长链非编码RNA LASTR通过结合miR-4476上调BCAM表达促进头颈鳞癌恶性进展

Long non-coding RNA LASTR promotes progression of head and neck squamous cell carcinoma by binding to miR-4476 and upregulating BCAM expression

摘要

目的 探讨长链非编码RNA LASTR在头颈鳞癌细胞中的调控作用、分子机制及临床意义。 方法 利用TCGA、GEO数据库转录组测序数据分析LASTR在头颈鳞癌中的表达水平及其与患者生存时间的相关性，qPCR检测LASTR在头颈鳞癌细胞和正常对照细胞中的表达水平。利用siRNA建立LASTR敲降的头颈鳞癌细胞模型，通过高内涵细胞计数、CCK-8实验、ATP检测分析增殖能力，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。生物信息学分析LASTR候选靶基因并进行功能注释，qPCR和免疫印迹验证LASTR对候选靶基因BCAM的调控作用。RNA pulldown和双荧光素酶报告分析研究LASTR对BCAM的调控机制。利用TCGA和GEO转录组数据分析BCAM在头颈鳞癌中的表达水平，细胞功能实验研究BCAM对头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。挽救实验探究LASTR是否通过调控BCAM表达水平影响头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。 结果 与正常对照相比，头颈鳞癌组织和细胞中LASTR表达水平升高（P<0.01）。LASTR高表达与头颈鳞癌预后不良显著相关（P<0.05）。敲降LASTR抑制头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力（P<0.01）；生物信息学分析发现78个LASTR候选靶基因，这些基因主要富集于血管生成、低氧应答、血管内皮生长因子受体信号通路、细胞群增殖的正向调节、MAPK信号通路、ErbB信号通路、Ras信号通路等生物过程和信号通路；敲降LASTR导致头颈鳞癌细胞BCAM表达水平降低（P<0.01）；机制研究揭示LASTR通过特异性结合miR-4476上调靶基因BCAM表达水平。敲降BCAM抑制头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，而过表达BCAM能够逆转敲降LASTR对头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。 结论 LASTR在头颈鳞癌组织和细胞中表达水平上调，且LASTR高表达与头颈鳞癌预后不良相关。LASTR通过特异性结合miR-4476上调BCAM表达水平，从而促进头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。本研究结果将为头颈鳞癌临床诊疗提供新的潜在标志物。

Abstract

Objective To investigate the regulatory role and mechanism of long non-coding RNA LASTR in progression of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Methods LASTR expression in HNSCC and its correlation with patient prognosis were analyzed using TCGA and GEO transcriptomic data, and its expression in HNSCC cell lines was validated by qPCR. In a loss-of-function HNSCC cell model with siRNA-mediated LASTR knockdown, the changes in cell proliferation, migration, and invasion were assessed by high-content counting, CCK-8 assay, ATP detection, and Transwell assay. Bioinformatic analysis was conducted to identify the target genes of LASTR, and their interactions with BCAM were verified by qPCR and immunoblotting. The LASTR-miR-4476-BCAM regulatory axis was confirmed with RNA pulldown and dual-luciferase assays. The functional role of BCAM was investigated, and rescue experiments were performed to determine if BCAM mediates the effects of LASTR expression modulation. Results LASTR was significantly upregulated in HNSCC tissues and cell lines, and its high expression was significantly correlated with poor patient prognosis. In HNSCC cells, LASTR knockdown significantly suppressed cell proliferation, migration, and invasion. Bioinformatic analysis revealed 78 candidate target genes of LASTR, enriched in pathways involving angiogenesis, hypoxia response, MAPK, ErbB, and Ras signaling. LASTR knockdown obviously decreased BCAM expression HNSCC cells. Mechanistically, LASTR upregulated BCAM by sequestering miR-4476. BCAM knockdown similarly suppressed malignant phenotypes of HNSCC cells, and its overexpression rescued the inhibitory effects of LASTR knockdown. Conclusion LASTR is upregulated in HNSCC and associated with poor prognosis. High expression of LASTR promotes HNSCC progression by acting as a ceRNA for miR-4476 to upregulate BCAM, suggesting the role of LASTR and BCAM as potential biomarkers and therapeutic targets for HNSCC.

Graphical abstract

关键词

头颈部鳞状细胞癌 / 长链非编码RNA / 血管生成 / 迁移与侵袭 / 促癌基因

Key words

head and neck squamous cell carcinoma / long non-coding RNA / angiogenesis / migration and invasion / oncogene

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球常见恶性肿瘤，多起源于口腔、咽喉等黏膜组织，主要包括口腔鳞癌、喉鳞癌、鼻咽癌等。由于早期症状不典型且缺乏特异性标志物，多数患者确诊时已属中晚期，常伴有淋巴结转移，预后较差^{［1， 2］}。目前治疗以手术和放疗为主，尽管综合治疗有所进展，但晚期患者5年生存率仍低于50%^［3］。因此深入探索其分子机制、寻找新的诊疗靶点具有重要意义。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200 nt的非编码RNA，可通过调控基因表达、表观遗传修饰等方式参与多种生物学过程，在肿瘤发生发展中发挥重要作用^［4-7］。近年研究发现，lncRNA在不同肿瘤中功能各异，既有促癌也有抑癌作用^［8-11］。其中，lncRNA LASTR（SART3调控剪接相关lncRNA）在胃癌、肺癌等多种肿瘤中异常高表达，且与不良预后相关^［12-14］，机制研究发现乳腺癌中LASTR通过控制SART3与小核糖核蛋白U4和U6结合促进剪接效率^［15］。此外，LASTR可通过调节miR-137/TGFA轴激活PI3K/AKT信号通路促进肺癌恶性进展^［16］。然而，LASTR在HNSCC中的表达、功能及机制尚未明确。基底细胞黏附分子（BCAM）是层粘连蛋白α5亚基的受体，在卵巢癌、肺癌、乳腺癌及HNSCC等多种肿瘤中表达升高^［17-19］，但其在HNSCC中的具体作用及机制仍有待阐明。

前期通过生物信息学分析发现，LASTR在HNSCC中表达显著上调。本研究结合生物信息学与实验验证，系统探讨LASTR在HNSCC中的表达模式、生物学功能及其通过调控BCAM影响HNSCC恶性进展的分子机制，以期为HNSCC的早期诊断和靶向治疗提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞与主要试剂

人舌鳞癌细胞CAL-27（中国典型培养物保藏中心）；人咽鳞癌细胞Detroit 562（中国科学院上海细胞库）；人喉鳞癌细胞TU177（西安基恩科生物科技有限公司）；人咽鳞癌细胞FaDu、人喉鳞癌细胞TU686、人口腔鳞癌细胞WSU-HN30、人正常口腔角质细胞HOK为（本实验室保存）；青-链霉素（×100）、DMEM高糖培养基、MEM培养基、TRIzol、Lipofectamine 3000转染试剂（Gibco）；胎牛血清［三叶兴科生物科技（深圳）有限公司］；BCA蛋白浓度检测试剂盒、PVDF膜、ECL化学发光试剂盒、结晶紫染色液（北京索莱宝科技有限公司）； PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）；CCK-8试剂盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒（Promega）；BCAM抗体、GAPDH抗体抗体（Proteintech）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人正常口腔角质细胞HOK、人舌鳞癌细胞CAL-27、人口腔鳞癌细胞WSU-HN30、人喉鳞癌细胞TU686和TU177使用DMEM高糖培养基培养。人咽鳞癌细胞Detroit 562、FaDu使用MEM培养基培养；完全培养基含90%基础培养基、10%胎牛血清、1%青-链霉素，细胞于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱内培养，汇合度80%~90%时传代。

1.2.2 生物信息学分析

头颈鳞癌中LASTR、BCAM的表达情况及其与患者生存的相关性用在线数据库GEPIA（http：//gepia.cancer-pku. cn/）。LASTR靶基因预测方法：利用lncTar软件预测LASTR潜在结合的miRNA，再使用miRanda、miRWalk 2.0、miRDB分别预测miRNA的靶基因，将以上软件预测的靶基因取交集，获得每个miRNA的候选靶基因。LASTR潜在结合miRNA的候选靶基因取并集，即获得预测的LASTR靶基因。TCGA数据库头颈鳞癌转录组测序数据分析获得在头颈鳞癌组织中表达上调2倍以上的基因。将预测的LASTR靶基因和头颈鳞癌组织中表达上调2倍以上的基因取交集，获得78个交集基因，命名为LASTR候选靶基因。LncTar软件设计筛选阈值为ndG<-2，miRanda软件设计筛选阈值为Tot Energy（kCal/Mol）<-20，IntaRNA筛选阈值为E<=-15。TargetScan（http：//www.targetscan.org/）、miRWalk 2.0（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）和miRDB（http：//mirdb.org/）数据库联合预测目标miRNA分子的候选靶基因mRNA TargetScan数据库筛选阈值设置为Total context++ score≤-0.1；miRWalk 2.0数据库筛选阈值设置为energy≤-5；miRDB数据库筛选阈值设置为Target Score≥20。

1.2.3 小干扰RNA（siRNA）及qPCR引物

本研究使用的siRNA序列和引物序列分别由上海吉玛生物科技有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1-2）。

1.2.4 载体构建及细胞转染

BCAM过表达载体（BCAM-OE）、LASTR过表达载体（LASTR-OE）、BCAM 3' UTR 双荧光素酶报告载体由深圳基恩科生物科技有限公司构建。siRNA及质粒转染使用Lipofectamine 3000转染试剂（Invitrogen）按照厂家说明书进行。

1.2.5 Western blotting实验

PBS洗涤并收集细胞，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清分离获取细胞总蛋白。BCA蛋白定量，SDS-PAGE分离蛋白质，将电泳分离的蛋白质湿转印至PVDF膜上。转印膜经封闭、一抗孵育（BCAM抗体，1∶1000；GAPDH抗体，1∶5000）、TBST洗涤、二抗孵育、TBST洗涤，用ECL发光试剂盒进行显影，并用化学发光成像系统拍照记录。

1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期细胞，以1000/孔接种于96孔板。细胞转染24 h后记为0 h，分别于0、24、48、72和96 h 向不同处理组细胞中加入CCK-8试剂（10 μL/孔），37 ℃避光孵育2 h，采用多功能酶标仪测定吸光度A_{450 nm}，并计算各组细胞的相对活力，绘制生长曲线。

1.2.7 Transwell细胞迁移实验

细胞转染24 h 后，胰酶消化，无血清培养液重悬细胞，以5×10⁴/室接种Transwell上室，上室使用无血清培养基，下室使用含20% FBS的培养基。细胞培养24 h后，取出上室，4%的多聚甲醛固定细胞30 min 后，用0.1% 的结晶紫对细胞进行染色。棉签擦除附着在上室中的细胞，显微镜拍照记录细胞的迁移情况。

1.2.8 实时荧光定量PCR（qPCR）实验

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，并根据说明书使用逆转录试剂盒合成cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq II试剂盒进行qPCR反应，采用2^-∆∆Ct法计算RNA的相对表达量。

1.2.9 Transwell细胞侵袭实验

采用Matrigel基质胶（Corning）包被的Transwell小室进行细胞侵袭检测。以1∶3的比例用无血清培养基稀释基质胶，取100 μL稀释好的基质胶铺于Transwell上室，于培养箱中静置孵育2~3 h，待其凝固后，取1×10⁵个待检测细胞接种于上室，用无血清的细胞培养基进行上室培养，下室加入含20% FBS的培养基。细胞培养24 h 后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%的结晶紫对细胞进行染色，棉签去除上室细胞，显微镜下拍照记录细胞侵袭情况。

1.2.10 细胞活力检测

使用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay试剂盒检测细胞活力。该试剂盒通过检测细胞内ATP含量来反映细胞活力。将细胞按照2000 /孔接种96孔板，24 h后分组进行处理。将CellTiter-Glo试剂室温平衡。加入与培养基等体积的CellTiter-Glo试剂，摇动培养板2 min以裂解细胞，室温静置10 min，酶标仪测量发光信号。

1.2.11 高内涵系统检测细胞增殖

在黑色透明底的96孔板中按照1000/孔接种细胞，24 h后分组进行处理。各分组细胞于处理后24 h开始，使用ImageXpress® Micro 4高内涵系统进行扫描和自动计数细胞，统计学分析组间细胞数量差异。

1.2.12 RNA pulldown实验

采用生物素标记的LASTR探针（深圳基恩科生物科技有限公司设计和合成）进行RNA pulldown实验。操作步骤如下：使用添加蛋白酶抑制剂和1 U/μL RNA酶抑制剂（Thermofisher）的IP裂解液，冰上裂解细胞30 min；随后对裂解液进行超声破碎2 min，超声参数为工作10 s/暂停10 s循环；取30 μL链霉亲和素磁珠（Merck）与裂解液混合，于4 ℃条件下旋转预洗1 h；向预洗后的裂解液中加入生物素标记的 LASTR探针或阴性对照（NC）探针，4 ℃孵育过夜；加入30 μL链霉亲和素磁珠，37 ℃孵育1 h；用1 mL IP裂解液洗涤磁珠-探针-蛋白复合物6次；最后提取结合在磁珠上的总RNA，通过qPCR检测LASTR及miRNA的富集水平。

1.2.13 双荧光素酶报告分析实验

野生型和 miR-4476结合位点突变的BCAM 3' UTR荧光素酶报告载体、miR-4476 mimics、NC mimics由深圳基恩科生物科技有限公司合成。荧光素酶报告分析实验在TU177细胞中进行。荧光素酶报告载体分别与miR-4476 mimics或NC mimics共转染细胞48 h。随后使用双荧光素酶报告系统（Promega）于Spectra Max i3x多功能酶标仪（Molecular Devices）上检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。所有数据以均数±标准差表示。两组比较采用未配对t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LASTR在头颈鳞癌中表达显著上调并与患者生存负相关

TCGA数据库转录组测序数据分析显示：LASTR在肾上腺皮质癌（ACC）等21种癌组织中表达水平高于正常对照组织（图1A）。头颈鳞癌组织LASTR表达水平高于正常对照组织（P<0.01，图1B）。GEO数据库喉鳞癌和配对癌旁正常黏膜组织转录组测序数据^［20］分析显示，喉鳞癌组织LASTR表达水平高于癌旁正常黏膜组织（P<0.01，图1C）。TCGA数据库头颈鳞癌转录组数据和患者随访数据Kaplan-Meier生存分析显示，LASTR高表达组患者总体生存时间短于低表达组（P<0.05，图1D）。qPCR结果显示：头颈鳞癌细胞系（TU686、TU177、FaDu、CAL-27、WSU-HN30、Detroit 562）LASTR表达水平高于正常对照细胞HOK，其中TU177细胞LASTR表达水平最高，CAL-27次之（P< 0.05，图1E）。

2.2 敲降LASTR抑制头颈鳞癌细胞增殖能力

本研究设计合成了3条靶向LASTR的siRNA序列，转染头颈鳞癌细胞TU177和CAL-27后，qPCR检测LASTR表达水平。结果显示：与阴性对照组（si-NC）相比，转染靶向LASTR siRNA（si-LASTR-1、si-LASTR-2、si-LASTR-3）的细胞LASTR表达水平降低70%以上，其中si-LASTR-1和si-LASTR-3敲降效率高于si-LASTR-2（P<0.05，图2A、B）。因此，选择si-LASTR-1和si-LASTR-3进行后续研究。CCK-8实验结果显示：敲降LASTR抑制头颈鳞癌细胞增殖能力（P<0.05，图2C、D）。高内涵细胞分析显示：LASTR敲降的TU177和CAL-27细胞增殖能力低于阴性对照组（P<0.05，图2E、F）。本研究利用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay实验检测头颈鳞癌细胞活力。结果显示，敲降LASTR的头颈鳞癌细胞活力低于阴性对照组（P<0.01，图2G、H）。

2.3 敲降LASTR抑制头颈鳞癌细胞迁移和侵袭能力

Transwell迁移结果显示：敲降LASTR的TU177细胞穿过微孔膜的数量少于对照组（P<0.01，图3A）；敲降LASTR的CAL-27细胞穿过微孔膜的数量亦少于对照组（P<0.01图3A）。Transwell侵袭结果显示：敲降LASTR的TU177细胞穿过微孔膜的数量少于对照组（P<0.01，图3B）；敲降LASTR的CAL-27细胞穿过微孔膜的数量也少于对照组（P<0.05或P<0.01，图3B）。

2.4 LASTR促进癌基因BCAM表达

KEGG分析结果显示：LASTR候选靶基因富集于MAPK信号通路、甲型流感、肾细胞癌、ErbB信号通路、类风湿性关节炎、Ras信号通路（图4B）。GO富集分析结果显示：LASTR候选靶基因主要参与血管生成、萌芽血管生成、血管生成正向调节、低氧应答、血管内皮生长因子受体信号通路、ERK1 和 ERK2 级联反应的正向调节、胞内信号转导、病毒应答、细胞群增殖的正向调节、肽基酪氨酸磷酸化等生物过程（图4C）。因此，本研究对BCAM进行了验证。qPCR结果显示：敲降LASTR的TU177细胞BCAM表达水平低于对照组（P<0.01，图4D）；同样，敲降LASTR的CAL-27细胞BCAM表达水平低于对照组（P<0.01，图4E）。Western blotting结果显示：与对照组相比，敲降LASTR导致头颈鳞癌细胞BCAM蛋白表达水平降低（图4F）。

2.5 LASTR通过特异性结合miR-4476上调BCAM表达水平

RNA pulldown实验结果显示：与阴性对照探针相比，LASTR探针能够显著富集miR-4476、miR-6071、miR-6740-3p，其中miR-4476富集程度最高（P<0.05，图5A）。qPCR结果显示：过表达LASTR的头颈鳞癌细胞miR-4476表达水平低于对照细胞（图P<0.01，5B）；相反，敲降LASTR的头颈鳞癌细胞miR-4476表达水平高于对照细胞（P<0.05，图5C）。双荧光素酶报告分析结果显示：与对照组相比，过表达miR-4476显著降低野生型BCAM 3' UTR荧光素酶报告载体荧光素酶活性（P<0.01，图5D），而对miR-4476结合位点突变的报告载体荧光素酶活性无显著影响（P＞0.05，图5D）。qPCR和WB结果显示：过表达miR-4476抑制TU177和CAL-27细胞BCAM表达水平（P<0.01，图5E，F）。Rescue实验结果显示，过表达LASTR能够逆转miR-4476对BCAM表达水平的抑制作用（图5G）。

2.6 BCAM在头颈鳞癌中发挥促癌基因功能

TCGA数据库头颈鳞癌转录组测序数据分析显示：头颈鳞癌组织中BCAM表达水平高于正常对照组织（P<0.01，图6A）。GEO数据分析结果显示：喉鳞癌组织BCAM表达水平高于癌旁正常黏膜组织（P<0.01，图6B）。生存分析结果显示：BCAM高表达与头颈鳞癌患者预后不良显著相关（P<0.05，图6C）。本研究通过转染靶向BCAM的siRNA降低头颈鳞癌细胞BCAM表达水平。qPCR结果显示：转染siRNA的TU177（P<0.01，图6D）和CAL-27（P<0.01，图6E）细胞BCAM表达水平显著降低。Western blotting结果证实BCAM蛋白水平降低（图6F）。细胞功能实验结果显示：敲降BCAM导致TU177和CAL-27细胞增殖能力降低（P<0.05，图6G、H）。Transwell实验结果显示：与对照组相比，敲降BCAM抑制TU177（P<0.01，图6I）和CAL-27（P<0.01，图6I）细胞迁移能力（图6I）。敲降BCAM的TU177和CAL-27（P<0.01）细胞侵袭能力亦降低（图6J）。

2.7 LASTR通过上调BCAM表达水平促进头颈鳞癌细胞恶性表型

头颈鳞癌细胞分别设置对照组、敲降LASTR组（si-LASTR）、过表达BCAM组（BCAM-OE）、敲降LASTR同时过表达BCAM组（si-LASTR+BCAM-OE）。qPCR和Western blotting实验结果显示，以上各组细胞BCAM表达水平发生预期变化（图7A~C）。细胞功能实验结果显示：敲降LASTR的TU177和CAL-27细胞增殖能力低于对照组（P<0.05，图7D、E），而过表达BCAM的细胞增殖能力升高（P<0.05，图7D、E）。与敲降LASTR组相比，敲降LASTR同时过表达BCAM组增殖能力升高（P<0.05，图7D、E）。Transwell结果显示：与敲降LASTR组相比，敲降LASTR同时过表达BCAM组TU177（P<0.01）和CAL-27（P<0.05）细胞迁移能力升高（图7F）；同样，与敲降LASTR组相比，敲降LASTR同时过表达BCAM组TU177（P<0.01）和CAL-27（P<0.01）细胞侵袭能力升高（图7G）。

3 讨论

LASTR基因位于人10号染色体10p15.1，转录本长度713 nt。通过分析TCGA数据库胃腺癌RNA测序和体细胞突变数据，Luo等^［21］建立了LASTR等坏死相关lncRNA组成的预后标志物组合（12-NRLs）。Kaplan-Meier生存曲线与ROC曲线显示，12-NRLs在TCGA训练集和测试集中具有可接受的预测效能。COX回归分析和分层生存分析表明，12-NRLs是独立于多种临床参数的风险因素。此外，不同风险亚型间的免疫细胞浸润、免疫检查点分子、体细胞基因突变及半数抑制浓度存在显著差异，提示包含LASTR的标志物组合可用于评估化疗和免疫治疗的临床疗效。此外，Liu等^［14］利用TCGA胃癌RNA测序数据鉴定参与肿瘤进展的铁死亡相关差异表达lncRNA，发现LASTR在胃癌样本中的表达水平高于非肿瘤标本，而且LASTR高表达与胃癌患者的总生存期和无进展生存期缩短相关。功能缺失实验显示，敲降LASTR可显著降低胃癌细胞的增殖能力。以上研究表明LASTR不仅与肿瘤发生发展密切相关，而且可能影响肿瘤免疫和化疗敏感性。然而，LASTR在头颈鳞癌中的表达模式、临床意义、生物学功能、分子机制未见相关报道。

本研究首次分析了头颈鳞癌中LASTR的表达情况和临床意义。通过TCGA和GEO数据库转录组数据分析，我们发现头颈鳞癌组织中LASTR表达水平高于正常对照组织，而且LASTR高表达与头颈鳞癌患者预后不良显著相关。此外，本研究发现头颈鳞癌细胞系LASTR表达水平高于正常对照细胞系。肿瘤组织中表达上调的lncRNA通常具有促癌功能。因此，以上提示LASTR可能在头颈鳞癌恶性进展中发挥重要调控作用。细胞功能实验结果显示，敲降LASTR的头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力降低，表明LASTR能够促进头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

为研究LASTR促进头颈鳞癌恶性表型的机制，我们结合头颈鳞癌转录组测序数据分析其可能调控的下游靶基因和信号通路。发现LASTR的潜在靶基因主要富集于血管生成、低氧应答等生物过程，以及MAPK信号通路、Ras信号通路等。研究表明，以上生物过程和信号通路调控紊乱是导致头颈鳞癌恶性进展的重要原因^［22-25］。因此，我们推测LASTR可能通过调节这些生物过程和信号通路来改变头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭表型。值得注意的是，本研究首次鉴定并验证了LASTR的靶基因BCAM，揭示了LASTR作为miRNA海绵特异性结合miR-4476，从而促进头颈鳞癌细胞BCAM表达的分子机制。

BCAM基因编码 Lutheran血型糖蛋白，其编码蛋白是免疫球蛋白超家族成员，同时也是细胞外基质蛋白层粘连蛋白α5的受体。该蛋白包含5个胞外免疫球蛋白结构域、1个跨膜结构域和1个短的C端胞质尾^［26］。BCAM基因已被证明在结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤中发挥重要的调控作用^{［18， 27］}。近期研究发现，BCAM促进多种细胞因子的分泌，包括AREG、CXCL趋化因子家族成员、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、转化生长因子β2（TGFB2）和血管内皮生长因子（VEGF）。此外，研究结果证明BCAM 在体外可诱导内皮管形成，并在小鼠模型中显著促进肿瘤血管生成^［17］。血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤^{［28， 29］}。头颈鳞癌高度表达血管生成因子，如血管内皮生长因子VEGF，这些因子与患者预后相关。抗血管生成药物可能调节肿瘤微环境，并诱导放射敏感性和化学敏感性^［30-32］。因此，以上结果提示BCAM可能通过调节血管生成影响肿瘤细胞恶性进展。但是，BCAM在头颈鳞癌中的生物学功能尚未见报道。

本研究通过分析TCGA转录组数据，首次发现BCAM在头颈鳞癌中表达水平显著上调，提示其可能在头颈鳞癌发生和进展过程中发挥重要调控作用。细胞功能实验进一步证明，敲降BCAM抑制头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，表明BCAM在头颈鳞癌中发挥促癌基因功能。Rescue实验发现，过表达BCAM能够逆转敲降LASTR对头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用，表明LASTR主要通过上调BCAM表达水平促进头颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型。这些发现不仅为头颈鳞癌的分子机制研究提供了新的视角，也为LASTR及其靶基因BCAM作为头颈鳞癌诊断标志物和治疗靶点提供了理论依据。然而，本研究仍存在一定局限性。尽管本研究揭示了LASTR可能通过结合miR-4476促进BCAM表达影响头颈鳞癌进展，但是否存在其他机制的协同调控仍需深入探索。

综上，本研究首次对LASTR在头颈鳞癌中的表达模式、生物学功能、潜在作用机制进行了探究。发现头颈鳞癌中LASTR表达水平上调并与患者生存时间显著负相关。揭示了LASTR通过特异性结合miR-4476上调靶基因BCAM表达水平，从而促进头颈鳞癌细胞恶性进展的分子机制，为头颈鳞癌临床诊断和分子靶向治疗提供新的潜在标志物和重要思路。

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