化结消瘤方中的熊果酸通过诱导铜死亡抑制结直肠癌细胞生长

Ursolic acid in Huajie Xiaoliu Formula inhibits colorectal cancer cell growth by inducing cuproptosis

摘要

目的 探讨化结消瘤方（HJF）及其活性成分熊果酸（Ursolic acid）通过铜死亡抗结直肠癌（CRC）的分子机制。 方法 采用蛋白质组学分析化结消瘤方对结直肠癌蛋白表达谱的影响；血清药物化学探索化结消瘤方抗结直肠癌的潜在活性物质；通过网络药理学和分子对接预测熊果酸与铜死亡相关靶点的相互作用；采用MTT、划痕、克隆形成、Western blotting等细胞生物学实验验证熊果酸对HCT-116和LOVO细胞增殖、迁移及铁氧还蛋白1（FDX1）、溶质载体家族31成员1（SLC31A1）、二氢硫辛酸转乙酰基酶（DLAT）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、丙酮酸、Cu²⁺等铜死亡相关指标的影响。 结果 化结消瘤方调控628个差异表达蛋白，涉及炎症、免疫、代谢等通路；熊果酸为其主要入血成分，与铜死亡关键蛋白FDX1具有强结合潜力（对接分数106.813），可抑制结肠癌细胞增殖与迁移，诱导Cu²⁺（P<0.05）、MDA（P<0.05）和丙酮酸（P<0.01）积累，降低GSH水平（P<0.01），抑制DLAT表达并上调FDX1和SLC31A1表达。 结论 熊果酸作为化结消瘤方发挥抗结直肠癌作用的关键活性成分之一，通过靶向FDX1在结直肠癌细胞中诱导铜死亡，从而发挥抗肿瘤作用。

Abstract

Objective To investigate the molecular mechanism by which Huajie Xiaoliu Formula (HJF) and its active component ursolic acid inhibit colorectal cancer (CRC) cell growth. Methods Proteomics was used to analyze the effect of HJF on protein expression profile in CRC xenografts from tumor-bearing nude mice. Serum pharmacochemistry was used to identify the potential active components of HJF. Network pharmacology and molecular docking were employed to predict the interaction between ursolic acid and cuproptosis-related targets. Cellular assays including MTT, wound healing, colony formation, and Western blotting were used to validate the effects of ursolic acid on proliferation, migration, and cuproptosis-related indicators (FDX1, SLC31A1, DLAT, GSH, MDA, pyruvic acid, and Cu²⁺) in HCT-116 and LoVo cells. Results HJF regulated 628 differentially expressed proteins in CRC, involving pathways related to inflammation, immunity, and metabolism. Ursolic acid was identified as a major blood component of HJF and exhibited a strong binding affinity with the key cuproptosis protein FDX1 (LiDock Score106.813). In HCT-116 and LoVo cells, ursolic acid significantly inhibited cell proliferation and migration, induced intracellular accumulation of Cu²⁺, MDA and pyruvic acid, reduced GSH levels, inhibited cellular DLAT expression, and up-regulated the expressions of FDX1 and SLC31A1. Conclusion As one of the key active components in the HJF, ursolic acid inhibits CRC cell growth by inducing cuproptosis via targeting FDX1.

Graphical abstract

关键词

熊果酸 / 结直肠癌 / 铜死亡 / 化结消瘤方

Key words

ursolic acid / colorectal cancer / cuproptosis / Huajie Xiaoliu Formula

结直肠癌（CRC）属临床重大疾病，5年生存率约为14%。早期CRC可通过手术治疗，但晚期和肿瘤耐药转移患者难以得到有效根治^［1，2］。CRC是全球第3大致死癌症，每年新增病例超过185万，死亡人数达85万^{［3， 4］}。在中国，CRC的发病率逐年上升，医疗负担依然沉重^［5］。因此，拓展CRC治疗策略仍然是医学研究亟待解决的重要问题。

CRC患者多胃肠功能虚弱，外邪易侵，积聚于肠。基于此，武汉协和医院范恒教授^{［6， 7］}总结出化结消瘤方（HJF）这一方剂，其组方为黄芪30 g、当归10 g、甘草10 g、茯苓15 g、太子参15 g、麸炒白术15 g、陈皮10 g、姜半夏10 g、红豆杉6 g、藤梨根30 g、半枝莲30 g、半边莲15 g、蛇舌草30 g、薏苡仁30 g、蜈蚣3 g、醋莪术10 g、白英15 g，全方具有清热解毒、消肿散结、扶正固本的功效，是治疗CRC的有效临床经验方，具有进一步推广应用的价值。然而，该方的物质成分及其抗CRC的作用机制仍需深入阐明。

铜死亡是一种由铜元素过度积累引发的细胞死亡新形式^{［8， 9］}。铜作为细胞必需的微量元素，在各类细胞的生理活动中发挥着关键作用^［10］。铜的大量积累，会引发氧化应激并破坏细胞功能^［11］。此外，铜的过量还会显著升高丙二醛（MDA）水平并降低谷胱甘肽（GSH）含量，这是铜死亡的典型特征^{［12， 13］}。而参与该过程的关键介质还包括FDX1和SLC31A1 ^{［14， 15］}，调控SLC31A1和FDX1有望为结直肠癌的治疗开辟新途径。

本研究拟从诱导铜死亡的角度，探究化结消瘤方及其关键成分抗结直肠癌的作用机制，以期为该方的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

SPF级健康雄性SD大鼠20只［许可证号：SCXK （鄂） 2020-0018，武汉万千佳兴生物科技］；6~8周龄SPF级BALB/c雄性小鼠60只［许可证号：SCXK（鄂）2017-0012，三峡大学试验动物中心］。CT26WT小鼠结肠癌细胞、HCT-116人结肠癌细胞、LOVO人结肠癌细胞（武汉普诺赛生物科技）。

1.1.2 主要试剂

藤梨根（批号202208013）、陈皮（批号202209027）、莪术（批号202210018）、半边莲（批号202209022）、半枝莲（批号202209015）（湖北天济药业有限公司）；白花蛇舌草（批号2222080105）、白英（批号2221120113）、白术（批号2222090101）、茯苓（批号2222090217）、半夏（批号2222060105）、甘草（批号2222080111）、红豆杉（批号2222060110）（湖北辰美中药有限公司）；黄芪（批号220924）、太子参（批号220907）、薏苡仁（批号220504）（安徽康和中药科技有限公司）；当归（批号C0411220062，保和堂（亳州）制药有限公司）；蜈蚣由湖北省中医院提供。

生理盐水（货号BL158A，Biosharp 生物科技有限公司），二甲基亚砜（D8371）、MTT、结晶紫和胰蛋白酶（货号T1300）（索莱宝生物技术）。实验用水采用Millipore Milli-Q超纯水系统制备；熊果酸（源叶生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、铜离子、BCA蛋白定量试剂盒及丙酮酸检测试剂盒（伊莱瑞特生物科技）；IgG H&L抗体、GAPDH、FDX1和SLC31A1（伯湾生物科技）；DLAT抗体（武汉三鹰生物技术）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物

动物实验方法及LC-MS/MS分析流程已在我们前期研究中详细阐述^［16］。本研究选择SD雄性大鼠（SPF级，体质量200±20 g）分为空白组和给药组，10只/组，按25.58 g/kg连续灌胃化结消瘤方14 d，空白组每天给予等体积生理盐水，末次给药结束后2 h，腹主动脉采血，收集血清用于检测入血成分。采用SPF级BALB/c小鼠60只（雄性，6~8周龄，体质量18~22 g），随机挑选6只作为空白组，其余小鼠均以CT26WT细胞构建荷瘤模型，当瘤体积达到50 mm³时筛选肿瘤大小相对一致的36只小鼠分组给药（肿瘤体积计算公式：肿瘤体积V （mm³）=0.5×L×W²。其中，L和W分别为肿瘤的长和宽）。收集肿瘤组织进行蛋白质组学分析。

1.2.2 蛋白质组学检测

将模型组和化结消瘤方给药组各4个样本送检蛋白组，蛋白质组学委托美吉生物公司采用TMT标记技术检测。本探索性蛋白质组学研究每组使用4个样本，符合此类初步机制研究的常见样本量设计，后续将扩大样本进行验证。

1.2.3 化学成分收集

从HERB数据库（HERB，http：//herb.ac.cn）及PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中收集化结消瘤方中各药味所含化学成分。

1.2.4 获取化合物靶点

PubChem数据获取化结消瘤方中各化学成分的SMILES格式，并从PharmMapper（https：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和Swiss TargetPrediction（https：//www.swisstargetprediction.ch）数据库中预测化合物的潜在靶点。

1.2.5 公共数据收集

从ArrayExpress网站（https：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）收集18例结肠癌患者、18例转移性肿瘤和18例癌旁组织的RNA-seq数据。所获得的数据集用Omicshare（https：//www.omicshare.com/tools/index.php/）标准化处理。

以关键词“cuproptosis”从GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和FerrDb数据库（https：//www.zhounan.org/ferrdb/current/）收集铜死亡相关靶点，共获得131个铜死亡相关靶点。

1.2.6 PPI网络构建及富集分析

为探明蛋白质相互作用（PPI）关系，将待分析靶点集导入STRING（https：//string-db.org/）数据库。该数据库可同步进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析是揭示基因共同影响的生物过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF）的重要途径。KEGG富集分析则可发现基因所涉及的重要信号通路。

1.2.7 网络建设

所有网络图谱均使用Cytoscape 3.10.1软件构建，采用Cytohubba插件筛选关键节点。

1.2.8 基于GEPIA2的差异表达和总生存分析

GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）整合了TCGA和GTEx数据库中的数据，可用于靶点差异表达分析和生存分析^{［17，18］}。使用GEPIA2对候选蛋白进行差异表达分析和总体生存分析。

1.2.9 分子对接

从PubChem数据库下载化合物的.sdf格式文件，从PDB蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）获取蛋白质结构数据。使用DiscoveryStudio软件进行溶剂分子和去配体、加氢、加电子等操作，并通过该软件完成分子对接。

1.2.10 细胞培养

HCT-116和LOVO细胞系购自普诺赛生命科技公司。细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。培养环境为37 ℃、5% CO₂。

1.2.11 试剂盒检测

MTT用于检测细胞活力，丙酮酸检测试剂盒用于检测丙酮酸的产生，GSH试剂盒用于检测还原型谷胱甘肽的含量，细胞铜检测试剂盒用于检测细胞内Cu²⁺含量，MDA试剂盒用于检测脂质过氧化程度。

1.2.12 克隆形成实验

培养好的细胞经0.25%胰蛋白酶处理后，重悬于2 mL培养基中。计数后，接种至6孔板，接种细胞2000/孔，于37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养。待细胞贴壁后，用药物处理24 h并继续培养10 d。克隆细胞经4%多聚甲醛固定，室温下用结晶紫染色，干燥后采集图像。

1.2.13 细胞划痕实验

在6孔板中按3×10⁵/孔接种细胞。次日，用10 μL移液枪头划痕，并用PBS洗涤细胞3次去除漂浮细胞。向每孔中加入无血清培养基，并根据组别添加药物，随后继续培养，并于0和60 h拍摄图像。使用Image J分析划痕面积，并通过Graphpad Prism 9.5进行统计分析。

1.2.14 Western blotting实验检测蛋白表达

从HCT-116和LOVO细胞中提取蛋白质后，使用BCA试剂盒测定其浓度。煮沸变性，取20 µg样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离。电泳完成后，用5%脱脂奶粉封闭膜1.5 h，再与一抗（按1∶2000稀释）在4 ℃下孵育过夜。膜经TBST缓冲液洗涤3次后，室温下与二抗（按1∶8000稀释）孵育1 h。抗体孵育结束后，用TBST缓冲液冲洗膜3次。最后采用ECL显影剂显影并曝光图像。

1.2.15 统计学分析

采用Graphpad prism 9.5软件进行统计学分析，t检验分析不同组间的差异，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 化结消瘤方对结直肠癌蛋白表达谱的影响

蛋白质组学从结直肠癌中检测到超过6900种蛋白质。在化结消瘤方的调控下，大量蛋白表达发生改变，其中294种上调、334种下调（图1A）。对这628种差异表达蛋白进行富集分析发现，GO中的生物功能主要涉及炎症反应、免疫激活、脂质转运调控及ATP响应（图1B）。

KEGG富集分析显示，肿瘤的转录失调、IL-17信号通路、铁死亡等信号通路呈现显著富集（图1C），表明化结消瘤方对结直肠癌的调控作用可能具有多维度特性。在收集的131个铜死亡相关靶标中，有100个在蛋白组中被检测到（图1D），其中19个存在差异表达（图2A），且这些蛋白之间存在密切相互作用（图2B）。

2.2 熊果酸是化结消瘤方的入血成分

原儿茶酸、绿原酸、山柰酚、阿魏酸、补骨脂定、橙皮苷、异甘草苷、黄芩苷、熊果酸等20种化学成分均在血液中检测到（图2C、D，表1）。化结消瘤方中的17种中药均含有多种化学成分（图3A），其中5种药材均含有熊果酸（图3D），表明其为该方进入血液的重要成分之一。熊果酸是一种与结直肠癌、肝癌、肺癌、炎症等疾病密切相关的化学成分（图3B），在半枝连、藤梨根、草血竭、甘草、小冬青等中药材中均有分布（图3C）。

2.3 铜死亡相关差异表达基因（DEGs）的筛选

在收集的结直肠癌数据集中鉴定出1589个差异表达基因，其中908个上调，681个下调（图4A、C）。在转移性结直肠癌中筛选出3079个差异表达基因，其中1452个上调，1627个下调（图4B、C）。其中1309个基因在两次筛选中均显示出表达差异（图4D）。这1309个基因的扩散映射图谱可以区分结直肠癌、转移性结直肠癌和癌旁组织（图4E），且在表达热图中呈现显著差异（图4F）。

在收集的131个铜死亡相关基因中，有9个基因在结直肠癌患者具有差异表达（图5A），且这些基因的表达呈现一定的正相关性（图5B）。其中PPAT与HSPD1（correlation=0.87）、DNA2与FANCI（correlation=0.82）、DNA2与PPAT（correlation=0.78）、FANCI与HSPD1（correlation=0.78）等基因不仅存在显著差异，还显示出共表达关系（图5C）。

GEPIA2分析结果显示，CDKN2A高表达和DNA2、FDX1低表达的患者总生存期更短（图5D~5F，P<0.05），说明这3个基因可能为结直肠癌的预后提供重要指示。GEPIA2分析还证实了BOP1、CDKN2A、DNA2、FANCI、HSPD1、PPAT、SLC2A1、SLC7A11和SLC31A1在结直肠癌患者中确实具有表达差异（图6）。

2.4 熊果酸抗结直肠癌作用机制预测

预测出果酸的241个可能靶点，并将这些靶点导入STRING数据库分析PPI互作关系，并采用Cytoscape3.10软件构建PPI网络图谱（图7A）。通过MCODE插件分析后，PPI网络形成5个基因簇（图7B，表2）。这5个基因簇共包含54个节点，具有密切的相互作用关系（图7C）。簇1和簇2中的关键节点SLC2A1和SERPINE1是与铜死亡相关的基因，在前述的结直肠癌患者中也呈现出显著的表达差异。

54个靶点的KEGG富集分析主要聚焦在PI3K-Akt信号通路、结直肠癌相关通路、胰岛素抵抗、HIF-1信号通路等多个信号通路（图7E）。GO分析发现，BP富集的生物学过程与细胞内信号转导及含氧化合物反应相关。此外，还富集到了细胞质、核质、细胞器等细胞组分，以及蛋白激酶结合、信号受体结合、离子结合、小分子结合和ATP结合等分子功能（图7D），而这些功能都与铜死亡的发生密切相关。

鉴于熊果酸在临床上的广泛应用及其药理活性，将其与11个铜死亡相关的重要靶点进行了虚拟对接分析，其与BOP1、DNA2、FDX1、PPAT、SLC2A1和SLC7A11均具有结合潜力（图8、表3），且熊果酸与FDX1的结合分数超过100分。

2.5 熊果酸抑制结肠癌细胞生长

熊果酸可抑制HCT-116（IC₅₀=23.04 μmol/L）和LOVO（IC₅₀=39.90 μmol/L）的生长（图9A）。此外，熊果酸还能抑制结肠癌细胞的迁移（图9B）和克隆形成（图9C）。

2.6 熊果酸调节结直肠癌细胞的铜死亡

检测铜死亡相关指标，并观察到20 μmol/L熊果酸作用于结肠癌细胞后，丙酮酸（图9D）、Cu²⁺（图9E）和丙二醛（MDA）（图9G）显著蓄积，同时谷胱甘肽的含量水平明显下降（图9F）。在熊果酸作用下，结肠癌细胞中铜死亡关键标志物FDX1和SLC31A1的表达显著增加（图9H），而Cu²⁺的靶标蛋白DLAT表达下降（图9I）。

3 讨论

本研究通过整合蛋白质组学、网络药理学、分子对接及细胞实验，初步揭示了化结消瘤方及其主要入血成分熊果酸可能通过诱导铜死亡抑制结直肠癌的作用。蛋白质组学分析显示化结消瘤方能显著调节结直肠癌组织的蛋白表达谱，涉及炎症、免疫、代谢等多种通路，提示其抗肿瘤作用具有多靶点、多途径的特点。其中，铜死亡通路相关蛋白的变化为我们提供了深入探讨其机制的新视角。

铜死亡是近年来发现的一种由铜离子过度积累触发的程序性细胞死亡方式，涉及铜离子的摄取、分布、代谢及其引发的氧化应激和蛋白质毒性反应^［19］。小肠上皮细胞通过CTR1/SLC31A1转运蛋白摄取铜离子，而肠道疾病与铜死亡之间的关联值得深入探索和研究；FDX1和SLC31A1与铜稳态密切相关，在铜死亡过程中发挥重要作用^{［20， 21］}。本研究发现，化结消瘤方中的熊果酸能与铜死亡核心调控蛋白FDX1结合，并在细胞水平上证实其能抑制DLAT并上调FDX1和铜转运蛋白SLC31A1的表达，促进细胞内Cu²⁺蓄积，降低GSH水平，增加MDA和丙酮酸含量，说明熊果酸具有诱导铜死亡的能力。FDX1是铜依赖性细胞死亡的关键调节因子^［22］，而铜离子过载引起DLAT寡聚化导致细胞死亡^{［23， 24］}。熊果酸对这两个蛋白的调节作用，可能促进了铜离子在细胞内的积累及其后续的毒性效应。GSH作为重要的铜螯合剂和抗氧化分子^［25］，其耗竭是铜死亡发生的关键环节^{［26， 27］}。MDA的积累则反映了脂质过氧化程度的加剧^［28］。丙酮酸作为能量代谢的关键中间产物^［29］，其水平变化也与线粒体功能紊乱和铜死亡相关^{［30， 31］}。我们的结果表明，熊果酸可能通过干扰这一系列过程来触发结直肠癌细胞的铜死亡。

需要指出的是，铜死亡很可能只是化结消瘤方抗结直肠癌的机制之一。本研究蛋白质组学和网络药理学分析均提示，该方还能影响IL-17信号通路、铁死亡、PI3K-Akt通路等与肿瘤发生发展密切相关的多种通路。中药复方的特点是多成分、多靶点、多通路协同作用，熊果酸作为本方鉴定出的主要入血成分之一，其在整体药效中的贡献需要结合方中其他成分进行综合评估。未来研究可通过成分敲除/替代实验、全方与单一成分对比等策略，进一步明确熊果酸在化结消瘤方整体效应中的确切地位。

尽管本研究确定了铜死亡是化结消瘤方抗结直肠癌效应的机制之一，但本研究还存在一些局限性。首先，动物实验中分别使用大鼠进行入血成分分析和小鼠进行药效机制研究，虽基于物种间代谢的相似性，但未来可在同一模型中进行整合分析。其次，蛋白质组学要求生物学重复至少是3个，本研究每组的4个样本量仍然相对较小，后续需扩大样本以验证结果的稳定性。再者，本研究主要聚焦于铜死亡机制，未能全面验证其他富集通路的作用。后续研究还需验证铜死亡相关更多标志物的变化；开展化结消瘤方全方、熊果酸单体及“去熊果酸方”的对比研究，明确该成分的贡献；同时探究本方通过炎症、免疫等通路发挥抗肿瘤作用的机制，以全面阐释其科学内涵。

综上所述，化结消瘤方能导致结直肠癌细胞中多种蛋白表达出现差异，其作用涉及包括铜死亡在内的多个生物学过程。熊果酸作为化结消瘤方发挥抗结直肠癌作用的关键活性成分之一，可与铜死亡核心蛋白FDX1结合，导致结直肠癌细胞中丙酮酸和Cu²⁺的积累、GSH耗竭，抑制DLAT并上调FDX1和SLC31A1的表达，从而可能通过诱导铜死亡抑制肿瘤进展。本研究为理解化结消瘤方及熊果酸抗结直肠癌的作用机制提供了新的实验依据。

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基金资助

国家自然科学基金(82505189)

国家重点研发计划中医药现代化重点专项(2025YFC3508502)

湖北省自然科学基金(2023AFD067)

湖北省教育厅科学研究计划青年人才项目(Q20231904)

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