IL-1β诱导的基质金属蛋白酶的表达^［49］，苦参的另一种生物碱槐果碱可抑制PI3K/AKT/NF-κB信号传导途径，降低NO、前列腺素E2、环氧合酶-2、iNOS等多种促炎因子的含量，进而保护骨关节^［50］。本研究预测的活血化瘀药物主要有川芎、牛膝等。川芎有活血行气，祛风止痛的功效。川芎提取物川芎嗪具有扩张血管、改善组织微循环的作用，可用于治疗OA^［51］，且川芎嗪能抑制关节软骨内血管新生，对OA起到保护作用，还能够促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达量增加，加速软骨的修复进程^{［52， 53］}。牛膝有逐瘀通经，补肝肾，强筋骨的功效。牛膝提取物中的牛膝总皂苷能够使炎症因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的水平降低，进而减轻炎症并对软骨起到保护作用^{［54， 55］}。牛膝总皂苷可通过对HIF-1α信号通路产生影响，有效地提升细胞活力，促进软骨细胞增殖^［56］。此外，牛膝提取物槲皮素可通过减弱氧化应激反应和抑制软骨细胞外基质的降解，上调超氧化物歧化酶和金属蛋白酶-1组织抑制因子，下调基质金属蛋白酶-13，改善OA的退化情况^［57］。

综上所述，本研究聚焦于OA与胞葬相关的特征基因进行分析，为深入理解OA的发病机制、寻找有效的诊断标志物和治疗方案提供了参考。但研究仅为初步探索，未来还需开展更多的实验和临床研究，以验证这些基因在OA诊断中的稳定性和准确性。在中药预测方面，虽然预测的中药在理论上符合OA的中医病机，但在实际临床应用中，这些药物的具体疗效和最佳使用方案还需要进一步通过严格设计的临床试验来确定，包括药物剂量、使用疗程以及不同药物组合的疗效对比等。

本研究通过生物信息学与机器学习方法筛选出OA中与胞葬作用相关的特征基因，并对其诊断价值及中药干预潜力进行了初步探讨，但研究仍存在局限性。首先，研究所用转录组数据全部来自公共数据库，样本规模有限且均为横断面数据，难以反映特征基因在疾病发展过程中的动态变化。其次，尽管机器学习模型在内部和外部验证中表现出较好的判别能力，但其临床应用价值仍需通过前瞻性及大样本的独立队列研究加以验证。第三，虽然在大鼠模型中进行了qRT-PCR验证，但EGLN3和IL1B基因的表达趋势与生物信息学分析结果不一致，提示物种差异、疾病阶段或组织特异性可能影响基因表达，后续需要在更多物种及不同病理分期的临床样本中进行验证。最后，基于数据库预测的中药及其功效虽然符合OA的中医病机理论，但其具体药理作用、活性成分及作用机制尚需通过系统的体内外实验进行验证。后续研究应建立多中心、纵向随访的临床样本库，结合功能实验深入探讨特征基因的调控机制，并评估中药干预的有效性与安全性。

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