叶酸补充有效改善高盐饮食诱发的小鼠肾脏纤维化病理进程

Folic acid supplementation alleviates high-salt diet-induced renal fibrosis in mice

摘要

目的 探讨2周叶酸对8%高盐饮食（HS）诱导肾脏纤维化的保护作用。 方法 将28只小鼠随机分为对照组（AIN-93G饲料）、高盐组（HS组，含8%NaCl的AIN-93G饲料）、低剂量叶酸组（LFA组，含8%NaCl的AIN-93G饲料+灌胃FA 0.56 mg·kg^-1·d^-1）和高剂量叶酸组（HFA组，含8%NaCl的AIN-93G饲料+灌胃FA 5.6 mg·kg^-1·d^-1），7只/组。记录小鼠体质量、摄食量、饮水量、尾动脉收缩压和心率变化。测定血清肌酐（SCr）和炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平。采用HE、PAS、Masson和天狼星红染色观察肾脏组织学变化。检测Kim1，Vimentin，αSma及Ecadherin的mRNA表达及E-cadherin、Vimentin和α-SMA的蛋白表达。 结果 与HS组相比，叶酸干预降低小鼠饮水量（P<0.05）。叶酸干预可降低HS组小鼠尾动脉收缩压、心率及肾脏指数与血清SCr水平（均P<0.05）。叶酸干预降低HS小鼠血清TNF-α，且降低IL-1β、IL-6水平（均P<0.05）。Masson和天狼星红染色显示，HS+LFA组的肾小球和肾间质纤维化指数均下降（P<0.05），HS+HFA组纤维化指数下降（P<0.05）。免疫组化结果显示，叶酸干预增加HS小鼠肾脏组织中E-cadherin蛋白表达并抑制Vimentin的蛋白表达（均P<0.05）。低、高剂量的叶酸均可抑制HS所诱发肾脏纤维化相关标志物（Vimentin，Kim1和αSma）的mRNA和蛋白表达（均P<0.05），减少间质纤维组织堆积，改善肾脏组织纤维化的发生。叶酸干预同时可上调Ecadherin 的mRNA表达参与缓解肾脏纤维化的发生。 结论 叶酸干预能够改善高盐饮食小鼠肾脏中炎症反应，延缓肾脏纤维化病变。低剂量叶酸的作用效果优于高剂量叶酸，其保护机制可能与调控Ecadherin，Kim1，Vimentin和αSma 的表达有关。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of 2-week dietary folic acid (FA) supplementation against renal fibrosis induced by high-salt (HS) diet in mice. Methods Twenty-eight mice were randomly divided into control, HS (8% NaCl) diet group, HS+low-dose FA (FA: 0.56 mg/kg) group and HS+high-dose FA (5.6 mg/kg) group. The changes in body weight, food intake, water consumption, tail artery systolic pressure, and heart rate of the mice were monitored, and serum levels of creatinine (SCr) and inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, and TNF-α) were measured. Renal histopathology of the mice was assessed using HE, periodic acid-Schiff (PAS), Masson, and Sirius red staining. Renal expressions of Kim1, vimentin, α-Sma, and E-cadherin mRNAs and E-cadherin, vimentin, and α‑SMA proteins were detected using RT-qPCR and immunohistochemistry. Results In mice feeding a HS diet, FA supplementation significantly reduced their water intake, lowered tail artery systolic pressure, heart rate, renal index and serum SCr levels, reducing also serum levels of TNF‑α , IL-1β, and IL-6. Masson and Sirius red staining revealed markedly reduced glomerular and interstitial fibrosis indices in HS+low-dose FA group, while the mice in HS+high-dose FA group showed mixed fibrotic improvements. Immunohistochemical results demonstrated that FA significantly upregulated E-cadherin protein expression and suppressed vimentin expression in renal tissues. Both FA doses inhibited HS-induced mRNA and protein expressions of fibrosis markers (Vimentin, Kim1 and α-Sma), attenuated interstitial collagen deposition, and alleviated renal fibrosis. FA also upregulated renal E-cadherin mRNA expression, contributing to fibrosis mitigation. Conclusion FA intervention ameliorates renal inflammation and delays fibrosis progression in HS-fed mice. Low-dose FA supplementation produces better protective effect than high-dose FA, likely mediated by regulation of renal E-cadherin, Kim1, vimentin, and α-Sma expressions.

Graphical abstract

关键词

短期高盐 / 肾脏损伤 / 叶酸干预 / 肾脏纤维化

Key words

short-term high salt / renal damage / folic acid intervention / renal fibrosis

近年来，我国高血压、冠心病等心血管疾病的患病率呈逐年上升趋势^［1］。高盐饮食是造成我国居民疾病负担最重要的膳食危险因素之一，也是诱发高血压的重要危险因素^［2］。目前世界上大多数国家的食盐摄入量为9~12 g/d，而我国居民的平均食盐摄入量约为11.1 g/d，明显高于WHO建议水平（<5 g/d）^［3，4］。高盐饮食会引发肾脏纤维化，慢性肾脏病（CKD）并最终导致终末期肾病，严重威胁患者生命健康^［5，6］。

叶酸（FA）是一种水溶性B族维生素，存在于动、植物性食品中^［7］，具有很强的清除活性氧自由基能力，可通过抑制氧化应激保护肝、肾组织免受乙酰氨基酚引发的过氧化损伤^［8］。FA还具有抗炎、肠道调节等功效^［9-12］，能够调控同型半胱氨酸型（Hcy）高血压引起的心、脑、肾血管疾病，并改善上述疾病的应激状态^［13］。研究发现，一些营养物质如乳果糖可以缓解长期高盐饮食所诱发的小鼠高血压^［14］。补充FA能够预防高盐饮食地区人群脑血栓的复发^［15］。然而，对于FA是否能够预防高盐饮食引起的非高血压型肾损伤，且膳食中添加FA能否防治高盐饮食所引发的肾脏损伤未见报道。本研究拟通过观察在短期摄入高盐的情况下同时摄入FA，探讨FA干预对短期高盐饮食小鼠肾脏损伤的影响，并进一步分析不同剂量FA干预对短期高盐饮食小鼠模型肾脏损伤的影响及分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

健康SPF级C57BL/6J小鼠28只，雄性、4周龄、体质量17~20 g［湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004］，饲养于桂林医科大学公共卫生学院SPF级动物房（单位许可证号：SYXK（桂）2020-0005）。

AIN-93G标准饲料及8%高盐饲料（AIN-93G基准，南通特洛菲）；FA（上海毕得医药）；Masson染色试剂盒（南京森贝伽）；PAS染色试剂盒（北京索莱宝）；TNF-α、IL-1β和IL-6试剂盒（江苏科特）；肌酐试剂盒（南京建成）；cDNA逆转录试剂盒、波形蛋白（Vimentin），β-actin抗体（上海碧云天）；TRIzol试剂（赛默飞）；抗体Kim-1、E-cadherin和α‑SMA（武汉塞维尔）；Kim-1、E-cadherin、Vimentin和α-SMA引物（武汉金开端合成）。Allegra64R高速冷冻离心机（Beckman Coulter）；Eppendorf 5424R型冷冻离心机（Eppendorf）；Leica DM4B显微镜（徕卡）；BP-300A无创全自动大小鼠血压测量系统（成都泰盟）；ELx808酶标仪（Bio Tek）；KZ-Ⅱ高速组织研磨仪（武汉塞维尔）。

1.2 实验分组及干预方案

小鼠适应性喂养7 d，随机分为对照组（AIN-93G饲料）、高盐组（HS组，含8%NaCl的AIN-93G饲料）、低剂量叶酸组（LFA组，含8%NaCl的AIN-93G饲料+灌胃FA 0.56 mg·kg^-1·d^-1）和高剂量叶酸组（HFA组，含8%NaCl的AIN-93G饲料+灌胃FA 5.6 mg·kg^-1·d^-1），7只/组。高盐饲料构成参考文献［16］，叶酸给药剂量参考文献［17，18］。对照组、高盐组和叶酸组均用等量超纯水灌胃，共干预2周。实验期间小鼠自由饮水、进食，每隔2 d测量并记录小鼠摄食量、饮水量和体质量。本研究动物实验方案已通过桂林医科大学动物伦理委员会审查批准（伦理批号：GLMC-IACUC-20251042）。

1.3 尾动脉收缩压的测量

按照BP-300A全自动大小鼠无创血压测量系统使用说明测量实验动物尾动脉收缩压。实验前及实验第1、2周测量，每只小鼠间隔1 min测量5次，取平均值作为小鼠尾动脉收缩压。

1.4 血清采集与生化指标的测定

2周实验结束后，各组小鼠禁食不禁水24 h，测量小鼠体质量后，肌肉注射舒泰50溶液（50 mg/kg）麻醉小鼠，取其腹主动脉血收集到不含热原和内毒素的离心管中，静置30 min后3000 r/min离心10 min，制备血清，-80 ℃低温保存。参考试剂盒说明检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和肌酐水平。

1.5 肾脏组织的病理学观察

1.5.1 苏木精-伊红（HE）染色

肾组织常规脱蜡至水，苏木素染核5~6 min，流水冲洗30 s，1%盐酸酒精分化2 s，冲洗后，伊红染液染30 s，流水冲洗后，常规脱水，中性树胶封片，Leica DM4B显微镜采集图像。

1.5.2 过碘酸希夫（PAS）染色

肾组织常规脱蜡至水，氧化剂处理6 min，冲洗2 min，Schiff 试剂避光浸染15 min，冲洗后，苏木素染核1 min，酸性分化3 s，流水冲洗10 min后，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，Leica DM4B显微镜观察组织形态并采集图像。

1.5.3 Masson染色

参照文献［16］方法，常规脱蜡，苏木素染核5 min，流水冲洗10 min，1%酸性丽春红液初染5 min，1%磷钼酸分化5~10 s后，2%亮绿染液复染6~8 min，流水冲洗10 min后，酒精脱水，二甲苯透明，封片后，Leica DM4B显微镜采集图像，ImageJ软件对胶原纤维面积进行半定量分析，观察肾脏纤维化程度及胶原沉积特征。

1.5.4 天狼猩红染色

肾脏组织常规脱水，苏木素浸染7 min，漂洗10 s，流水冲洗返蓝6 min，滴加天狼猩红液染色15 min，流水冲洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片后，使用Leica DM4B显微镜采集图像，ImageJ软件半定量分析。

1.6 免疫组织化学分析

肾脏组织切片经二甲苯脱蜡，酒精梯度依次洗脱，37 ℃条件下，3%H₂O₂孵育20 min，修复抗原后，5%山羊血清配置一抗覆盖组织（E-cadherin 1∶100，Vimentin 1∶100），4 ℃湿盒过夜，二抗孵育（1∶2000）37 ℃，30 min及梯度酒精洗脱，二甲苯透明，封片^［16］。使用Leica DM4B显微镜采集图像，ImageJ软件定量分析，组织黄色区域为阳性特征。

1.7 实时荧光定量PCR分析（RT-qPCR）

参照课题组前期方法^［19］，RT-qPCR法分析目标基因（Ecadherin，Vimentin，αSma及Kim1）的mRNA表达水平，引物序列见表1。Gapdh水平用于内参标准化，用2^-ΔΔCT方法将其进行相对定量处理。

1.8 组织蛋白提取与Western blotting分析

取各组小鼠肾脏组织（20 mg）放入EP管中，加入裂解液250 μL，充分研磨，12 000 r/min离心5 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度。室温下经6%或10% SDS-PAGE凝胶电泳后，电转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗膜3次（10 min/次），孵育一抗（1∶1000 β-actin，1∶800 KIM-1、α-SMA），4 ℃摇床60 r/min过夜8 h。TBST洗膜 120 r/min（3次，10 min/次），室温孵育二抗（1∶7000）60 r/min共1 h，TBST洗膜120 r/min（3次，10 min/次），洗膜后系统曝光。以β-actin为内参，ImageJ软件计算蛋白灰度值。

1.9 统计学分析

采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。采用ImageJ软件分析蛋白定量并用GraphPad Prism 9.5软件构图。

2 结果

2.1 FA对高盐饮食小鼠体质量、摄食量及饮水量的影响

实验开始前各组小鼠体质量差异均无统计学意义。2周后，与对照组相比，HS组小鼠体质量降低（P<0.01），FA干预后的HS+LFA组、HS+HFA组的体质量增加（P<0.05，图1）。与对照组相比，HS组的摄食量、饮水量增加（P<0.05），FA干预后HS+LFA组、HS+HFA组的摄食量、饮水量减少（P<0.05，图1）。

2.2 FA对高盐饮食小鼠血压和心率的影响

实验初始，4组小鼠尾动脉收缩压、心率差异均无统计学意义（图2）。2周后，与对照组相比，HS组小鼠的尾动脉收缩压、心率上升（P<0.05）。与HS组相比，HS+LFA组、HS+HFA组小鼠尾动脉收缩压、心率下降（均P<0.05）。

2.3 FA对高盐饮食小鼠肾脏指数和肾功能指标的影响

与对照组相比，HS组的肾脏指数增加、 SCr水平升高（P<0.05）。FA干预后，HS+LFA组、HS+HFA组小鼠的肾脏指数、血清SCr水平降低（P<0.05，图3）。

2.4 FA对高盐饮食小鼠血清炎症因子分泌的影响

与对照组比较，HS组的血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05），HS+LFA组、HS+HFA组的血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平较HS组均降低（P<0.05，图4）。

2.5 FA对高盐饮食小鼠肾脏组织皮质及髓质形态学的影响

HE染色结果显示，与对照组相比，HS组呈现肾皮质肾小球粘连、髓质炎症浸润、肾小管狭窄及管周毛细血管扩张充血。FA干预后，HS+LFA组仅见少量肾小球粘连及局部肾小管扩张；HS+HFA组显示皮质区少量肾小球粘连和肾小管扩张。

PAS染色结果显示，与对照组相比，HS组出现肾小球基底膜增厚、系膜基质增生及肾间质糖蛋白沉积增加。FA干预后，HS+LFA组肾小球基底膜和系膜基质部分恢复，肾间质糖蛋白沉积减少；HS+HFA组系膜基质减少，肾小球基底膜部分恢复正常（图5）。

2.6 FA对高盐饮食小鼠肾组织纤维化的影响

与对照组相比，HS组髓质纤维化病变明显加重，肾小球及肾间质纤维化指数均升高（P<0.05，图6）。FA干预后的HS+LFA组、HS+HFA组小鼠肾脏纤维化病变减轻，HS+LFA组肾小球及肾间质纤维化指数均降低（P<0.05），HS+HFA组纤维化指数虽呈下降趋势但差异无统计学意义。

天狼星红染色显示，HS组肾小球和肾间质纤维化明显加重，肾小球纤维化及肾间质纤维化的指数均升高（P<0.05）。FA干预后，HS+LFA组、HS+HFA组小鼠肾脏纤维化病变均减轻，且肾小球和肾间质纤维化指数降低（P<0.05，图6）。

2.7 FA对高盐饮食小鼠肾组织中E-cadherin、Vimentin、Kim-1和α-SMA蛋白及mRNA表达的影响

与对照组相比，HS组肾间质和肾小球的E-cadherin蛋白阳性表达均减少，Ecadherin的mRNA表达水平降低（P<0.05，图7A），肾间质和肾小球的Vimentin阳性表达和mRNA表达水平增加（P<0.05，图7B、C）。HS组小鼠的Kim-1、α-SMA蛋白和mRNA表达水平增加（P<0.05，图7C）。

FA干预后，与HS组相比，HS+LFA组、HS+HFA组E-cadherin蛋白在肾小球和肾小管上皮细胞阳性表达增加（P<0.05，图7A），Vimentin蛋白表达减少（P<0.05，图7B）。HS+LFA组、HS+HFA组内的Vimentin、Kim-1、α-SMA蛋白表达均减少（P<0.05，图7B、C）。HS+LFA组中肾脏组织中Kim-1及间质细胞标志物Vimentin和α-SMA的mRNA表达降低（P<0.05，图7C），并促进了肾脏组织内上皮细胞标志物Ecadherin的mRNA表达。HS+HFA组Ecadherin的mRNA表达水平升高（P<0.05，图7A），Kim-1、α-SMA、Vimentin的mRNA表达水平降低（P<0.05，图7C）。

3 讨论

高盐饮食是诱发高血压的重要危险因素^［2］，长期且未经控制的血压升高会逐步促进肾小动脉发生硬化性病变，最终演进为肾小球硬化以及肾间质广泛的纤维化，对肾功能造成严重威胁^{［20， 21］}。研究表明，FA有效降低Hcy型高血压大鼠的血压^［17］，但具体机制尚不明确，且在高盐饮食下对肾脏的保护机制也未见报道。故本研究以高盐喂食的C57BL/6J小鼠为研究对象，探讨FA能够通过非血压依赖途径诱导正常血压肾脏纤维化，改善延缓肾脏纤维化，探究其可能的作用机制。研究发现，高盐饮食（8%NaCl）喂养3周造成C57BL/6J小鼠进食量及饮水量明显增加，且尾动脉收缩压呈升高趋势，但差异无统计学意义^［16］。Jiang等^［23］发现4周高盐饮食（8%NaCl）喂养能造成小鼠的血压升高。有研究提示，含4%NaCl的高盐饮食会诱发肾衰大鼠血压升高并加重肾纤维化的发生，从而造成慢性肾衰大鼠残余肾功能的显著下降 ^［24］。本研究中，低、高剂量的FA均可以抑制高盐饮食所致小鼠体质量的减轻，减少饮水量，且改善血压升高和心率增快等临床症状。这表明，FA具有缓解摄入高盐导致小鼠的饮水量增加以及降低血压的作用。

高盐摄入会导致小鼠肾功能指标的异常、炎症因子分泌增加，出现滤过功能受损，排泄能力下降等病理性改变 ^{［25， 26］}。SCr是用来检测肾脏功能损害的主要生物标志物之一^［16］。有研究发现8%高盐摄入4周后小鼠SCr水平明显升高^［27］。饲喂5周8%的高盐饮食的Dahl盐敏感大鼠也会出现血清中SCr水平显著升高 ^［28］。本研究发现，FA干预能够改善2周8%高盐饮食饲喂小鼠SCr水平的升高，提示FA具有肾脏保护功效。

临床CKD患者会出现血清IL-6水平升高^［29］。过量生成的炎症因子是加重肾脏损伤，导致CKD的重要因素之一^［30］。体外细胞共培养研究发现，高盐（Na⁺161 mmol/L）处理可诱发单核巨噬细胞M2型极化并分泌IL-6与TGF-β1，从而促进肾脏纤维细胞株（NRK-49F）增殖并升高肌成纤维细胞标记物（α-SMA及Collage I、Collage III）的表达，提示其向肌成纤维细胞转化^［31］。有研究提示，高盐饮食（含4%~8% NaCl）造成血清炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高^［27］。本研究发现较HS组小鼠而言，HS+LFA组小鼠血清IL-1β和IL-6水平分别下降24.55%、11.35%；HS+HFA组小鼠血清IL-1β和IL-6水平分别下降23.87%、10.73%。上述结果提示FA能有效减少小鼠体内炎症水平，通过降低炎症细胞因子，有效缓解高盐引起的肾脏损伤。

摄入高盐同时还是造成小鼠肾脏组织炎性细胞因子水平升高，组织纤维化发生等的主要原因^［32］，是慢性肾病发生的关键病理过程^［33］。本研究发现，HS组小鼠肾脏组织胶原纤维增多，肾脏间质出现大量胶原沉积。经FA干预之后，肾组织胶原纤维沉积改善，纤维化发生程度减轻，且HS+LFA组干预效果要优于HS+HFA组，提示FA干预能够使可缓解肾脏纤维化的发生。

Vimentin是肾小管上皮细胞发生间充质转化（EMT）后的中间纤维^［16］。Kim-1在受损的肾脏组织中蛋白表达水平上升，且随着间充质细胞的增多而表达增加，与肾脏纤维化密切相关^［16］。E-cadherin表达下调及α-SMA表达增强是EMT的重要标志物^［34］。在EMT发生过程中，肾小管上皮细胞丧失了原有的细胞形态和结构，失去其特征蛋白E-cadherin，进而被α‑SMA和Vimentin所取代，从而具有了迁移和侵袭能力，间质纤维组织堆积，最终形成纤维化^［35］。促进E-cadherin的表达，抑制α-SMA的表达能够减缓EMT的发生^［36］。本研究中，FA干预能够促进HS处理组小鼠肾脏组织内上皮细胞标志物E-cadherin的mRNA表达，并显著抑制间质细胞标志物Vimentin和α-SMA的mRNA升高，抑制了肾小管上皮细胞EMT的进展，从而减缓了高盐处理造成的小鼠肾脏纤维化。

FA对预防肾损害有重要意义，但其剂量的使用问题仍饱受争议。长期大剂量服用FA虽会增加罹患癌症的风险、易造成神经系统、免疫系统损害^［17］。但每日膳食补充FA（0.5~5 mg）可使人体血浆中Hey的浓度降低约25%^［37］。而高剂量FA（2.0 mg·kg^-1·d^-1）较低剂量FA（0.5 mg·kg^-1·d^-1）具有显著改善大鼠血脂代谢并降低其动脉粥样硬化形成的效果^［18］。但亦有学者发现，FA（0.4 mg/kg和4 mg/kg）均可改善合并高Hey的高血压大鼠的肾损伤，但高剂量FA对肾损害的改善未见更好疗效，相反低剂量FA对肾损害有保护作用^［17］。

本研究以短期高盐喂食的C57BL/6J小鼠为研究对象，探究FA干预对肾脏损伤的分子保护机制，结果发现FA能够明显改善高盐饮食对小鼠肾功能的损伤，减少炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的释放，降低纤维化指标（α-SMA、Vimentin）的mRNA水平，上调E-cadherin的表达，这提示着FA通过减少肾脏炎症，延缓肾组织纤维化，有效减缓肾小球滤过功能受损程度，发挥肾保护的作用。但低剂量FA（0.56 mg/kg）干预在改善高盐饮食暴露所造成小鼠肾脏纤维化方面要优于高剂量FA（5.6 mg/kg）的干预效果。

综上所述，在短期高盐的饮食下同时摄入FA，可以有效的改善肾脏纤维化，抑制炎症反应。临床上可用于改善或逆转肾纤维化的干预措施有限，本研究探讨FA干预在短期高盐饮食肾损害中的表达变化及作用，可为其防治提供新的思路。

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基金资助

中央引导地方科技发展基金专项(桂科ZY22096025)

广西壮族自治区大学创新创业训练计划(202210601038)

广西壮族自治区八桂青年拔尖人才培养项目(GCHH〔2024〕55)

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