麦冬皂苷D通过激活β-catenin/FUNDC1/线粒体自噬轴减轻阿霉素诱导的小鼠心肌肥厚

Ophiopogonin D alleviates doxorubicin-induced myocardial hypertrophy in mice by activating the β-catenin/FUNDC1/mitophagy axis

摘要

目的 探讨麦冬皂苷D（OD）是否通过调控β-catenin/FUNDC1/线粒体自噬信号轴减轻阿霉素（Dox）诱导的心肌肥厚。 方法 通过Dox诱导心肌肥厚，分组如下：对照组，Dox刺激组，Dox刺激+OD治疗组，Dox刺激+感染AAV-β-catenin组，Dox刺激+感染AAV（腺相关病毒载体）组。细胞RNA测序分析Dox刺激组与对照组基因表达差异；Western blotting检测β-catenin，活化β-catenin，FUNDC1，LC3，p62，β-MHC（β肌球蛋白重链），α-actin；免疫组化/荧光检测β-catenin，FUNDC1；透射电镜检测线粒体损伤；染色质免疫共沉淀（ChIP）及双荧光素酶报告基因检测β-catenin对FUNDC1的转录调节作用。 结果 相比对照组，Dox刺激显著抑制β-catenin信号（P<0.001）和FUNDC1介导的线粒体自噬（P<0.001），导致线粒体损伤和心肌细胞肥大（P<0.001）。相比Dox组，OD处理可逆转上述效应，恢复β-catenin信号（P<0.001），增强FUNDC1转录与表达（P<0.001），并促进线粒体自噬，减轻心肌肥厚（P<0.001）。过表达β-catenin或FUNDC1均模拟了OD的心肌保护作用，而敲低β-catenin则加重心肌肥厚，且FUNDC1过表达可逆转该表型。机制上，β-catenin直接结合FUNDC1启动子并激活其转录。 结论 OD通过激活β-catenin/FUNDC1/线粒体自噬轴，增强线粒体质量控制，从而缓解Dox诱导的心肌肥厚。

Abstract

Objective To investigate whether ophiopogonin D (OD) alleviates doxorubicin (Dox)‑induced myocardial hypertrophy in mice by regulating the β‑catenin/FUNDC1/mitophagy signaling axis. Methods Thirty C57BL/6J mice were randomized equally into control group, Dox treatment group, Dox with OD treatment group, Dox treatment group with injection of adeno-associated virus (AAV) vector carrying β‑catenin, and Dox treatment group with injection of AAV vector. RNA sequencing analysis was used to identify differentially expressed genes in cultured mouse cardiac cells following Dox treatment. Western blotting was performed to examine the protein levels of β‑catenin, active β‑catenin, FUNDC1, LC3, p62, β‑myosin heavy chain (β-MHC), and α‑actin; immunohistochemistry and immunofluorescence staining were used to assess the localization and expression of β-catenin and FUNDC1. Transmission electron microscopy was employed to evaluate mitochondrial damage in the cardiac myocytes. Chromatin immunoprecipitation and dual-luciferase reporter gene assays were used to investigate the transcriptional regulation of FUNDC1 by β‑catenin. Results Dox treatment significantly inhibited β‑catenin signaling and FUNDC1-mediated mitophagy, leading to cardiomyocyte hypertrophy and mitochondrial damage. OD treatment obviously reversed these effects, restored β‑catenin signaling, enhanced FUNDC1 transcription and expression, and promoted mitophagy. Overexpression of β‑catenin or FUNDC1 mimicked the cardioprotective effect of OD, while knockdown of β‑catenin aggravated myocardial hypertrophy, which was reversed by FUNDC1 overexpression. Mechanistically, β‑catenin directly bound to the FUNDC1 promoter and activated its transcription. Conclusion OD alleviates Dox-induced myocardial hypertrophy in mice by activating the β‑catenin/FUNDC1/mitophagy axis and enhancing mitochondrial quality control.

Graphical abstract

关键词

麦冬皂苷D / 心肌肥厚 / β-catenin / 线粒体自噬 / 阿霉素

Key words

ophiopogonin D / myocardial hypertrophy / β-catenin / mitophagy / doxorubicin

阿霉素（Dox）是一种高效蒽环类化疗药物，广泛应用于多种恶性肿瘤的临床治疗^［1］。然而，其剂量依赖性的心脏毒性可能导致不可逆的退行性心肌病，并最终导致心力衰竭^［2］。Dox诱导的心脏毒性的一个显著特征是心脏的病理性重塑，其表现为心肌细胞肥大、细胞凋亡以及间质纤维化^［3］。尽管已有数十年研究，如何在不影响Dox抗肿瘤活性的前提下，有效预防或逆转其引发的心肌肥厚，至今仍是一个悬而未决的关键问题^［4］。

Dox所致心脏毒性的发病机制由多因素介导，其中线粒体功能障碍居于核心地位^［5］。Dox可抑制线粒体生物合成，激发过量活性氧（ROS）产生，并扰乱线粒体质量控制系统的稳定运行^［6］。线粒体自噬是一种选择性自噬，可特异性清除受损线粒体，该过程对于维系线粒体稳态与保障心肌细胞正常功能至关重要^［7］。当线粒体自噬功能受阻时，功能障碍的线粒体在细胞内大量堆积，级联放大了氧化应激水平，最终诱发病理性心脏重塑，包括心肌肥厚^［8］。FUN14结构域包含蛋白1（FUNDC1）是心肌细胞中关键的线粒体自噬受体，在缺氧/代谢应激下介导受损线粒体的清除。该蛋白表达下调被证实与多种心血管疾病的发生发展密切相关^{［9， 10］}。

Wnt/β-catenin信号通路是一条参与机体发育与疾病发生的核心经典通路^［11］。最新研究表明，其关键效应分子β-catenin在心脏中具有多重功能，不仅调控心肌细胞的增殖与凋亡，还参与调控线粒体功能及其质量控制^{［12， 13］}。值得注意的是，β-catenin信号与线粒体动力学存在交互作用^{［14， 15］}。然而，在Dox心脏毒性背景下，β-catenin信号如何调控FUNDC1依赖性线粒体自噬尚不明确。阐明该机制，将为开发针对Dox心脏毒性的新型疗法提供潜在干预靶点。

传统中药麦冬在心血管疾病治疗领域已有数百年的应用沿革^［16］。麦冬皂苷D（OD）是源自麦冬的主要甾体皂苷成分，在多种心脏疾病模型中已展现出显著的抗炎、抗凋亡及抗氧化活性^{［17， 18］}。源自传统药物的天然化合物以其良好的安全性和明确的心脏保护潜力而备受青睐。在此背景下，OD对Dox诱导的心肌肥厚是否具有保护作用尚未明确，而其潜在机制是否涉及对线粒体质量控制系统的调控，更有待揭示。

基于上述证据，我们提出以下假说：OD通过激活β-catenin/FUNDC1信号轴、增强线粒体自噬，以清除受损线粒体，最终缓解Dox诱导的心肌肥厚。本研究结果将揭示OD减轻Dox心脏毒性的潜在机制，提示其或可成为接受Dox化疗患者的一种前景广阔的辅助治疗药物。

1 材料和方法

1.1 细胞与主要试剂

大鼠心肌细胞H9c2（ATCC），用于转染相关细胞实验；DMEM/F12培养基（Gibco）；胎牛血清（Bio-Channel）；BCA蛋白浓度检测试剂盒、尼龙膜（碧云天）；TRIzol、Lipofectamine 3000（Invitrogen）；抗β‑catenin（BD Biosciences）、抗活化β‑catenin（Cell Signaling Technology）、抗FUNDC1、抗LC3、抗p62、抗β-MHC（β肌球蛋白重链）（abcam）、抗α-actin（Sungene Biotech）；抗β- actin（Beyotime Biotechnology）。

1.2 主要方法

1.2.1 细胞培养

从新生小鼠中分离出原代心肌细胞用于非转染的细胞实验。通过α-actin免疫染色证明分离细胞池中原代心肌细胞的比例超过95%。心肌细胞在含10%牛血清的DMEM/F12培养基中培养。原代细胞在各种处理前进行12 h的血清饥饿处理。心肌细胞用Dox（0.1 µmol/L）处理48 h。采用H9c2细胞，通过质粒转染实现特定基因（包括β-catenin和FUNDC1）的过表达。然后，分别收获细胞用于免疫荧光染色、电子显微镜检查和蛋白质印迹分析。

1.2.2 实验动物

从斯莱克景达实验动物有限公司（中国湖南长沙）购入8周龄、体质量15~20 g的雄性 C57BL/6 J 小鼠，这些小鼠为无特定病原体（SPF）级，许可证号为：SCXK2019-0004。将实验动物随机分为（n=6）：对照组；Dox尾静脉注射小鼠（总累积剂量为20 mg/kg，1次/周，连续4周，每次注射前需称量体质量，按最新体质量调整给药量）；OD（10 mg·kg^-1·d^-1）灌胃治疗Dox尾静脉注射小鼠；感染 AAV-β-catenin（表达小鼠β-catenin蛋白的腺相关病毒载体于Dox注射前的3周经尾静脉注射）的Dox尾静脉注射小鼠；感染 AAV-对照（腺相关病毒载体）的Dox尾静脉注射小鼠。8周后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）对小鼠实施安乐死，采集血清和心脏组织用于相关检测。所有动物实验均获得南华大学动物伦理委员会（中国衡阳）的批准，（伦理批号：USC2023XS087）。所有方法均按照相关指南和规定执行，并依照 ARRIVE 指南进行报告。

1.2.3 腺相关病毒载体介导的基因传递

AAV-β-catenin由Cyagen Biosciences Inc提供。pHBAAV-cTnT‑β-catenin-3flag、pAAV-RC9 和 pHelper 被同时转染到 HEK293T 细胞中，以包装 AAV-β-catenin 载体。将5×10¹¹个 AAV 粒子稀释在 100 μL生理盐水中，并通过静脉注射注入小鼠体内。在构建Dox心脏毒性模型3周前，进行 AAV 注射。

1.2.4 细胞转染质粒或 siRNA

心肌细胞在 6 孔板中培养。细胞汇合度达到约80%后准备进行转染。心肌细胞通过脂质体转染 pcDNA3.1-β-catenin（2.5 μg）和 pcDNA3.1-FUNDC1（2.5 μg）。将75 pmol针对β-catenin的小干扰 RNA（β-catenin-siRNA）与脂质体在室温下孵育 20 min以生成脂质体复合物。细胞与脂质体复合物的孵育持续 6 h。使用 Opti-MEM（Gibco）和 Lipofectamine 3000（Invitrogen）进行质粒和 siRNA 的转染。β-catenin siRNA（上海生工）反义链 5'-AUUGA CAACUGCAUGUUUCAGUU-3'和正义链5'-GAAA CAUGCAGUUGUCAAUUU-3'；Scramble siRNA反义链5'-AUUGACAACUGCAUGUUUCAGUU-3'和正义链5'-GAAACAUGCAGUUGUCAAUUU-3'。

1.2.5 Western blotting实验

RIPA裂解液提取心脏组织和细胞的蛋白，BCA蛋白定量法测定浓度，95 ℃变性10 min。取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE，并转至PVDF膜上；10%牛血清白蛋白室温封闭1 h，一抗 4 ℃孵育过夜，其中一抗稀释比：抗β-catenin（1∶4000）、抗活化β-catenin（1∶3000）、抗FUNDC1（1∶2000）、抗LC3（1∶2000）、抗p62（1∶2000）、抗β-MHC（1∶5000）、抗α-actin（1∶3000）、抗β-actin （1∶6000），HRP标记兔或鼠IgG（1∶5000）室温孵育2 h，使用ECL高敏曝光液，于Tanon成像仪中显影。用ImageJ软件测定条带的灰度值。蛋白质表达的相对水平以β- actin为参照进行了标准化。

1.2.6 免疫组化（IHC）染色

石蜡切片进行脱蜡复水后，使用柠檬酸缓冲液（10 mmol/L， pH 6.0）进行抗原修复；3%过氧化氢孵育10 min阻断内源性过氧化物酶；5% BSA封闭1 h；分别加入Ⅰ抗β‑catenin（1∶800）和FUNDC1（1∶400），4 ℃孵育过夜；Ⅱ抗常温孵育20 min，之后进行DAB显色，苏木素染核5 s，自来水流水返蓝20 min，脱水透明后中性树脂封片。所有图像均在明场显微镜（Nikon）上获取。

1.2.7 免疫荧光染色

将心肌细胞接种在载玻片上。将心肌细胞置于4%甲醛缓冲液中固定 20 min，然后用 1% 的 Triton X-100 进行 15 min的通透处理，接着用 10% 的牛血清进行30 min的封闭。将载玻片在特定的一抗抗β-catenin（1∶800）、FUNDC1（1∶400）孵育过夜，随后用 Cy-3 连接的二抗或FITC连接的二抗进行检测。然后用 DAPI 对细胞核进行染色以实现可视化。所有显微图像均在徕卡荧光显微镜上获取。

1.2.8 RT-PCR实验

细胞中的总 RNA 用 TRIzol 试剂提取。将 2 µg RNA 作为模板加入到 20 µL的逆转录反应体系（ABclonal）中，以合成第1链 cDNA。使用 Applied Biosystems进行 RT-PCR。25 µL的反应体系包括 12.5 µL Taq PCR 预混液（ABclonal）、1 µL RT 产物以及 0.2 μmol/L 的正向和反向引物。先在 95 ℃下进行 2 min的初始孵育，PCR 扩增包含 35 个循环，每个循环包括 95 ℃下30 s的变性、60 ℃下30 s的退火以及 72 ℃下 60 s的延伸。mRNA 的水平以β-actin为参照进行标准化。用于RT-PCR的引物（上海生工）对如下所示：LC3正向引物5'-CAGGTTGCCTAGCAGAGGTC-3'和反向引物 5'-CTCTGAGCAGTGGTGCATGT-3'；p62正向引物5'-AGAAGTGGACCCATCCACAG-3'和反向引物5'-GAAACCCATGGACAGCATCT-3'；α-actin正向引物 5'-GATCTGGCACCACACCTTCT-3' 和反向引物5'-AACAATGCCTGTGGTTCTCC-3'；β-MHC正向引物5'-CCTCGCAATATCAAGGGAAA-3'和反向引物5'-TACAGGTGCATCAGCTCCAG-3'；FUNDC1正向引物5'-GCAGCACCTGAAATCAACAA-3'和反向引物5'-CTGGCTGTTCCTTTCTCTGG-3'。

1.2.9 透射电子显微镜（TEM）检测

采用透射电子显微镜（TEM）观察细胞和组织中的线粒体损伤和线粒体自噬。小块的心肌组织（1~2 mm³）和心肌细胞依次用戊二醛（2.5%）和锇酸（1%）固定。随后，将样本进行包埋、切片，并用醋酸铀（3%）和柠檬酸铅进行双重染色。最终，利用透射电子显微镜（Hitachi）对线粒体进行检查。

1.2.10 染色质免疫沉淀（ChIP）

使用 pcDNA3.1- β-catenin转染 H9c2 细胞。48 h后，细胞在 4% 甲醛缓冲液中固定，以促进蛋白质-DNA 交联。通过使用 SimpleChIP Plus 试剂盒（Cell Signaling）进行 ChIP 操作。加入针对β-catenin、RNA 聚合酶 II（RNA 多聚酶 II）和兔 IgG 的抗体进行孵育，4 ℃下过夜。随后加入蛋白 A-琼脂糖并孵育1 h。洗涤后，使用纯化的DNA进行 PCR。FUNDC1 基因启动子的引物对（上海生工）如下：正向5'-AAACTCTAGAGCGCGTTGGG-3' 和反向 5'-AACTCTCACACACAGGCTCG-3'。

1.2.11 双荧光素酶报告基因检测

双荧光素酶报告基因检测试剂盒以及报告基因质粒（pGL6-TA 和 pRL-SV40-C）均由贝因拓生物技术公司提供。将 pGL6-TA-FUNDC1启动子和pRL-SV40-C与pcDNA3.1-β-catenin共转染至 HEK293T 细胞中。转染 48 h后，对细胞进行裂解和离心以获得上清液。将样本加载至 96 孔微板中，并在荧光检测仪（Bio Tek）上测定荧光强度。通过萤火虫荧光强度评估荧光素酶活性，该活性通过萤火虫荧光强度与海肾荧光强度的比值进行标准化。

1.2.12 RNA测序

细胞中的总 RNA 用 TRIzol 试剂提取。样本委托奥智生物进行测序。首先评估 RNA 的质量和完整性。RNA 完整性数（RIN）≥7.0 的 RNA 样本进行文库构建。随后，在Illumina Novaseq X Plus上进行高通量测序。差异基因表达分析使用Trimmomatic处理原始测序数据，去除接头序列和低质量reads。对差异基因表达模式进行层级聚类，并使用热图来呈现聚类结果。对各个样本的基因表达量取log₁₀（TPM）处理。当 log₂倍变化（FC）的绝对值≥1 且校正后 P值<0.05时，基因被认为是差异表达的。使用R 包 pheatmap 进行层次聚类和热图可视化。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析将差异表达基因提交到特定数据库平台。对 GO 中的生物过程、分子功能和细胞组分类别以及 KEGG 通路进行富集分析。富集显著性由校正后 P值<0.05 确定。使用R 包 ggplot2生成 GO和 KEGG的气泡图，其中气泡大小代表基因数量，颜色代表校正后 P 值。基因集富集分析（GSEA）使用 GSEA v4.0进行 GSEA，以研究 Dox 和 CTL 组之间预定义基因集（如心肌肥大的 GO：0003300）的富集情况。该分析进行1000次排列以评估统计显著性。计算富集得分（ES）和标准化富集得分（NES），并将富集图可视化。

1.3 统计学分析

本研究所有数据均以均数±标准差的形式呈现。统计分析使用了GraphPad Prism软件（La Jolla，CA）。组间比较采用单因素方差分析。两组之间的统计分析则通过Student-Newman-Kuels检验进行。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dox致心肌损伤与线粒体自噬及心肌肥大相关

基因表达热图显示，与 CTL 组相比，Dox 处理的心肌细胞基因表达谱存在明显差异，说明 Dox 处理显著改变了心肌细胞的基因表达模式（图1A）。GO 富集（图1B）分析显示多个与线粒体自噬相关的GO条目：胱氨酸转运、单加氧酶活性 。KEGG 富集（图1D）分析显示多个与线粒体自噬相关通路：活性氧、心肌收缩。另外， GO 富集（图1C）分析显示多个与心肌肥大相关的条目：蛋白磷酸酶抑制活性、胱氨酸转运。KEGG富集（图1E）分析显示多个与心肌肥大相关通路：细胞骨架，心肌收缩。GSEA 分析进一步验证了心肌肥大相关通路（GO：0003300）在 Dox 与 CTL 组间的差异富集（图1F）。最后，差异表达基因火山图显示，相比对照组，Dox 刺激下调细胞内β-catenin和FUNDC1的mRNA水平（图1G）。

2.2 Dox抑制心肌细胞中β-catenin信号及线粒体自噬，促进心肌细胞肥大

Western blotting结果显示，与对照组相比，Dox处理组中Active β-catenin及总β-catenin蛋白水平均显著下降（P<0.001，图2A~C），表明Dox抑制了β-catenin信号。同时，Dox处理组线粒体自噬关键受体FUNDC1的表达水平也明显降低（P<0.001，图2A、D）。进一步检测发现，Dox处理导致LC3II/LC3I比值显著下降（P<0.001，图2A、E），而自噬底物p62蛋白显著积累（P<0.001，图2A、F）。此外，Dox还诱导了病理性心肌肥大的典型分子标志变化：心肌细胞中α-actin表达上调（P<0.001，图2G、H），胚胎期基因β-MHC（β-myosin heavy chain）的表达也显著升高（P<0.001，图2G、I）。

2.3 OD激活β-catenin信号通路并增强线粒体自噬，减轻Dox诱导的心肌肥大

Western blotting结果显示，与对照组相比，Dox显著降低了心肌组织中β-catenin和FUNDC1的表达水平，并导致LC3II/LC3I比值下降及自噬底物p62蛋白的积累，而OD治疗则显著恢复了这些关键蛋白水平（P<0.001，图3A~F）。免疫组化分析进一步证实，OD促进β-catenin在心肌细胞中的活化及FUNDC1的表达上调（P<0.001，图3G）。更重要的是，OD显著改善Dox诱导的病理性心肌肥大相关标志物异常表达，表现为α-actin和β-MHC蛋白水平的显著下调（P<0.001，图3H~J）。

2.4 OD激活心肌细胞内β-catenin信号并增强线粒体自噬，对抗Dox诱导的心肌细胞肥大

Western blotting分析表明，Dox处理抑制β-catenin信号并下调了线粒体自噬关键蛋白FUNDC1，LC3II/LC3I比值，促进p62蛋白积累。而OD共处理有效逆转了上述分子变化，恢复了β-catenin信号、FUNDC1的表达以及线粒体自噬相关蛋白水平（P<0.001，图4A~F）。免疫荧光结果进一步证实，OD对抗Dox，促进了β-catenin在细胞核内的积聚（红色荧光）并增强了胞质中FUNDC1（绿色荧光）的表达，提示两者在功能上可能存在协同作用（图4G）。最终，在心肌肥大表型上，OD处理逆转了Dox诱导的肥厚相关改变，表现为α-actin表达和胚胎基因β-MHC表达的下调（P<0.001，图4H~J）。

2.5 体内实验显示，心脏过表达β-catenin恢复线粒体自噬，并改善Dox诱导的心肌肥厚

结果显示，心脏特异性过表达β-catenin成功模拟了麦冬皂苷D的保护效应。Western blotting分析表明，在Dox损伤背景下，心脏β-catenin过表达显著提高活性β-catenin水平，并上调了FUNDC1表达，激活线粒体自噬，表现为LC3II/LC3I比值的升高和自噬底物p62蛋白的下降（P<0.001，图5A~F）。免疫组化结果进一步在组织水平证实了β-catenin过表达促进了心脏FUNDC1的表达（图5G）。透射电镜（TEM）观察，β-catenin过表达显著减轻Dox引起的心肌细胞线粒体损伤（黄色箭头指示的受损线粒体）（图5H）。在心肌肥大表型上，β‑catenin过表达有效逆转了Dox诱导α-actin和β-MHC的异常高表达（P<0.001，图5I~K）。

2.6 体外实验显示，心肌细胞过表达β-catenin激活线粒体自噬，并改善Dox诱导的心肌细胞肥厚

Western blotting分析显示，在Dox应激条件下， β-catenin转染显著提高了活性β-catenin及FUNDC1的蛋白水平，升高LC3II/LC3I比值，降低自噬底物p62水平，提示过表达β-catenin恢复了心肌细胞内线粒体自噬水平（P<0.001，图6A~F）。免疫荧光结果显示，β-catenin过表达促进了其在细胞内活化，同时增强胞质中FUNDC1的表达，提示二者在功能上存在协同调控关系（图6G）。TEM观察提供了关键的形态学证据，显示β-catenin过表达显著减轻Dox引起的线粒体结构损伤（图6H）。此外，利用mRFP-GFP-LC3探针进行的自噬检测显示，相比对照组，Dox刺激显著减少心肌细胞内红色荧光和绿色荧光斑点（P<0.001），β-catenin过表达增加红色荧光和绿色荧光斑点（P<0.01），提示β-catenin过表达促进自噬过程（图6I~J）。最终，在心肌肥大方面，β-catenin过表达使α-actin和β-MHC的表达接近正常水平，提示有效逆转Dox诱导的肥大表型（P<0.001，图6K~M）。罗丹明染色显示，Dox刺激导致心肌细胞截面积增大，过表达β-catenin明显缩小心肌细胞截面积（P<0.01，图6N~O）。

2.7 过表达FUNDC1促进线粒体自噬，逆转Dox诱导的心肌细胞肥厚

FUNDC1过表达，对抗Dox，升高LC3II/LC3I比值（P<0.001），并降低自噬底物p62水平（P<0.01），提示促进了线粒体自噬进程。然而，FUNDC1的过表达并未对β-catenin信号产生影响（图7A~F）。在心肌肥大方面，FUNDC1过表达对抗Dox，表现为α-actin（P<0.01）和β-MHC（P<0.001）表达降低，显示具有明显的保护作用（图7G~I）。

2.8 β-catenin作为转录因子直接调控 FUNDC1 介导的线粒体自噬

通过β-catenin敲低（β-catenin-siRNA）与过表达（pcDNA-β-catenin）实验发现，过表达β-catenin升高FUNDC1蛋白水平，敲低β-catenin可降低FUNDC1蛋白水平（P<0.001，图8A~D）。同样，过表达β-catenin升高FUNDC1 mRNA水平（P<0.01），敲低β-catenin降低FUNDC1 mRNA水平（P<0.001，图8E、F）。染色质免疫共沉淀显示，β-catenin直接结合至FUNDC1基因启动子区域（图8G）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，β-catenin直接结合至FUNDC1基因启动子区域，并显著增强其转录活性（P<0.01，图8H）。功能验证实验结果显示，在β-catenin敲低的背景下，LC3II/LC3I比值下降（P<0.001），p62蛋白积累（P<0.001），提示线粒体自噬受抑（图8I~N）。另外，mRNA水平检测显示，FUNDC1 mRNA变化与蛋白水平变化一致，而LC3和p62 mRNA水平在各组间没有变化（图8O~T）。

2.9 β-catenin/FUNDC1 轴调控心肌细胞肥大

表型验证实验结果显示，在β-catenin敲低的背景下，心肌肥大标志物α-actin和β-MHC的蛋白水平显著上调（P<0.001）；然而，过表达FUNDC1可有效逆转上述β-catenin敲低效应（P<0.001，图9A~C）。同时，mRNA水平检测显示，α-actin和β-MHC mRNA变化与蛋白水平变化一致（图9D~G）。

3 讨论

本研究发现OD在对抗Dox诱导的心肌肥厚中发挥心脏保护作用。研究结果显示，OD在Dox诱导的心脏毒性体内及体外模型中，显著改善病理性心肌肥厚。从机制层面分析，发现OD的保护作用是通过激活β‑catenin信号通路实现的，该通路增强了FUNDC1依赖的线粒体自噬，从而有效恢复了线粒体质量控制。本研究发现β-catenin/FUNDC1/线粒体自噬信号轴在Dox诱导的心脏毒性中的介导作用，并表明该通路可被OD正向激活。

研究结果证实，线粒体自噬受损是Dox诱导心肌肥厚发生发展的关键致病环节。Dox导致心肌细胞中线粒体自噬受抑，并伴随受损线粒体的显著堆积，这一发现与既往研究结果相符^{［6， 19， 20］}。FUNDC1作为缺氧和代谢应激诱导的线粒体自噬关键受体^{［21， 22］}，其表达水平的下调表明Dox特异性地破坏了这一重要的线粒体质量控制通路。已有研究表明，FUNDC1在多种应激条件下对维持心脏功能具有重要作用^{［8， 23］}。本研究进一步发现，OD能够有效逆转Dox对FUNDC1表达的抑制，并恢复线粒体自噬活性。更为重要的是，在FUNDC1过表达条件下，Dox引发的线粒体功能损伤与心肌肥厚均被显著遏制。该结果充分证实了FUNDC1介导的线粒体自噬在拮抗Dox心肌损伤中的保护作用。

本研究明确了β-catenin在Dox心脏毒性背景下作为FUNDC1的上游调控因子。β-catenin在心脏中的功能具有高度情境依赖性^{［24， 25］}。尽管已有研究表明持续性β-catenin激活与病理性心肌肥厚相关^［26］，但其在线粒体调控中的作用正逐步受到关注^［27］。我们的研究结果显示，Dox处理显著抑制了β-catenin信号通路，并伴随FUNDC1表达下调。而OD处理则激活β-catenin信号。更为关键的是，敲低β-catenin模拟了Dox诱导的心肌损伤效应，而过表达FUNDC1能够显著缓解因β-catenin缺失所引发的损伤，这一结果表明β-catenin位于FUNDC1信号通路的上游。同时，揭示了基线的β-catenin信号可能发挥一种非经典的、具有细胞保护作用的功能，通过转录激活FUNDC1或其他协同因子实现。这一发现为Wnt/β-catenin信号通路在心肌细胞中的功能提供了新的理解，将其角色从传统的生长与发育调控扩展至线粒体质量控制的关键调节机制。本研究还为将OD作为线粒体自噬增强剂的潜在应用提供了药理学依据。尽管已有文献报道OD在抗氧化和抗凋亡方面具有广泛作用^{［28， 29］}，但其在调控特定线粒体自噬通路中的具体机制仍是一个重要的研究进展。通过明确其作用靶点为β-catenin/FUNDC1信号轴，我们的研究为OD的心脏保护效应提供了潜在的机制性解释。这一发现具有重要的临床转化意义，表明OD的保护作用并非仅源于其非特异性的ROS清除能力，还可以通过恢复线粒体自噬这一关键的“自我清洁”机制实现。OD表现出对Dox抗肿瘤副作用的保护效应^{［18， 30］}，这一结果令人鼓舞，符合理想的心脏保护佐剂基本特征，尽管其临床应用潜力仍需进一步广泛验证。

尽管我们致力于系统地探索机制，但必须承认并审视本研究存在的若干局限性。本研究的局限之处主要在于两方面：首先，OD激活β-catenin的上游分子启动机制仍有待阐明，识别其直接细胞靶标将是未来需要深入探索的关键方向；其次，OD与Dox联合应用的长期疗效与安全性，以及其在其他心脏毒性模型中的普适性，尚需在更复杂、更具临床相关性的动物模型中得到进一步验证。

综上，本研究阐明了一条由OD促进的、旨在拮抗Dox心肌毒性的新型分子通路：即通过激活β-catenin，进而增强其下游FUNDC1依赖性线粒体自噬，最终清除受损线粒体、缓解细胞应激。这一发现不仅深化了对Dox心脏毒性机制的认知，也为将OD开发为心脏保护剂提供坚实的理论依据。靶向β-catenin/FUNDC1/线粒体自噬信号轴，有望为接受化疗的癌症患者开辟全新的心脏防护策略。

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