谷氨酰胺诱导的自噬加剧恶病质裸鼠的肌肉萎缩：基于多组学分析

Glutamine-induced autophagy exacerbates muscle atrophy in cachectic nude mice: a multi-omics analysis

摘要

目的 联合转录组学和代谢组学分析癌症恶病质中氨基酸（谷氨酰胺）是否通过诱导自噬促进肌肉萎缩。 方法 将20只BALB/c裸鼠随机分为正常组、模型组（n=10）。采用皮下移植CT-26细胞诱导恶病质模型，测量BALB/c裸鼠去瘤体质量、抓力/体质量比值、苏木素-伊红（HE染色）观察肌纤维横径，检测肌肉萎缩相关蛋白（MuRF1/Atrogin-1）。转录组学分析鉴定差异表达基因（DEGs），代谢组学分析差异代谢物（DEMs），绘制代谢通路图谱。透射电镜（TEM）观察自噬小体及腓肠肌形态、Western blotting检测自噬标志物（ULK1、LC3、P62）及信号通路蛋白（AMPK、FOXO3a及mTOR等）。经Gln+AMPK抑制剂处理的C2C12成肌细胞验证了关键实验结果。 结果 与对照组相比，模型组无瘤体质量（P<0.01）、抓力/体质量比值（P<0.0001）下降，肌纤维面积减少（P<0.05）以及Atrogin-1（P<0.01）、MuRF1（P<0.05）水平升高。DEGs主要富集于精氨酸/脯氨酸代谢、AMPK、mTOR、自噬及FOXO信号通路。代谢组学分析显示，恶病质肌肉中谷氨酰胺和谷氨酸水平显著升高。体内实验发现恶病质小鼠肌肉中自噬小体数量增加（P<0.01），肌纤维模糊断裂。AMPK、FOXO3a通路蛋白升高（P<0.05），同时ULK1（P<0.05）、LC3II/I蛋白（P<0.0001）表达水平显著上调，mTOR通路蛋白及P62蛋白下调（P<0.01）。体外实验表明，谷氨酰胺可促进C2C12细胞自噬进程，并促进AMPK、FOXO通路，抑制mTOR通路，而加入AMPK抑制剂则能阻断这些效应。 结论 谷氨酰胺通过激活AMPK/FOXO3a信号通路并抑制mTOR信号通路促进自噬，导致癌症恶病质肌肉萎缩。

Abstract

Objective To clarify whether glutamine induces autophagy to promote skeletal muscle atrophy in cancer cachexia through integrated transcriptomic and metabolomic analyses. Methods Twenty male BALB/c nude mice were randomized into control and model groups (n=10), and in the latter group cachexia was induced by subcutaneous implantation of CT-26 colon carcinoma cells. Tumor-free body mass and grip strength/body mass ratio of the mice were measured, myofiber transverse diameter was observed using HE staining, and muscle atrophy-related proteins (MuRF1 and atrogin-1) were detected. Transcriptomic and metabolomic analyses were used to identify the differentially expressed genes (DEGs) and differentially expressed metabolites (DEMs), respectively, and the metabolic pathways were mapped. Autophagosomes and gastrocnemius morphology were observed with transmission electron microscopy (TEM), and the autophagic markers (ULK1, LC3, and P62) and signaling pathway proteins (AMPK, FOXO3a, and mTOR) were assayed using Western blotting. The key findings were validated in C2C12 myoblasts treated with glutamine (Gln) and an AMPK inhibitor. Results Compared with the control mice, the mice in the model group had significantly decreased tumor-free body mass, grip strength/body mass ratio and myofiber area with elevated atrogin-1 and MuRF1 expressions. The DEGs were mainly enriched in arginine/proline metabolism, AMPK, mTOR, autophagy and FOXO signaling pathways. Metabolomic analysis showed significantly increased glutamine and glutamate in the cachectic muscle. In the tumor-bearing mice, the number of autophagosomes increased significantly with blurred and fragmented myofibrils, upregulated AMPK/FOXO3a pathway proteins and ULK1, and downregulated mTOR pathway proteins and P62. In C2C12 myoblasts, treatment with glutamine obviously promoted autophagy, activated AMPK/FOXO3a signaling and inhibited the mTOR pathway, and these effects were strongly blocked by the AMPK inhibitor. Conclusion Glutamine promotes autophagy through activation of the AMPK/FOXO3a signaling axis and suppression of the mTOR pathway, leading to skeletal muscle atrophy in cancer cachexia.

Graphical abstract

关键词

癌症恶病质 / 肌肉消耗 / 自噬 / 谷氨酰胺 / AMPK/mTOR

Key words

cancer cachexia / muscle depletion / autophagy / glutamine / AMPK/mTOR

骨骼肌是人体重要的蛋白质储存器官，约占体质量的40%~50%，负责全身约60%的蛋白质代谢^［1］。癌症恶病质是一种多因素引发的综合征，其特征是骨骼肌和脂肪组织逐渐流失，导致约30%晚期肿瘤患者死亡^［2］。肌肉萎缩不仅对日常活动造成困扰，还会严重损害生活质量并降低治疗效果。因此，阻止肌肉萎缩进展是防治癌症恶病质的关键。

在癌症患者中，肌肉组织储存的蛋白质通过水解释放大量氨基酸，为肿瘤生长提供能量^［3］。谷氨酰胺（Gln）作为条件性必需氨基酸，在能量代谢、氧化还原平衡及细胞生长中扮演关键角色。杨等人在C26小鼠模型中发现，血清氨基酸代谢紊乱是癌症恶病质的主要特征^［4］。在癌症代谢过程中，肌肉组织中储存的Gln分解是细胞生长的主要能量来源^［5］。近期研究显示，过度激活的自噬在癌症恶病质的肌肉萎缩中起到关键作用^［6］。研究表明，在1型糖尿病、脓毒症、炎症及饥饿等实验模型中，补充外源性Gln可有效抑制蛋白质过度分解，并改善肌肉萎缩^［7-10］。但另一项研究指出，肠内补充Gln并不能阻止重症患者出现肌肉萎缩^［11］。然而，目前尚未明确骨骼肌蛋白水解释放的Gln对癌症恶病质引发的肌肉萎缩究竟具有促进作用还是抑制作用。

鉴于癌症恶病质是一种典型的代谢综合征，故选用组学技术（包括转录组学和代谢组学）解析其代谢特征，从而在机制层面理解癌症恶病质的发病机制。故本研究通过转录组学和代谢组学技术，深入解析肌肉萎缩中代谢物（尤其是Gln）的分子作用机制，旨在为防治恶病质提供一个新的视角。

1 材料和方法

1.1 动物与细胞

20只雄性BALB/c裸鼠（6周龄，体质量20~25g），购自北京维通利华实验有限公司（许可证号：SCXK北京2021-0011）。小鼠饲养环境温度恒定在21~24℃，湿度稳定，采用12 h∶12 h光照/黑暗循环模式。经山东中医药大学附属医院动物伦理委员会批准（伦理批号：SDSZYYAWE20241118002）。

CT26小鼠结直肠癌细胞系（CL-0071）、C2C12小鼠成肌细胞系（CL-0044）（普诺赛生命科技）。细胞在37 ℃、5% CO₂的湿润培养箱中培养。

1.2 实验仪器

握力计（XR501，上海新润）；病理切片机（RM2016，上海）；尼康Eclipse E100光学显微镜（东京尼康公司）；超高效液相Acquity（Waters）Q Exactive高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific）、Qubit® 3.0 荧光定量仪（Life Technologies ）；生物分析仪 2100（安捷伦）；纳诺滴 One 分光光度计（Thermo Fisher Scientific）；高通量组织研磨器（宁波新芝生物）；超薄切片机（Leica）；透射电子显微镜（HITACHI）；沃特世UPLC；Tanon5200全自动图像分析系统；酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；3D Histech全景MIDI型数字病理扫描仪。

1.3 药物与试剂

2%胎牛血清（普诺赛）；1%青霉素-链霉素溶液（普诺赛）；细胞计数试剂盒CCK-8 （碧云天）；天模TR205-200试剂盒；谷氨酰胺合成酶（GS）ELISA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Dorsomorphin（MedChemExpress）；小鼠谷氨酰胺（GIn）Elisa检测试剂盒（上海信裕生物）；电镜固定液（G1102）、一抗：LC3（1∶4000）、ULK1（1∶1000）、p-ULK1（1∶6000）、p-mTORC1（1∶6000）、MuRF1（1∶5000）；Atrogin-1（1∶2000）、（武汉三鹰公司）、P62（1∶30 000）、mTORC1（1∶3000）、AMPK（1∶3000）、p-AMPK（1∶1000）、FOXO3a（1∶3000）、p-FOXO3a（1∶3000）、HRP标记羊抗兔（1∶60 000）、HRP标记羊抗小鼠（1∶60 000）（华安生物科技公司）。Alpha-actinin-1（1∶1000）、Cy3二抗（1∶500）（赛维尔）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、造模及取材

小鼠经过7 d适应期后，随机分为对照组（n=10）和模型组（n=10）。将CT-26细胞（5×10⁵个，溶于100 μL PBS中）皮下注射到6周龄雄性BALB/c裸鼠中建立荷瘤模型^［12］，对照组则注射等量PBS溶液。4 d/次称取体质量，4周后，小鼠在4%异氟烷麻醉下安乐死，模型组剥离肿瘤称取小鼠无瘤体质量，立即解剖取下腓肠肌称重。部分腓肠肌-80 ℃冷冻保存以备后续分析，另一部分固定于4%多聚甲醛中进行组织学检测。

1.4.2 细胞培养及分组

将指数生长期的 C2C12 细胞接种在6孔板中并培养至 80%汇合状态。将培养的培养基更换为由2%胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素组成的分化培养基，48 h/次换液，分化8 d左右。肌管形成后，分为对照组，Gln组，Gln+AMPK抑制剂组，分化培养基继续培养。现有研究表明2.8 μmol/L的Gln明显促进自噬，故Gln组加入浓度为2.8 μmol/L的Gln^［13］， Gln+AMPK抑制剂组加入Dorsomorphin培养24 h。

1.4.3 CCK-8检测不同浓度Gln对C2C12细胞增殖的影响

将C2C12细胞以2×10³/孔的密度接种于96孔板，置于生长培养基中培养。接种24 h后，加入不同浓度Gln（0、0.7、1.4、2.8、5.6 mmol/L）处理24 h，设置空白对照组、周围孔内加入100 μL PBS溶液，然后加入10 μL CCK-8试剂。将培养板放回培养箱继续孵育1~4 h，最后用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}值。

1.4.4 肌管染色观察肌管结构

向6孔板接种细胞10⁵/孔，分化培养8 d成肌管。4%多聚甲醛固定20 min，α-actinin-1一抗（1∶1000）4 ℃过夜，Cy3二抗（GB21303）室温50 min，DAPI染核10 min。PBS洗涤后，3D Histech全景扫描仪采图。结合ImageJ软件测量肌管直径。

1.4.5 抓力测量

将小鼠的尾巴轻轻平贴在网格板表面，缓慢而稳定地向后拉动直至四肢脱离网格。记录脱离前产生的最大力值（单位：gf）。小鼠测试3次/只，统计分析采用平均值。

1.4.6 苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠肌肉组织形态变化

将腓肠肌从多聚甲醛中取出，经石蜡包埋后，使用病理切片机切成4 μm厚切片。去除石蜡后，切片经水洗复水，随后进行HE染色。染色后的切片使用尼康Eclipse E100光学显微镜观察，采集图像。最终利用ImageJ软件对图像进行分析，计算肌肉纤维横截面积。

1.4.7 透射电镜（TEM）观察自噬小体和肌纤维形态

将新鲜小鼠腓肠肌切成1 mm³块，放入电镜固定液，后固定后进行室温冲洗和脱水，树脂包埋组织，并切成1.5 μm半薄切片。随后将这些半薄切片进一步切割为60~80 nm超薄切片，使用2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8 min后冲洗再次。6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

1.4.8 ELISA法检测Gln浓度

往预先包被Gln抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Gln呈正相关。用酶标仪吸光度A_{450 nm}值，计算Gln浓度。

1.4.9 转录组学检测

转录组测序由上海鲸舟基因科技有限公司完成。总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit®3.0 Fluorometer检测完整性、浓度与纯度后构建文库。测序数据以fastq格式存储，经FastQC质控并比对至参考基因组，使用StringTie获取片段计数，TMM标准化，FPKM评估表达丰度。采用edgeR软件包进行差异表达分析，筛选阈值为|log2FC|>1且P<0.05。差异基因通过热图可视化，经KEGG功能富集分析，并在Cytoscape中构建通路－基因网络，通过Cytoscape3.10识别关键基因，同时进行GSEA分析。

1.4.10 非靶向代谢组学分析

50 mg样本经80%甲醇提取，加内标物后上机。采用Acquity UPLC HSS T3柱分离，正负离子模式下全扫描（m/z 70~1050）结合数据依赖二级质谱扫描。原始数据经峰提取、缺失值填补及TIC归一化，共获7896个代谢峰。构建PLS-DA模型，以VIP>1且P<0.05筛选差异代谢物，结合KEGG和MetaboAnalyst 6.0进行通路分析。

1.4.11 蛋白免疫印迹法

提取肌肉组织和C2C12细胞的蛋白样品。用BCA法测蛋白浓度。取等量不同组别蛋白样品进行电泳后转印至PVDF膜，并用5%脱脂牛奶封闭。分别孵育MuRF1、Atrogin-1、LC3、P62、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、FOXO3a、p-FOXO3a、ULK1、p-ULK1一抗在4 ℃条件过夜。将膜洗涤干净后接着用二抗室温孵育膜2 h。经TBST洗涤后，使用Tanon5200全自动图像分析系统进行蛋白条带可视化检测。用Image J软件对条带灰度值分析。实验中以GAPDH和Tubulin作为内参。

1.5 统计学分析

统计分析使用GraphPad Prism 9.5.1软件进行，符合正态分布的结果以均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较则使用单因素方差分析，并采用Tukey事后检验进行两两比较。统计学显著性判定标准设定为P<0.05。

2 结果

2.1 CT-26荷瘤小鼠出现肌肉萎缩

与对照组相比，模型组小鼠无瘤体质量（P<0.01，图1A）、抓力与体质量比值明显降低（P<0.0001，图1B），HE染色显示模型组肌纤维横截面积小于对照组（P<0.05，图1C、E）。模型组的肌肉萎缩F-box蛋白1（Atrogin-1）（P<0.01，图1D、F）和E3泛素连接酶肌肉环指蛋白1（MuRF1）（P<0.05，图1D、G）相比于对照组升高。

2.2 癌症恶病质中肌肉萎缩的转录组变化

通过主成分分析（PCA）探究两组间的关联性与变异情况，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）贡献率分别为80.9%和12.8%。根据PCA图，认为组间有明显差异，组内重复性较好（图2A）。根据|log2FC|>1且P<0.05的标准筛选差异表达基因（DEGs），筛选得出1626个DEGs，采用火山图可视化呈现结果，其中584个基因表达下调，1042个基因表达上调（图2B）。

对DEGs进行KEGG富集分析和GSEA分析，结果显示，DEGs与精氨酸和脯氨酸代谢、AMPK信号通路、mTOR信号通路、自噬及FOXO信号通路相关（图2C~E）。

2.3 癌症恶病质中肌肉萎缩的代谢组变化

采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）分析模型组与对照组间代谢物，结果显示两组呈现明显的组间分离与组内聚集，提示两组代谢物存在显著差异（图3A、B）可以进行后续分析。基于OPLS-DA模型，设置VIP>1和P<0.05的过滤条件进行火山图分析，发现负离子模式下有122种差异代谢物，其中77种上调，45种下调。而正离子模式下有64种差异代谢物，其中34种上调，30种下调（图3C、D）。正离子模式下，KEGG通路富集分析表明这些代谢物主要参与精氨酸生物合成及精氨酸与脯氨酸代谢（图3E）。通过热图展示两组中富集的差异DEMs，发现模型组Gln和谷氨酸水平高于对照组（图3F）。

2.4 癌症恶病质患者肌肉组织中自噬活性显著增强

检测腓肠肌内Gln的含量，模型组内Gln浓度高于对照组（P<0.0001，图4A）。通过TEM发现，对照组的肌纤维呈现清晰的明暗带和有序排列的肌丝结构，而模型组则出现模糊的明暗带及不规则的断裂Z线（图4B~D）。与对照组相比，模型组线粒体嵴结构排列稍紊乱，部分膜和嵴结构溶解，模型组表现出自噬体数量增加（P<0.01）。

与非恶病质小鼠相比，恶病质小鼠肌肉组织中的p-AMPK/AMPK和p-FOXO3a/FOXO3a表达水平升高（P<0.05，图5B、C），而p-mTOR/mTOR蛋白水平则降低（P<0.01，图5D）。与对照组相比，作为自噬受体和降解底物的P62蛋白在模型组中表达降低（P<0.01， 图5E）；作为自噬启动的核心调控激酶p-ULK1/ULK1（P<0.05，图5F）和自噬激活标志物的微管相关蛋白1轻链3（LC3）转化率（LC3-II/I）在模型组中升高（P<0.0001， 图5G）。

2.5 谷氨酰胺处理激活C2C12肌管通过调控AMPK/mTOR/FOXO3a信号通路诱导自噬

CCK-8结果显示，所有浓度中2.8 mmol/L浓度Gln细胞活性最高，故选择2.8 mmol/L Gln用于后续实验（图6A）。多组学联合分析表明，Gln代谢可能在肌肉萎缩中起关键作用。Gln组的肌管直径较对照组明显缩小（P<0.01）。Gln+AMPK抑制剂组的肌管直径相对于Gln组有明显改善（P<0.05，图6B、C）。Gln组的Atrogin-1和MuRF1表达量高于对照组（P<0.01或P<0.0001），相对于Gln组，Gln+AMPK抑制剂组的Atrogin-1和MuRF1表达量明显下降（P<0.01或P<0.05，图6D~F）。

与对照组相比，Gln组的AMPK和FOXO3a的蛋白表达水平升高（P<0.01或P<0.001，图7B、C）。mTOR和P62的表达水平则下降（P<0.001，图7D、E）。ULK1和LC3II/I蛋白的表达水平也呈增长趋势（P<0.01，图7F、G）与Gln组相比，Gln+AMPK抑制剂组的AMPK和FOXO3a的蛋白表达水平下降（P<0.01或P<0.05，图7A~C），而mTOR和P62的蛋白表达水平则有所上升（P<0.01或P<0.05，图7D），ULK1和LC3II/I表达水平呈下降趋势（P<0.05，图7E~G）。

3 讨论

为探究癌症恶病质中引起肌肉萎缩的潜在机制，故采用转录组和非靶向代谢组学技术。健康小鼠与癌症恶病质小鼠骨骼肌在转录组学富集的自噬相关基因呈现差异表达。自噬是细胞成分降解的主要途径之一^［14］，当出现严重营养不良（如饥饿）时，这种机制可作为营养缺乏的补偿性调节［^15］。在癌症中，由于癌细胞具有高度增殖性和高能耗特性^［16］，其能量平衡处于负值状态。为维持高能耗需求，骨骼肌组织通过蛋白质分解释放氨基酸，这些物质成为糖异生和转移的重要底物^{［16， 17］}。与健康患者肌肉组织相比，肺癌患者肌肉自噬水平显著升高，高水平的LC3-II/Ⅰ可证实^［14］。在C26荷瘤小鼠模型中，肌肉组织过度分解产生的氨基酸会触发异常自噬反应，加剧癌症恶病质中的肌肉萎缩^［18］。由此可知，Gln诱导的过度自噬是驱动癌症恶病质肌肉萎缩的关键因素。

我们还发现DEGs富集到了AMPK、mTOR和FOXO信号通路。AMPK与mTOR在不同能量状态下调控自噬的作用方向相反^［11］：当细胞内能量充足时，mTOR会磷酸化ULK1蛋白，阻止AMPK激活ULK1；失活的ULK1无法与ATG和FIP200形成复合物，阻断自噬过程^［13］。当能量不足时，AMPK抑制mTOR激活并增加LC3表达来促进自噬，进而启动自噬体的形成^{［13， 19］}。AMPK还能直接磷酸化FOXO3蛋白，这些磷酸化事件促使FOXO3向细胞核转移，并激活Ulk1、Atg5、Atg4、Atg412及LC3等自噬相关基因的转录^［20］。已有研究表明，AMPK与FOXO3的激活可驱动自噬发生，并参与癌症恶病质相关的肌肉萎缩^{［1， 21-23］}。FOXO3a转录因子的激活还会增强MuRF-1和Atrogin-1的表达，加速蛋白质降解和肌肉分解^［24］。本研究重点探讨了这些信号通路是否与癌症恶病质中的肌肉萎缩存在关联。在后续验证实验中，我们发现癌症恶病质小鼠骨骼肌中自噬被激活；其p-AMPK/AMPK和p-FOXO3a/FOXO3a的蛋白表达水平显著升高，而p-mTOR/mTOR蛋白的表达水平则明显降低。这些结果表明，癌症恶病质小鼠AMPK/FOXO3通路激活与mTOR通路抑制共同作用，促进自噬活动增强，这种机制与癌症恶病质中肌肉萎缩的发生密切相关。

代谢组学分析显示，模型组中Gln和谷氨酸的含量有所增加。作为细胞增殖与存活的关键氨基酸，Gln主要由骨骼肌合成并释放^［25］，对维持肌肉力量和功能至关重要。作为能量底物，Gln通过SLC7A等转运蛋白进入细胞，经谷氨酰胺酶（GLS）作用转化为谷氨酸。随后，谷氨酸在谷氨酰胺脱氢酶（GLUD）催化下生成α-酮戊二酸（α-KG），后者参与三羧酸循环为机体提供能量^［26］。此外，谷氨酸还作为氮源底物，通过谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT）的转氨基作用生成天冬氨酸^［27］。反过来，谷氨酸又作为主要底物，在谷氨酰胺合成酶（GS）的作用下被利用进行Gln的合成，该酶由Glul基因编码^［27］。本研究的转录组学结果显示，C26结肠癌小鼠模型中Gln代谢活动活跃，这从Glul和SLC7A基因的上调表达得到印证。

先前研究证实，自噬过程能够将错误折叠或非功能性蛋白质转化为Gln，从而在营养匮乏或应激环境下维持细胞代谢和稳态^［28］，这表明自噬会影响Gln代谢。然而，Gln代谢影响自噬过程的具体机制尚未明确。除了作为重要能量来源外，Gln代谢还能通过与细胞内信号通路相互作用来调控细胞功能。既往研究发现Gln的合成代谢和分解代谢过程对mTOR通路产生不同影响：具体而言，在热量限制条件下，FOXO3激活会通过上调Glul表达导致GS表达增加^［29］。Gln水平升高通过阻止溶酶体定位抑制mTOR活性，从而促进自噬发生^［30］。相反，最新研究表明Gln分解产生的α-酮戊二酸可激活mTOR，进而抑制自噬^［30］。在我们的体外实验中，我们发现用Gln处理C2C12肌管细胞可抑制mTOR表达并上调自噬水平，这与先前研究^［30］的结论相印证。Gln通过阻止AMPK乳化作用并促进其磷酸化来激活信号传导^［31］。AMPK抑制mTOR的激活并催化其磷酸化过程，而Gln可通过激活AMPK-ULK1复合体并抑制mTOR来增强这一机制。

本研究首次揭示了Gln在癌症恶病质肌肉萎缩中的作用机制：Gln通过激活AMPK/FOXO3a信号通路并抑制mTOR信号通路来促进自噬，自噬过度激活与癌症恶病质肌肉萎缩密切相关。

综上所述，本研究揭示了Gln通过促进过度自噬加剧癌症恶病质中肌肉萎缩的新机制。本研究为揭示癌症恶病质患者骨骼肌萎缩的分子机制提供了新证据，并为癌症恶病质新型药物的临床研发提供了新思路。

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基金资助

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国家自然科学基金(82374376)

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