健脾滋肾方改善系统性红斑狼疮小鼠肾损害：基于p53-MDM2信号轴介导的铁死亡

Jianpi Zishen Formula improves renal damage in mice with systemic lupus erythematosus by inhibiting p53-MDM2 signaling axis-mediated ferroptosis

摘要

目的 基于鼠p53-双微体基因2（MDM2）信号轴探讨健脾滋肾方对系统性红斑狼疮（SLE）小鼠肾损害铁死亡的影响和治疗作用。 方法 30只SPF级MRL/lpr狼疮鼠采用随机对照表法分为模型（Model）组、健脾滋肾方（JPZS）组、泼尼松（Pred）组。另取10只C57BL/6小鼠为正常对照（Control）组。健脾滋肾方组予以JPZS悬液7.8 g·kg^-1·d^-1、泼尼松组予以泼尼松悬液5 mg·kg^-1·d^-1，正常对照组及模型组予生理盐水17.5 mL·kg^-1·d^-1，灌胃给予相应剂量药物，连续用药8周后取材监测。酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清抗双链DNA抗体（anti-ds DNA）；自动生化分析仪检测补体3（C3）、血肌酐（Scr）；考马斯亮蓝（CBB）法检测24 h尿蛋白（24 hPRO）含量；比色法检测肾组织铁离子（Fe²⁺）含量；硫代巴比妥酸法（TBA）检测丙二醛（MDA）、WST-1法测定超氧化物歧化酶（SOD）、微板法测定微量还原型谷胱甘肽（GSH）水平；流式检测肾组织ROS水平；组织病理学染色（HE、Masson、PAS）法观察肾组织病理学改变及定量分析；透射电子显微镜下观察肾脏足细胞线粒体形态变化；实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）检测p53、MDM2、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤2蛋白（Bcl-2）和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase-3） mRNA的表达情况。蛋白质印迹法检测GPX4、SLC7A11、ACSL4、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。 结果 与Control组相比，Model组dsDNA、Scr、24hPRO、Fe²⁺、MDA、ROS水平、p53、MDM2 mRNA表达水平、ACSL4、Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），C3、SOD、GSH水平、GPX4、SLC7A11、Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平显著下降（P<0.05）；与Model组相比，JPZS、Pred组dsDNA、Scr、24hPRO、Fe²⁺、MDA、ROS水平、p53、MDM2 mRNA表达水平、ACSL4、Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平均显著降低（P<0.01），C3、SOD、GSH水平、GPX4、SLC7A11、Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。 结论 健脾滋肾方能够明显降低狼疮小鼠肾组织铁死亡水平，改善肾损害、修复肾功能，其机制或与抑制p53-MDM2信号轴有关；结合足细胞线粒体超微结构异常呈一致性改变，这一过程可能与肾小球足细胞相关的铁死亡损伤密切相关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Jianpi Ziren Formula (JPZS) for ameliorating renal injury in mice with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Thirty MRL/lpr lupus mice were randomly divided into model group, JPZS treatment group, and prednisone treatment group, with 10 C57BL/6 mice as the control group. After treatment with daily gavage with normal saline, JPZS (7.8 g/kg) or prednisone (5 mg/kg) for 8 consecutive weeks, the mice were examined for changes in serum levels of anti-ds DNA, C3 and Scr, 24-h urine protein (24hPRO) and renal Fe²⁺ content, MDA level, SOD activity, GSH level, and ROS level. Renal histopathological changes and ultrastructural changes were observed with HE staining and transmission electron microscopy. The changes in renal expressions of p53, MDM2, GPX4, SLC7A11, ACSL4, Bax, Bcl-2, and caspase-3 mRNAs and proteins were detected using RT-qPCR and Western blotting. Results Compared with the normal control mice, the mouse models of SLE had significantly elevated levels of dsDNA, Scr, 24hPRO, Fe²⁺, MDA, and ROS, increased renal expressions of p53, MDM2, ACSL4, Bax, and caspase-3, lowered levels of C3, SOD, and GSH, and reduced renal expressions of GPX4, SLC7A11, and Bcl-2 at both the mRNA and protein levels. Treatment with JPZS and prednisone both significantly ameliorated these abnormalities in the mouse models. Conclusion JPZS can reduce renal ferroptosis in lupus mice, ameliorate kidney injury, and promote renal function repair possibly by inhibiting the p53-MDM2 signaling axis, which is closely associated with regulation of glomerular podocyte ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

系统性红斑狼疮 / 肾损害 / 健脾滋肾方 / 铁死亡 / p53-MDM2信号轴

Key words

systemic lupus erythematosus / kidney damage / Jianpi Zishen Formula / ferroptosis / p53-MDM2 signaling axis

系统性红斑狼疮（SLE）是自身免疫介导的以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，常累及肾脏，继而发展为狼疮肾炎（LN），足细胞功能障碍或损伤是SLE肾损害最为重要的原因^［1-3］。狼疮性肾炎是SLE最常见的终末器官表现，影响多达40%的成人和80%的儿童SLE，是发病和死亡的主要原因^［4］。目前SLE肾脏损害病因及发病机制尚未明确，现有的治疗药物如糖皮质激素、生物制剂、免疫抑制剂等虽暂时控制病情发展，但其长期使用带来的副作用仍不可忽视。健脾滋肾方（专利号：ZL202011227827.8）为我院特色医院制剂，能够发挥多中心、多靶点的作用，前期研究已证明其临床应用多年疗效显著^{［5， 6］}，但其具体作用机制仍需要进一步探讨。

p53是哺乳动物细胞中的一种重要的抑癌因子，其降解方式是E3泛素连接酶鼠双微体基因2（MDM2）调控的靶向降解。p53结合蛋白MDM2是一种E3泛素连接酶，其在细胞周期阻滞、衰老、DNA修复和细胞程序性死亡中发挥着关键的作用^［7］。有研究发现p53能够显著抑制铁死亡的关键调节因子的表达，介导下游铁死亡通路干预组织细胞损伤，可作为与铁死亡关键代谢过程相关的疾病治疗的新靶点^{［8， 9］}。在小鼠模型体内发现抑制p53/溶质载体家族7成员11（SLC7A11）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通路介导的铁死亡可以明显改善肾损伤；MDM2增加了p53泛素化以激活铁死亡调控因子SLC7A11，加快线粒体损伤，影响细胞程序性死亡^［10-12］。铁死亡是一种调节性细胞死亡方式，有研究证据表明，肾小球损伤是LN的主要原因，足细胞损伤和细胞凋亡是肾小球疾病的关键因素，通过抑制铁死亡可以减轻肾损伤^［13］。而健脾滋肾方中多种活性成分对SLE累及肾脏损害具有明显的改善作用^［14］，因此其改善SLE肾损害的机制是否与调节p53-MDM2信号轴介导的肾组织铁死亡有关还需要进一步验证。本研究基于MRL/lpr小鼠模型，旨在探究健脾滋肾方是否通过抑制p53-MDM2信号轴表达，降低肾组织铁死亡水平，改善狼疮小鼠肾损害，以期为临床治疗SLE肾损害提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级，MRL/lpr狼疮鼠30 只，C57BL/6小鼠10 只［上海斯莱克实验动物有限责任公司scxk（沪）2022-0004，合格证号：20220004064200、20220004064201］。饲养于合肥综合性国家科学中心人工智能研究院动物实验平台SPF级动物房中，采用专用的灭菌饲料进行喂养，自由饮水，适应性喂养1周后开始实验。实验前根据MRL/lpr狼疮鼠抗双链DNA抗体水平升高、补体3/4下降，24 h尿蛋白、肌酐升高等特征确认小鼠已呈现典型狼疮表型。所有操作均经过安徽中医药大学伦理委员会批准（伦理批号：AHUCM-mouse-2022130）。

1.1.2 药品

健脾滋肾方（即芪黄健脾滋肾颗粒组成：黄芪、熟地黄、菟丝子、山药、茯苓、白术、覆盆子、金樱子，皖药制备字20220041000，批号：20240610，安徽中医药大学第一附属医院院内制剂）；醋酸泼尼松片（5 mg/片，国药准字H12020689，天津药药业股份有限公司），将泼尼松片研磨成粉末后，加入生理盐水制备成浓度为泼尼松混悬液，折算成小鼠药物剂量为5 mg·kg^-1·d^-1。

1.1.3 试剂

总超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、微量还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（厂家：南京建成生物，批号分别为A001-3 & 20240113、A003-1 & 20240115、A006-2-1 & 20240118）；TRIzol（Life technogies，15596018）、Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（novoprotein，E096-01B）、反转录试剂盒（TaKaRa，RR047A）和引物合成（Sangon Biotech）；B细胞淋巴瘤2蛋白（Bcl-2）、GPX4、SLC7A11（bioss）；Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase-3）、长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）（abcam）。

1.1.4 仪器

酶标仪（雷杜，RT-6100）、紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司，UV-1800）、漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司，GL-88B）、移液器0.5~10 μL、200 μL、1000 μL、排枪50-300ul（eppendorf）、电热恒温箱（上海三发，DNP-9052BS-Ⅲ）、荧光定量PCR仪（Thermo Scientific，PIKOREAL 96）、高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-3021HR）、转膜仪（Tanon，VE-186）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药方法

30 只SPF级MRL/lpr狼疮鼠采用随机对照表随机分为模型（Model）组、健脾滋肾方（JPZS）组、泼尼松（Pred）组。另取10 只C57BL/6小鼠为正常对照（Control）组。JPZS组予以JPZS悬液^［15］7.9 g·kg^-1·d^-1、泼尼松组予以泼尼松悬液5 mg·kg^-1·d^-1、正常对照组及模型组予生理盐水17.5 mL·kg^-1·d^-1灌胃，连续用药8 周后取材监测。

1.2.2 MRL/lpr狼疮鼠免疫学指标和肾功能相关指标的检测

摘除各组小鼠眼球留取全血，离心机上3000 r/min 离心10 min 取血清标本，冻存管分装后于-80 ℃超低温冰箱保存，酶联免疫吸附法（ELISA）检测anti-ds DNA的含量；全自动生化分析仪检测血肌酐（Scr）、补体3（C3）的水平。用代谢笼收集用药前和末次用药后24 h尿液，使用考马斯亮蓝（CBB）法检测各组小鼠24 h尿蛋白（24hPRO）含量，具体操作严格按照PRO测定试剂盒说明书进行。

1.2.3 肾脏组织Fe²⁺浓度及氧化指标的检测

取小鼠新鲜肾脏皮质组织，RIPA裂解匀浆0.5 h，通过差异过筛的方法获得肾足细胞，玻璃匀浆器置冰上研磨后，预冷PBS洗涤3次，制备10%组织匀浆，12 000 r/min离心15 min，离心半径13 cm，取上清提取总蛋白。用酶标仪测定吸光度A_{593 nm}，计算Fe²⁺浓度；硫代巴比妥酸法（TBA）检测MDA，使用酶标仪测定吸光度A_{532 nm}；WST-1法测定SOD，酶标仪于450 nm处进行测定；微板法测定GSH，酶标仪于405 nm处比色定量测定，具体方法参考试剂盒说明书。肾皮质组织剪碎后经Ⅰ型胶原酶消化10~15 min，过滤（70 μm滤网）得单细胞悬液，加入10 μm DCFH-DA探针，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，立即上机流式检测ROS水平，用FlowJo分析FITC通道荧光强度（MFI）。

1.2.4 苏木素-伊红（HE）、马松（Masson）染色、PAS染色观察肾组织病理学改变

HE染色：肾脏组织切片放入干燥箱65 ℃烤片30 min，依次过3道二甲苯，每道5 min；依次过3道（100%-95%-80%）乙醇，每道3 min；将切片放入烧杯中，流水缓慢冲洗，洗去乙醇，直到切片干净透明，再将切片入苏木素浸染2~5 min，流水冲洗干净后，用1%盐酸酒精分化数秒，流水冲洗干净，再用饱和碳酸锂溶液蓝化数秒，流水冲洗干净。将切片入95%乙醇脱水2 min，上下晃动几次，再入伊红染液（醇溶性）浸染数秒，依次过2道95%乙醇，5~10 s/道，时间不宜过长，再依次过2道100%乙醇脱水，1 min/道，再依次过苯酚-二甲苯、二甲苯I、II透明，2 min/道。最后用中性树胶封片，显微镜观察结果。在显微镜下观察结果和记录，并对肾小球进行组织病理学评分^［16］。

Masson染色：肾脏组织切片常规脱蜡至水，画疏水圈，并滴加Bouin液，加盖置于37℃培养箱孵育，后用流水冲洗至切片上的黄色消失，再使用天青石蓝染色液滴染3~5 min，稍水洗；Mayer苏木素染色液滴染3 min，稍水洗；酸性乙醇分化液分化数秒，流水冲洗干净；丽春红品红染色液滴染5~10 min，蒸馏水稍冲洗。后使用磷钼酸溶液处理5~10 min，倾去上液，切片不用水洗，直接滴加苯胺蓝染色液染5 min，再使用弱酸溶液稍处理；常规脱水，二甲苯透明。最后用中性树胶封片，显微镜观察结果。随机选择每只动物肾皮质5个高倍视野（×200），使用ImageJ软件进行定量分析。

PAS染色：肾脏组织切片常规脱蜡至水，画疏水圈，再用氧化剂处理5~10 min，流水冲洗干净，甩去切片上多余水分。后滴加Schiff染液，加盖置于37 ℃培养箱孵育，再用流水清洗干净，苏木素复染切片2~5 min，分化10 s，水洗；返蓝10 s，水洗；常规脱水，二甲苯透明。最后用中性树胶封片，显微镜观察结果。系膜基质分数的计算方法：系膜区PAS阳性面积/肾小球总面积×100%，使用ImageJ软件进行定量分析。

1.2.5 透射电子显微镜下观察肾脏足细胞形态变化

将1 mm³组织若干块立刻固定到2.5%戊二醛中24 h，把固定液倒入PBS缓冲液6 h，放入1%锇酸后固定2 h。用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇醋酸铀（包埋前染色）3 h或过夜、80%乙醇、8.95%乙醇、100%乙醇两次50 min、环氧丙烷脱水处理。纯环氧树脂包埋后入烤箱，后进行超薄切片（片厚70 nm，切片机型号为leica UC-7），铜网捞片。电子染色后（铅染色）用日本电子透射电镜拍照。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测p53、MDM2、GPX4、SLC7A11、ACSL4和Caspase-3 mRNA的表达情况

取50~100 mg肾脏组织用TRIzol法对RNA提取；在RT反应中，EP管中去除基因组DNA反应，离心，PCR仪中加热42 ℃ 2 min再冰浴1 min，EP管中加入反应液（37 ℃，15 min；85 ℃，5 s），取出，即cDNA，-80 ℃保存备用；PCR反应在反应体系10 μL中进行，条件如下：95 ℃预变性1 min， 变性95 ℃ 20 s， 60 ℃ 1 min， 共40个循环。结果采用Relative Quantification Study分析，计算方法为2^-△△Ct，包括扩增曲线、溶解曲线和相对表达量。各检测指标引物见表1。

1.2.7 Western blotting检测GPX4、SLC7A11、ACSL4、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况

对肾脏组织匀浆及蛋白提取；把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，80 V电泳1 h；按照说明书恒流转膜；进行封闭；孵育一抗：加入兔源GPX4（1∶1000）、SLC7A11（1∶1000）、ACSL4（1∶2000）、Caspase-3（1∶2000）、Bax（1∶5000）、Bcl-2（1∶1000）及鼠源GAPDH（1∶2000），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次；加入HRP标记的对应兔、鼠二抗（1∶20 000）室温孵育1.2 h，PBST漂洗3次；使用ECL发光试剂盒来检测蛋白，使用Image J软件进行灰度分析。

1.2.8 统计学分析

使用GraphPad Prism和Image J软件处理图像，利用软件FlowJo_V10分析流式细胞术结果。本研究以肾足细胞Fe²⁺水平为主要终点指标，参考课题组预实验数据，模型组与JPZS组Fe²⁺平均差异约为1.46 μmol/g，组内标准差σ取0.8。设定显著性水平α=0.05（双侧），检验效能1-β=0.80。按双样本t检验公式计算^［17］，N=2（Z_1-α/2+Z_1-β）²δ²/Δ²每组所需样本量约5 只，考虑10%脱落率需6 只，本研究实际每组均取10 只小鼠（另设正常对照组10 只），样本量高于计算值，能够满足预设80%检验效能要求。采用SPSS 25.0软件对本研究进行统计分析，计量资料符合正态性的描述采用均数±标准差表示，组间检验使用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况

Control组小鼠未见明显异常，24 h尿量稳定；模型组小鼠呼吸频率变快，尿量减少、尿色深；泼尼松组和健脾滋肾组症状较模型组缓解，健脾滋肾组治疗效果最显著。

2.2 各组小鼠肾功能指标和免疫学指标水平

与Control组比较，Model组dsDNA、Scr和24hPRO水平均显著升高（P<0.01），C3水平显著下降（P<0.05）。与Model组相比，JPZS组、Pred组小鼠给药后各检测dsDNA、Scr和24 hPRO水平明显降低（P<0.01），C3水平显著升高（P<0.05，表2）。

2.3 各组小鼠肾组织Fe²⁺、MDA、SOD、GSH水平

与Control组比较，模型组小鼠肾组织Fe²⁺、MDA水平上升，SOD、GSH水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比，Pred组和JPZS组肾组织Fe ²⁺ 、MDA水平降低，SOD、GSH水平明显提高，差异具有统计学意义（P<0.05，表3）。

2.4 各组小鼠肾组织ROS水平比较

与Control组相比，Model组大鼠肾组织ROS水平升高（P<0.01）。与Model组相比，JPZS组和Pred组肾组织ROS表达水平均有不同程度的减低（P<0.01，图1）。

2.5 各组小鼠HE、Masson及PAS染色的肾脏病理学形态结果的比较

各组小鼠肾组织苏木精-伊红染色（HE）、马松染色（Masson）及PAS染色病理学形态结果HE染色及特殊染色显示，与正常组比较，模型组组织结构出现明显异常，存在大量炎症细胞浸润、胶原纤维等的异常沉积，细胞排列紊乱，组织形态发生改变，提示发生病理损伤。JPZS组及Pred组病理改变较Model组有所减轻，组织结构相对Model组更接近正常，细胞排列和形态的异常、炎症细胞浸润、胶原纤维等的异常沉积等情况得到改善，且肾脏病理学评分、纤维化体积分数及系膜基质分数均低于Model组（P<0.01）。

2.6 电镜下各组小鼠肾组织内足细胞形态变化

与Control组比较，Model组可见肾组织内足细胞内线粒体减少，多呈萎缩或肿胀状，线粒体嵴数量减少甚或消失，局部线粒体膜出现断裂；与Model组比较，各给药组肾组织内足细胞线粒体损伤均有不同程度的缓解，JPZS组改善最明显（图3）。

2.7 各组小鼠p53/MDM2信号轴、铁死亡相关基因及细胞凋亡基因的表达情况。

与Control组比较，Model组p53、MDM2、ACSL4、Bax和Caspase-3水平均显著升高（P<0.01），GPX4、SLC7A11及Bcl-2水平显著下降（P<0.01）；与Model组相比，各给药组p53、MDM2、ACSL4、Bax和Caspase-3水平均显著降低（P<0.01），GPX4、SLC7A11及Bcl-2水平显著升高（P<0.05，图4）。

2.8 各组小鼠GPX4、SLC7A11、ACSL4、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况

与Control组比较，Model组GPX4、SLC7A11和Bcl-2水平均显著降低（P<0.05），ACSL4、Caspase-3、Bax水平显著升高（P<0.05）；与Model组相比，JPZS组、Pred组小鼠给药后各检测GPX4、SLC7A11和Bcl-2水平均显著升高（P<0.05），ACSL4、Caspase-3、Bax水平显著降低（P<0.05，表4，图5）。

3 讨论

在狼疮性肾炎患者中，细胞死亡失调和垂死细胞清除缺陷会导致自身抗原的产生、自身抗体的诱导和循环免疫复合体的沉积。多种类型的程序性细胞死亡，如细胞凋亡、焦亡和自噬等参与LN的发病机制^{［18， 19］}。有研究发现铁死亡与SLE肾损害具有密切关系，而足细胞损伤和细胞凋亡是SLE肾损害的关键因素^{［20， 21］}。足细胞可通过巨蛋白-小球蛋白复合体介导的内吞作用摄取血红蛋白和转铁蛋白，并将摄取的铁储存在铁蛋白中参与铁的代谢，当细胞内铁离子过载时，线粒体代谢异常引起足细胞死亡^［22］。LN的肾活检也显示肾小管上皮细胞和远端肾小管细胞、肾小球细胞中存在铁沉积，氧化应激诱导的蛋白血红素加氧酶-1染色呈阳性。

SLE中医可归属于“阴阳毒”范畴。《内经》提及“五脏痹”的概念，SLE累及肾脏，可归属于“肾痹”范畴。其总体病机呈“脾肾亏损为主、瘀毒湿热为因”特征。其中“脾肾亏损”是SLE“肾痹”重要病机。故SLE中医治疗上可从脾肾论治，固本培元。我们前期研究发现，健脾滋肾方对SLE肾脏损害具有良好的治疗作用，能够显著降低SLE患者尿蛋白系列指标^{［23， 24］}。方中黄芪、菟丝子为君药，发挥健脾益气、滋补肾精之效，现代药理研究表明黄芪中含有多种活性成分，具有改善肾脏微循环、降低蛋白尿和保护肾功能的作用，其中黄芪甲苷IV可通过Nrf2轴调节铁死亡通路改善小鼠器官损伤^［25］，黄芪多糖可抑制TGF-β通路抑制慢性肾衰竭大鼠肾纤维化^［26］；菟丝子含有金丝桃苷、槲皮素等活性成分，具有免疫调节的作用，有研究显示槲皮素可以显著降低SLE模型小鼠肾损害指标、肾脏肥大指数以及肾组织病理评分，对SLE肾损害具有显著治疗作用^［27］。熟地黄、山药为臣药辅助君药健脾益肾，熟地多糖等成分可能通过抑制NF-κB信号通路减轻肾脏的氧化应激反应和炎症^［28］；山药多糖等活性成分具有调节代谢、抗氧化的药理作用。覆盆子、金樱子佐用以滋肾填精，二者含有丰富的多糖类、三萜类等有效成分具有保护肾功能、降低尿蛋白的作用^{［29， 30］}。茯苓、白术佐以健脾，茯苓酸可通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号而抑制心肌细胞脂质过氧化与铁死亡，减轻细胞凋亡损伤^［31］；白术含有的白术多糖、白术内酯等成分能够通过抑制肾脏炎症反应、延缓肾组织纤维化、减轻氧化应激反应等多种途径减轻肾组织损伤，发挥肾保护作用^［32］。本研究中，我们通过对肾脏组织切片进行HE、PAS、Masson染色以及透射电子显微镜观察肾足细胞内线粒体，结果显示，健脾滋肾方能够改善MRL/lpr小鼠肾脏免疫复合物沉积和炎症细胞浸润，这表明JPZS具有一定的肾脏保护作用，与既往研究结果一致。

足细胞铁死亡是LN病理的关键因素。铁死亡主要发生在细胞中，其特征是线粒体体积减少，双层膜密度增加，线粒体嵴减少或消失，但细胞膜保持完整，细胞核大小正常，染色质不浓缩^{［33，34］}。当细胞内GSH耗尽且GPX4活性降低时，脂质过氧化物不能通过GPX4催化的还原反应代谢，Fe²⁺以Fenton和Haber Weis样方式氧化脂质，产生大量ROS、MDA并促进铁死亡。而SOD是机体内清除ROS的重要抗氧化酶，维持细胞内氧化-抗氧化系统的平衡，能够减轻氧化应激损伤，研究显示脂质过氧化是铁死亡的一个显著特征，在SLE患者和小鼠模型中均增加，过量的不稳定铁也催化ROS的形成^{［35， 36］}。SLE患者的IgG和抗dsDNA抗体可诱导ROS，通过催化ROS的形成，不稳定的铁可能会加重对IgG和抗dsDNA抗体的炎症反应。由于足细胞对ROS的敏感性高，过量的ROS会导致足细胞的结构和功能发生不可逆的变化，导致铁死亡的发生^［37］。因此，铁诱导的脂质过氧化和炎症反应的加剧可以协同加速肾小球的足细胞的损伤。Scr、尿蛋白均是衡量肾功能的标志物，可直接反映肾损伤程度^［38］。本研究中，与正常组比较，模型组肾功能受损，Fe²⁺、MDA水平升高，SOD和GSH含量降低，肾足细胞内线粒体肿胀破坏明显，这表明SLE小鼠肾组织氧化应激水平增加，发生铁死亡。与model组比较，结果表明健脾滋肾方能够减轻肾组织氧化应激水平，且对铁死亡水平具有一定的抑制作用。

p53-MDM2轴是铁死亡关键调控途径，MDM2-p53平衡是细胞周期调控的核心因素，最近研究发现p53能够显著抑制铁死亡的关键调节因子SLC7A11的表达，p53-MDM2轴可以介导肾足细胞死亡，发挥多种生物学效应^［8］。p53、GPX4和MDM2均是铁死亡相关蛋白，p53-MDM2轴调控线粒体蛋白GSDMD，调节线粒体膜表面脂质活性氧的释放，加快铁死亡进程，造成细胞死亡，MDM2、p53激活铁死亡信号和Caspase依赖性信号传导促进细胞凋亡^{［39， 40］}。本研究中，与正常组比较，模型组p53、MDM2、ACSL4、Caspase-3和Bax水平均显著升高，GPX4、SLC7A11、Bcl-2水平显著下降；这表明在狼疮小鼠肾组织铁死亡发生时p53-MDM2轴处于高表达状态，并进一步促进细胞凋亡。与Model组相比，结果提示健脾滋肾方可能通过抑制p53-MDM2轴的信号传导，增强Gpx4、SLC7A11活性，降低ACSL4表达，改善足细胞铁离子过载，抑制铁死亡过程，从而改善SLE小鼠肾脏损害。

综上，本研究表明健脾滋肾方减轻狼疮小鼠肾脏损害、改善肾功能，可能是通过抑制p53-MDM2轴表达，改善肾组织铁离子过载，从而抑制铁死亡过程。结合足细胞线粒体超微结构异常呈一致性改变，这一过程可能与肾小球足细胞相关的铁死亡损伤密切相关。然而本研究仅通过电镜观察到足细胞铁死亡形态，尚缺乏基于足细胞特异性分选（如 FACS 结合 podocin/nephrin 标记）及纯度验证的直接证据，后续研究将通过足细胞特异性分离、细胞实验进一步验证铁死亡发生的细胞来源，完善此次研究的不足之处。本研究或为临床治疗SLES肾损害提供一定理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金(82574970)

国家自然科学基金(82104782)

安徽省临床医学研究转化专项项目(202304295107020114)

安徽省临床医学研究转化专项项目(202304295107020115)

大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所专项(2023CXMMTCM015)

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