加味清心莲子饮通过调控KDM3C/SP1信号通路改善糖尿病肾病小鼠的肾脏损伤

Jia Wei Qingxin Lotus Seed Drink improves diabetic kidney disease in mice by regulating the KDM3C/SP1 signaling pathway

摘要

目的 探讨加味清心莲子饮（QISD）对糖尿病肾病（DKD）小鼠肾脏损伤的干预作用及机制。 方法 从GEO数据库中下载GSE193192数据集，筛选由晚期糖基化终末产物诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）中差异表达的免疫基因集，利用多种分析预测药理机制。动物实验方面，选用雄性ICR小鼠，先持续性高脂饮食喂养4周后，连续腹腔注射链脲佐菌素5 d，制备DKD模型，连续灌胃低（14.46 g/kg）、中（28.92 g/kg）、高剂量（57.84 g/kg）的加味清心莲子饮12周（1次/6），以达格列净作为阳性对照，8只/组。通过HE、PAS和Masson染色观察DKD小鼠肾脏病理损伤。通过RT-qPCR和Western blotting检测KDM3C、SP1、TNF-α、MCP-1等蛋白的表达水平。在体外实验中，使用脂多糖（LPS）诱导HK-2发生炎症损伤，采用小分子抑制剂干预的方法，探索加味清心莲子饮对细胞炎性损伤的影响。 结果 动物实验结果表明，加味清心莲子饮中剂量组和高剂量组能够显著降低糖尿病肾病小鼠糖化血清蛋白、肌酐和尿素氮水平（P<0.01，P<0.001），减少糖原累积，减轻肾小球肥大，降低炎性细胞浸润。此外，加味清心莲子饮中剂量组和高剂量组能够显著降低小鼠肾脏组织中KDM3C、SP1、TNF-α和MCP-1的基因和蛋白表达（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。细胞实验结果显示KDM3C抑制剂JIB-04的应用则能抑制TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎性因子的表达水平（P<0.05，P<0.001）。 结论 加味清心莲子饮可通过抑制糖尿病肾病小鼠的炎症反应改善肾脏损伤，其作用机制可能与抑制KDM3C/SP1信号通路的过度激活有关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effect of Jia Wei Qingxin Lotus Seed Drink (QISD) on renal injury in mice with diabetic kidney disease (DKD) and its mechanism. Methods The immunogenes differentially expressed in renal tubular epithelial cells (HK-2) induced by late glycosylation end products were screened using GSE193192 dataset from GEO database and the pharmacological mechanisms were predicted. Male ICR mouse models of DKD established by high-fat feeding for 4 weeks and intraperitoneal streptozotocin injection for 5 days were randomized for treatment with low (14.46 g/kg), medium (28.92 g/kg) and high (57.84 g/kg) doses of QISD via gavage for 12 weeks, with dapagliflozin as the positive control drug (n=8). Penal pathologies of the mice were observed by HE, PAS and Masson staining, and renal expression levels of KDM3C, SP1, TNF-α, and MCP-1 mRNAs and proteins were detected using RT-qPCR and Western blotting. In a HK-2 cell model of lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory injury, the effects of small-molecule inhibitors were tested to explore the therapeutic mechanism of QISD against cell inflammation. Results QISD treatment significantly lowered serum levels of glycated serum protein, creatinine and urea nitrogen, reduced glycogen accumulation, attenuated glomerular hypertrophy, and decreased renal inflammatory infiltration in DKD mouse models. QISD also reduces the expression levels of KDM3C, SP1, TNF‑α and MCP-1 in the kidney tissues of the mice. In LPS-induced HK-2 cells, the application of JIB-04, an inhibitor of KDM3C, obviously suppressed the expression levels of the inflammatory factors including TNF‑α, MCP-1 and ICAM-1. Conclusion QISD can ameliorate renal injury in DKD mice by inhibiting inflammatory response via suppressing excessive activation of the KDM3C/SP1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

数据库分析 / 糖尿病肾病 / 炎症 / KDM3C/SP1信号通路 / 加味清心莲子饮

Key words

database analysis / diabetic kidney disease / inflammation / KDM3C/SP1 signaling pathway / Jia Wei Qingxin Lotus Seed Drink

糖尿病肾病（DKD）是一种慢性的微血管病变，是由于糖尿病患者长期得不到正确的治疗，进而发展出以水肿、蛋白尿、肾功能下降等为主要表现的肾脏并发症，到了晚期则表现为严重的肾功能衰竭及尿毒症，是糖尿病患者发生终末期肾病和死亡的主要原因^［1，2］。糖尿病在全球的发病率一直以惊人的速度增长。据权威机构预测，到2045年，全球将有7.832亿糖尿病患者，其中30%~40%的患者将进展为DKD，并有5%~10%最终发展为终末期肾病^［3，4］。给全球经济和社会发展带来沉重负担。目前，西医治疗DKD主要通过降脂降压，控制饮食和血糖，减少蛋白的摄入等，但治疗效果并不太理想^{［5， 6］}。

DKD发病机制复杂，目前研究多认为，高血糖、氧化应激、表观遗传修饰异常、足细胞损伤、肾小管细胞损伤等促进了DKD的发生发展，而其中表观遗传修饰异常在DKD发病机制中的作用引起了学者们的关注^［7，8］。表观遗传修饰是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，通过化学修饰改变染色体上的DNA和蛋白质，从而影响基因的表达。这种修饰可以影响基因的转录、剪接、稳定性、翻译、核小体组装和染色质结构等多个层面，从而影响细胞的生理和病理过程，以及后代的表型，并且可以介导基因和环境之间的串扰^{［9， 10］}。由于糖尿病和DKD的进展受到长期缺氧、糖脂代谢异常、营养摄入不均衡等诸多环境因素的强烈影响，这些因素反过来又可以改变表观遗传状态，因此表观遗传修饰很可能在DKD的发病机制中起关键作用^{［11， 12］}，然而，表观遗传修饰异常影响DKD的具体机制尚不明确。课题组前期研究结果表明^［13］，组蛋白去甲基化酶KDM3C在高糖缺氧诱导的细胞炎性损伤中表达显著升高，但其是否在DKD中扮演重要角色仍不清楚。

加味清心莲子饮（QISD）最早出自于《太平惠民和剂局方》，由黄芪、党参、地骨皮、黄芩、石莲子、茯苓、麦冬、车前子、白花蛇舌草、益母草、甘草和芡实等12味药物组成，在治疗慢性肾脏病中多有应用。尤其适用于肾系疾病属气阴两虚、湿热内蕴者。DKD属中医“肾消”、“水肿”等范畴，《太平圣惠方·卷五十三》指出：“饮水随饮便下，小便味甘而白浊，腰腿消瘦者，消肾也。”对于该病病因病机的认识，大多数医家多重视肾虚致病，认为素体肾气亏虚，消渴迁延日久，耗伤阴液，渐至气阴两虚。此外，在DKD发展及治疗过程中，湿热不除，蛋白难消；瘀血不祛，肾气难复。而加味清心莲子饮能益气养阴治本，兼有清利湿热、活血化瘀治标，在临床治疗DKD患者也多获良效，但其作用机制有待进一步的研究。

现有研究多集中在清心莲子饮对DKD临床症状的改善^［14-16］，而对其分子机制的理解仍不全面，尤其是在数据库分析视角下的深入分析不足。因此，本研究通过数据库分析结合动物及细胞实验，揭示了加味清心莲子饮的潜在作用靶点和机制，填补了该药物作用机制研究的空白，进一步验证了加味清心莲子饮的疗效及分子基础，有望为DKD的治疗提供新的理论依据和实践指导。

1 材料和方法

1.1 生信分析

1.1.1 差异表达基因（DEGs）的鉴定和基因集富集分析（GSEA）

从ImmPort数据库中下载了2498个免疫基因的列表。此外，下载了AGEs诱导的肾小管上皮细胞HK-2的差异基因表达概况。GSE193192来自GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），包括shCtrl-正常组，shCtrl-AGEs组各3例。|LogFC|>1.5和Padj<0.05被用作筛选DEGs的标准。基于AGEs诱导的HK-2细胞系基因表达数据，使用GSEA进行基因集富集分析。h.all.v7.4.entrez.gmt基因集从MSigDB数据库下载，fgsea包用于GSEA，P<0.05、FDR<0.25被认为有统计学意义，选择NES排名前3且显著的通路进行展示。

1.1.2 基因本体（GO）功能和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

利用Metascape数据库对GSE193192中的DEGs进行GO功能以及KEGG通路富集分析，设置最小富集数为3，富集因子>1.5，P<0.01，用微生信平台进行可视化展示。

1.1.3 免疫细胞浸润的评估

处理了GSE225477 中db/m与db/db 小鼠肾脏组织各3例的基因表达数据集，使用Ensembl BioMart 数据库（Ensembl release 108），获取小鼠-人同源基因对，并保留一对一映射的基因（one-to-one orthologs），确保跨物种基因对应的唯一性，将小鼠的基因ID转为人类基因ID，删除空值，缺失的值在“impute”包中用KNN方法补充，将表达矩阵整理为CIBERSORT可接受的格式，然后将数据上传到CIBERSORT门户网站（http：//cibersort.stanford.edu/）。我们使用原始的CIBERSORT基因签名文件LM22，该文件定义了22个免疫细胞亚型，进行免疫细胞比例去卷积分析（置换次数perm=100，QN=F），CIBERSORT P值<0.05。免疫细胞比例结果用R包 ggplot2、reshape2、ggpubr 可视化，包括柱状图展示各样本免疫细胞组成、箱线图比较 db/db与db/m组免疫细胞差异，并对 4 个关键基因与免疫细胞比例进行相关性分析，该分析属于跨物种近似方法，主要用于比较组间相对变化趋势，而非绝对定量。

1.1.4 免疫细胞浸润类型的差异分析

为了分析 DKD 组与对照组中不同免疫细胞类型的差异表达，使用limma包和贝叶斯法构建线性模型。P值<0.05是截止标准。为了进一步了解关键基因与免疫细胞比例之间的关系，计算皮尔逊相关系数，来找到这些关键基因与免疫细胞浸润之间的潜在相关性。

1.2 动物实验验证

1.2.1 实验动物

健康SPF级雄性ICR小鼠48只，体质量30~35 g，6~7周龄，由珠海百世通科技有限公司（中国珠海）提供，实验动物许可证号：SYXK（广东）2021-0167。动物饲养于南方医科大学动物实验中心，该实验中心建有规范化的SPF级屏障环境动物实验室，涉及的动物实验均符合实验动物伦理法规定，并通过南方医科大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：L2022142）。

1.2.2 药物

QISD的中药材（具体剂量为：黄芪30 g、党参20 g、地骨皮15 g、黄芩15 g、石莲子15 g、茯苓15 g、麦冬15 g、车前子15 g、白花蛇舌草30 g、益母草30 g、甘草10 g和芡实15 g）。均购自南方医科大学（中国广州）珠江医院中药房，经南方医科大学（中国广州）中医药学院中药鉴定教研部田恩伟教授鉴定。将上述药物用8倍体积的二级纯水浸泡20 min，煮沸2次，将滤液混合浓缩至原料药含量为3.86 g/mL，并分装后存放于4 ℃冰箱中。达格列净片（南京正大天晴制药有限公司）给药前溶于生理盐水中。

1.2.3 试剂

链脲佐菌素（上海源叶生物科技有限公司，批号S17049），4%多聚甲醛固定液（北京化学试剂公司，批号P804536），肌酐（Scr）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号C011-2-1），尿素氮测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号C013-2-1），BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific），60%脂肪供能高脂日粮型饲料（广州祺正生物科技有限公司，产品编号：XTHF60-1，合格证号：QC20220900181201），TRIzol、反转录试剂盒和预混合qPCR试剂盒（Accurate Biology），PVDF膜（MilliporeSigma），ECL发光液（MilliporeSigma），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体II（Proteintech），MEM培养基（英潍捷基上海贸易有限公司），JIB-04试剂（广州创融生物科技有限公司），脂多糖（LPS，广州威佳科技有限公司），胎牛血清（广州天骏生物科技有限公司）。

1.2.4 仪器

血糖仪（罗氏），病理切片机（徕卡），CO₂培养箱（Thermo），全波长酶标仪（Thermo），倒置显微镜（尼康）。

1.2.5 动物分组与造模

将48只小鼠适应性饲养1周，观察无异常后，随机选取8只健康小鼠为对照组，其余40只为模型组。对照组给予普通饲料，模型组小鼠给予60%脂肪供能高脂饮食喂养，4周后造模。模型组小鼠按60 mg/kg标准腹腔注射链尿佐菌素（STZ），空白组大鼠腹腔注射等剂量柠檬酸钠缓冲液，1周后用血糖仪测量小鼠尾静脉的血糖，若随机血糖≥16.7 mmol/L，即糖尿病小鼠造模成功。造模成功后再将造模组随机分为QISD高剂量组、QISD中剂量组、QISD低剂量组、达格列净组（阳性组）、模型组。连续治疗12 周后取材。

1.2.6 给药方法

模型组小鼠造模成功后，按人与小鼠体表面积折算法进行等效剂量换算，将QISD公式的剂量换算为等效剂量。选取等效剂量为中剂量（28.92 g/kg），选取2倍等效剂量为高剂量（57.84 g/kg），选取1/2倍等效剂量为低剂量（14.46 g/kg）；达格列净组以1 mg/kg剂量的达格列净混悬液灌胃；对照组、模型组灌胃等体积的生理盐水溶液，0.2 mL/次，1次/d，连续灌胃12 周。

1.2.7 加味清心莲子饮含药血清的制备与细胞处理

根据“实验动物与人体表面积等效剂量换算比率”计算加味清心莲子饮大鼠等效剂量，加味清心莲子饮各组分煎煮2次，混匀得到水煎剂，开始灌胃的前1 d制备后保存于4 ℃冰箱备用。将雄性SD大鼠随机分为对照组、中药组，10只/组，中药组以18.75 g/kg剂量进行灌胃，对照组给予等体积生理盐水灌胃，早晚各1次，持续5 d。最后1次给药前大鼠禁食不禁水12 h。末次给药后1 h，通过脱臼处死大鼠后，心脏取血，置于无菌抗凝管内。室温静置30 min，待凝血坚固，血清析出。按4 ℃，3000 r/min离心15 min，吸出上清，同组血清混匀，56 ℃灭活30 min，在超净生物安全柜内用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，EP管分装、标记，置于-80 ℃冰箱保存备用。

人HK-2细胞系购自中国科学院细胞库（中国上海）。所有实验都使用传代4~10代之间的细胞。HK-2细胞在添加10% FBS和1%青霉素的MEM培养基中培养。细胞在37 ℃的5% CO₂培养箱（Thermo Fisher Scientific）中培养。待汇合度达到70%时，分别用100 μg/mL的LPS、2 μmol/L的组蛋白去甲基化酶抑制剂JIB-04及5%、10%和20%浓度的QISD含药血清干预细胞，干预24 h后收集细胞进行分析。并进行后续处理和实验。

1.2.8 观察指标与方法

1.2.8.1　生化指标检测

采集小鼠血液并于室温下静置1 h，在4 ℃下以3500 r/min离心15 min后，分离血清，按照GSP、Scr、BUN等相应试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行操作，检测各组小鼠血清中GSP、Scr和BUN的水平。

1.2.8.2　肾脏组织病理变化观察

取各组小鼠新鲜肾脏组织，用预冷生理盐水清洗，在室温下用4%多聚甲醛固定24 h，依次梯度乙醇脱水，二甲苯洗涤，石蜡包埋，切片（4 μm厚），将切片脱蜡水化，分别进行苏木精伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色和Masson染色，在显微镜下观察各组小鼠肾脏组织的肾小球形态、炎性浸润，糖原沉积及胶原纤维排列等肾脏病理变化。

1.2.8.3　CCK-8细胞增殖活力测定

LPS对细胞增殖的影响采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）试剂盒（Zeta-Life），遵循官方方案。即将人HK-2细胞接种于96孔板中，密度为5×10³/孔，每组3个重复。然后将细胞在含有1% FBS的培养基中血清饥饿12 h。然后，各处理组分别给予不同浓度的LPS（0、50、100、200、300、400 μg/mL）和添加1% FBS的培养基24、48和72 h。然后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h，用酶标仪（Gene Company）测定吸光度A_{450 nm}值。

1.2.8.4　Western blotting

用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从各组小鼠组织中提取总蛋白溶液，配置BCA工作液测定样品的蛋白浓度，并将蛋白进行变性。行凝胶、电泳分离及转膜，转膜结束后，取出PVDF膜，在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h孵育，加入KDM3C（Novusbio， NBP1-77072， 1∶1000）、SP1（Proteintech， 21962-1-AP， 1∶8000）、TNF‑α（Proteintech， 17590-1-AP， 1∶1000）、MCP-1（Proteintech， 26161-1-AP， 1∶1000）、β‑actin（Abcam，ab8226， 1∶1000）等一抗稀释液，4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗涤条带，清洗4次，10 min/次。洗涤后加入二抗（1∶5000），室温下在摇床低速孵育1 h，用ECL发光溶液检测蛋白条带，浸泡曝光，观察、记录其显影情况，保存分析。

1.2.8.5　免疫组化染色

处理后的肾脏组织切片常规脱蜡，在3% H₂O₂中浸泡10 min，在柠檬酸抗原修复液（pH=6.0）中95 ℃孵育20 min，冷却至室温，用牛血清白蛋白（BSA，5%）封闭30 min。然后用KDM3C多克隆抗体（novusbio，1∶400）灌注组织切片，在4 ℃下孵育过夜，用辣根过氧化酶偶联抗兔二抗（Proteintech， 1∶5000）在37 ℃下孵育30 min，用链亲和素-生物素复合物（SABC）在37 ℃下孵育30 min。在1mL DAB Plus底物中加入1~2滴DAB Plus Chromogen，混合均匀后，在切片上滴加，孵育10 min。冲洗切片，苏木精浸泡染色，脱水，透明，密封。在显微镜下观察，拍照保存图像。

1.2.8.6　实时荧光定量逆转录聚合酶链反应

采用RT-qPCR法检测肾脏组织中核心靶点KDM3C、SP1和炎症相关因子TNF‑α、MCP-1、ICAM-1的 mRNA表达。TRIzol法提取各组样本的总RNA，分光光度计检测RNA浓度。用First Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA，-20 ℃保存备用。以cDNA为模板，按照AG qPCR试剂盒说明进行引物扩增。反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退火、延伸，60℃ 60 s，40个循环。采用2^-ΔΔct法计算目的基因的相对表达量。引物序列根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）Primer BLAST（引物序列见表1）设计，由生物技术生物工程有限公司（中国上海）合成。

1.3 统计学分析

所有统计分析均使用Graph Pad Prism8.0软件完成。除非另有说明，数据以均数±标准差表示。统计检验包括Kruskal-Wallis检验、非配对t检验以及单因素方差分析（ANOVA），并结合事后多重比较检验以进一步分析组间差异。统计学显著性水平设定为P<0.05。所有实验均重复3次。

2 结果

2.1 生信分析结果

2.1.1 DEGs的鉴定与GSEA富集分析

在基于调整后的P=0.05和｜logFC｜>1.5的差异表达分析中，共鉴定出874个差异基因。在这些DEGs中，170个上调，704个下调（图1B）。我们还对GSE193192中的差异基因进行了GSEA。参考基因集是h.all.v7.4.symbols.gmt，选择P值最小NES排名前3的富集通路进行展示，分别是HallMark_Glycolysis：糖酵解、HallMark_Hypoxia：缺氧、HallMark_TNFA-Signaling_Via_NFKB：肿瘤坏死因子α通过NFKB信号通路（图1C）。这些途径也主要与炎症、氧化应激、免疫、糖酵解和其他类似作用有关，而免疫和炎症的差异有统计学意义（P<0.001）。

2.1.2 GO与KEGG功能富集分析结果

GO分析结果显示，常见基因在生物过程（BP）术语中丰富，包括“positive regulation of phagocytosis，engulfment：吞噬作用和吞噬的正向调节”、“response to wounding：对伤害的反应”、“wound healing：伤口愈合”和“inflammatory response to wounding：对伤害的炎症反应”（图2A）。对于细胞成分（CC）本体而言，常见基因涉及“collagen-containing extracellular matrix：含胶原蛋白的细胞外基质”、“interstitial matrix：间质基质”、“voltage-gated potassium channel complex：电压门控钾通道复合体”和“excitatory synapse：兴奋性突触”（图2B）。对于分子功能（MF），常见基因涉及“protease binding：蛋白酶结合”、“heparin binding：肝素结合”“glycosaminoglycan binding：糖胺聚糖结合”、“sulfur compound binding：硫化合物结合”、“arachidonic acid binding：花生四烯酸结合”、“icosanoid binding：二十烷酸结合”、“peptide binding：肽结合”和“S100 protein binding： S100蛋白结合”（图2C），这些都直接或间接的调节免疫或炎症反应，作为信号传导等功能。KEGG分析阐明了人类疾病分数最高的是：“Immune system免疫系统”（图2D）。常见的许多基因参与“NF-kappa B signaling pathway：NF-kappa B信号通路”、“T cell receptor signaling pathway：T细胞受体信号通路”、“Fc epsilon RI signaling pathway：FcεRI信号通路”、“Efferocytosis：清除凋亡细胞作用”、“B cell receptor signaling pathway：B细胞受体信号通路”、“TGF-beta signaling pathway：TGF-β信号通路”和“TNF signaling pathway：TNF信号通路”，如图2E所示，与AGEs诱导的肾小管上皮细胞HK-2的发病机制常见的基因和免疫炎症反应具有高度相关性。

2.1.3 免疫细胞浸润的评估与分析

GSE225477中DKD组和对照组22种免疫细胞的比例如图3A所示，其中T cells CD4 memory resting：静息状态CD4记忆性T细胞。DKD组与对照组的箱线图显示，与对照组相比，T cells CD4 memory resting：静息状态的CD4记忆T细胞，NK cells activated：活化的自然杀伤细胞，Mast cells resting：静息状态的肥大细胞的水平较低，而Macrophages M0：M0巨噬细胞，B cells naive：初始B细胞，T cells CD4 memory activated：活化的CD4记忆T细胞的水平较高（图3B）。检测4个主要基因（SP1、KDM3C、IL-6、ICAM-1）的免疫细胞相关性情况如图3C所示，SP1与KDM3C的相关性相似，在T cells CD4 memory resting：静息状态的CD4记忆T细胞，T cells regulatory （Tregs）：调节性T细胞，T cells gamma delta：γδT细胞，NK cells activated：活化的自然杀伤细胞，Mast cells resting静息状态的肥大细胞呈正相关。IL-6与B cells naive：初始B细胞，T cells CD4 naive：初始CD4 T细胞，T cells CD4 memory activated：活化的CD4记忆T细胞，T cells gamma delta：γδ T细胞，Monocytes：单核细胞，Macrophages M0：M0巨噬细胞呈正相关。ICAM-1与B cells naive：初始B细胞，T cells gamma delta：γδ T细胞，NK cells activated：活化的自然杀伤细胞，Monocytes：单核细胞，Macrophages M0：M0巨噬细胞，Mast cells resting：静息状态的肥大细胞呈正相关。

2.2 动物实验验证结果

2.2.1 QISD对DKD小鼠血清GSP、Scr、BUN和肾脏组织糖原沉积的影响

模型组与对照组相比，DKD小鼠血清GSP、Scr和BUN水平升高（P<0.001），且DKD小鼠肾脏组织中蓝紫色区域更为明显，肾脏组织中糖原积累更为严重。与模型组相比，其余4组DKD小鼠的血清GSP、Scr和BUN水平均明显降低，其中达格列净组和QISD中、高剂量组降低最为显著（P<0.01，P<0.001，图4），且QISD中、高剂量组和达格列净组的小鼠肾脏组织糖原积累都有较为明显的改善。

2.2.2 各组小鼠肾脏组织病理变化

HE染色显示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠肾小管髓质灶性扩张和气球样变，肾小球肥大，基底膜增厚，肾小管扩张，间质结缔组织增生，炎性细胞大量浸润肾小管。此外，Masson染色结果显示DKD小鼠肾脏组织出现有较为严重的胶原纤维和细胞外基质的沉积，尤其以肾小球和小管间质区域更为明显。与模型组比较，给药组小鼠肾脏组织病变程度有所减轻，其中，QISD中、高剂量组和达格列净组小鼠肾小球肥大明显减轻，系膜基质轻度增生，肾脏组织中炎症细胞浸润明显减少，细胞外基质的分泌和胶原纤维的沉积水平也显著下降（图5）。

2.2.3 各组小鼠肾脏组织中炎症因子水平的比较

采用Western blotting和RT-qPCR对各组小鼠肾脏组织中TNF-α和MCP-1等炎症因子进行检测。与对照组相比，模型组肾脏组织中TNF-α和MCP-1的基因和蛋白表达均明显升高（P<0.05，P<0.001）。而QISD和阳性药组均能显著降低小鼠肾脏组织中炎症因子的表达，其中以QISD中、高剂量组和达格列净组尤为明显（P<0.05，P<0.01，P<0.001，图6）。

2.2.4 各组小鼠肾脏组织中KDM3C、SP1表达量的比较

免疫组化、Western blotting和RT-qPCR结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肾脏组织中KDM3C和SP1的表达水平显著升高（P<0.05，P<0.001），而与模型组相比，QISD和达格列净组均能显著降低小鼠肾脏组织中KDM3C和SP1的表达（P<0.05，P<0.01，P<0.001，图7）。

2.2.5 QISD对LPS诱导的HK-2细胞炎症损伤的影响

高浓度的LPS在处理24 h、48 h和72 h后对HK-2细胞的活力有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性地减少细胞数量。此外，与对照组相比，LPS刺激可显著促进KDM3C、SP1、TNF-α和MCP-1的基因表达，QISD低、中和高剂量组可下调KDM3C、SP1、TNF-α和MCP-1的表达水平（P<0.05，P<0.01，P<0.001，图8）。

2.2.6 KDM3C调控SP1及炎性因子的表达

采用Western blotting和RT-qPCR检测KDM3C被抑制后，SP1及TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎性因子的表达水平。结果显示，相对于对照组来说，LPS刺激的HK-2细胞中，SP1和TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎性因子的基因和蛋白水平显著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。而相对于LPS刺激的HK-2细胞，运用JIB-04干预KDM3C的表达后，SP1的蛋白及基因表达均明显降低，并伴随有TNF-α、MCP-1和ICAM-1基因水平的下降（P<0.05，P<0.001，图9）。

3 讨论

本研究通过分析GSE193192数据集发现，TNF-α信号通路在AGEs诱导肾小管上皮细胞HK-2的基因表达中具有显著的差异，这表明以TNF-α通路为主介导的炎性损伤在DKD肾脏组织损伤中扮演十分重要的角色。研究表明，高血糖能够诱导小管上皮细胞分泌炎性因子，破坏上皮细胞的完整性导致细胞功能障碍甚至凋亡，而在持续不断的高血糖刺激下，能够观察到过量的巨噬细胞和中性粒细胞的活化，并且能够降低细胞活力，诱发细胞发生凋亡、焦亡及坏死等^［17-19］。QISD是出自于《太平惠民和剂局方》的经典名方，临床常用于治疗气阴两虚型的慢性肾脏病患者，并能取得良好疗效。虽然QISD在DKD中的肾保护作用已经被证实，但这些研究大多都在临床中进行。本研究利用高脂饮食联合STZ注射诱导的DKD小鼠揭示QISD对DKD小鼠的肾保护作用，并结合LPS诱导的HK-2细胞作为体外模型深入探讨其作用机制。本研究发现，QISD通过抑制KDM3C/SP1信号通路可降低DKD肾脏组织中炎性因子的分泌，减少中性粒细胞的聚集和活化，并发挥肾脏保护功能。

动物实验结果表明，8周龄的小鼠在经过高脂饮食饲养联合STZ注射后表现出与人DKD一致的病理特征，包括肾脏肥大、炎症细胞浸润、系膜基质扩张及基底膜增厚等^［20］。通过对各组小鼠血清生化指标的检测发现，模型组血清中GSP、Scr和BUN水平显著升高，且PAS、HE和Masson等病理学染色显示DKD小鼠肾脏组织出现了更多的糖原积累、炎性细胞浸润和胶原纤维的沉积等。而在QISD治疗12 周后，DKD小鼠的血清GSP、Scr、BUN水平显著降低，且使得肾脏组织的糖原积累和免疫细胞的浸润减轻，表明QISD可明显改善DKD小鼠的肾脏损伤和免疫浸润。Western blotting和RT-qPCR检测结果也表明，QISD干预能够显著降低TNF-α和MCP-1等炎性因子的基因和蛋白表达，这也进一步证明，炎性损伤在DKD的发生发展中具有重要的推进作用，而QISD可能通过抑制炎症反应的过度激活来延缓DKD的进展。

研究表明，表观遗传修饰在调控DKD及其代谢记忆中具有十分关键的作用^［21］。其中，组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，在病理生理条件下，DKD的炎性损伤可能受到组蛋白甲基化的调节。例如，抑制组蛋白去甲基化酶JMJD1A可改善晚期糖基化终末产物诱导的细胞炎症损伤和小管间质的纤维化^［22］。另外一项研究表明，组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4抑制KDM4A的表达能够改善DKD小鼠的肾功能不全、肾小球硬化及炎症损伤等^［23］。我们在前期研究中发现组蛋白去甲基化酶KDM3C在高糖缺氧诱导的细胞模型中表达差异明显。而本研究结果也显示在DKD小鼠肾脏组织KDM3C的表达显著升高，同时伴随有TNF-α、MCP-1等炎性因子的过度分泌，而QISD能够显著抑制上述因子的基因和蛋白表达。表明QISD能够在抑制KDM3C表达的同时，减轻DKD小鼠肾脏组织的炎性损伤，而为了进一步探究KDM3C与QISD减轻小鼠肾脏组织炎性损伤的关系。我们用KDM3C的抑制剂JIB-04验证了在LPS诱导的HK-2细胞模型中，抑制KDM3C的表达能够改善细胞炎性损伤。因此，在DKD小鼠肾脏组织以及LPS诱导的HK-2细胞模型中，QISD处理在抑制KDM3C表达的同时，也抑制了炎性因子的水平。这些数据表明，QISD通过抑制KDM3C的表达来减轻炎症浸润，从而在DKD中发挥肾保护作用。SP1是一种与ERK1/2相关的转录因子，已被证明可通过多种途径上调TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎性因子的释放，并诱导组织的炎性损伤过程^{［24， 25］}，在DKD的发生发展中具有重要作用。TNF-α和MCP-1可增加白细胞在血管内皮细胞上的黏附，促进白细胞的炎性渗出^［26］，还可过度激活免疫因子，导致微血管损伤和肾脏损伤，从而增加终末期肾病的发生风险^{［27， 28］}。在DKD进展过程中，TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎症因子的大量释放可以诱导炎症反应级联放大，产生细胞因子风暴，造成严重的肾脏损伤^{［29， 30］}。QISD可通过抑制促炎因子的过度表达发挥抗炎作用，从而减轻炎症损伤。

综上所述，本研究利用分析GEO数据集预测了炎性损伤在DKD进展中的重要作用。同时结合功能富集和免疫浸润评分发现TNF信号通路及小管细胞的免疫浸润是其中最为关键的发病机制，而QISD可能通过干预TNF信号通路的表达，改善小管细胞的免疫浸润，发挥肾脏保护作用。体内和体外实验结果表明，QISD可以降低DKD小鼠血清GSP、Scr和BUN水平，减轻肾脏组织的糖原累积、炎性浸润和纤维沉积，并发挥对KDM3C/SP1信号通路的干预作用，进而下调TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎性因子的表达水平，提示QISD治疗DKD的分子机制之一可能是抑制KDM3C/SP1信号通路的过度激活，发挥炎症调节作用。

需要指出的是，由于本研究免疫浸润分析采用了人类免疫细胞特征数据库LM22通过同源基因映射分析小鼠肾脏组织基因表达数据。尽管有小鼠专用工具如CIBERSORT-ImmuCC，但针对小鼠的免疫细胞去卷积分析可用的参考矩阵较少，还不够完善。相比之下，LM22矩阵最初基于人类实验推导，且已有多篇文献采用同源基因映射方法成功用于小鼠组织的免疫浸润分析并揭示免疫细胞变化趋势^［31］。因此，本研究采用LM22的目的是探讨组间免疫浸润的相对变化趋势。该方法虽属跨物种，但结合统计显著性分析和实验验证，能够有效揭示免疫细胞与疾病的相关性。未来研究计划结合小鼠特异性工具或单细胞测序，进一步验证和分析免疫细胞的组成。

此外，尽管本研究通过Western blotting等实验手段初步验证了QISD可通过下调KDM3C/SP1信号通路相关蛋白表达，进而抑制炎症因子的分泌、改善炎症状态和肾脏损伤，但未进一步采用SP1过表达来进行挽救验证，这也是本研究的局限之一。由于实验周期和技术平台限制，尚未能在本研究中补充相应数据。我们已在后续课题设计中纳入SP1过表达慢病毒的干预实验，以进一步明确QISD作用是否依赖于该通路的激活状态，从而更加系统地阐明其作用机制。

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