毛兰素通过阻断Wnt/β-catenin信号抑制乳腺癌细胞增殖和迁移

Erianin inhibits proliferation and migration of breast cancer cells in vitro by inhibiting Wnt/β-catenin signaling

摘要

目的 探讨毛兰素对乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及潜在的分子机制。 方法 分别用0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素处理乳腺癌细胞系T-47D和MCF-7，采用CCK-8法检测12、24、36、48、72 h的细胞活力；克隆形成、细胞划痕、Transwell侵袭和细胞衰老实验分别检测毛兰素对T-47D和MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭能力以及细胞衰老的影响。通过毛兰素mRNA微阵列以及Enrichr数据库探索毛兰素的生物学功能。通过流式细胞术检测不同浓度毛兰素对T-47D和MCF-7细胞凋亡率的影响。通过Western blotting检测细胞凋亡、上皮-间充质转化（EMT）以及Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达情况。 结果 毛兰素呈浓度依赖性抑制T-47D和MCF-7细胞活力、增殖、迁移与侵袭能力，并促进细胞衰老（P<0.05）。毛兰素相关mRNA微阵列分析结果显示，共有1064个差异表达基因（DEGs）（P<0.05），其中948个表达上调基因，116个表达下调基因。GO富集分析结果显示，毛兰素的DEGs主要富集在EMT的调节、含胶原蛋白的细胞外基质及钙离子结合等功能中；KEGG和WikiPathways富集分析结果显示，毛兰素可能通过调节PI3K-Akt信号通路、Wnt/β-catenin信号通路以及细胞凋亡影响乳腺癌的发生与进展。流式细胞术结果显示，毛兰素呈浓度依赖性诱导乳腺癌细胞凋亡（P<0.05）。Western blotting结果显示，随着毛兰素浓度升高，促凋亡蛋白Bax、Caspase3表达上升，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降（P<0.05）；EMT相关蛋白Snail、N-cadherin、β-catenin表达下降（P<0.05）；Wnt/β-catenin信号相关蛋白TCF4、Cyclin D1、c-Myc表达下降（P<0.05）；与100 nmol/L毛兰素组相比，100 nmol/L毛兰素+Wnt/β-catenin激动剂组TCF4、Cyclin D1、c-Myc表达增加（P<0.05）。 结论 毛兰素能抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞衰老和凋亡，其分子机制可能与阻断Wnt/β-catenin信号通路，协同诱导细胞凋亡并逆转EMT过程有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of erianin on proliferation, migration, invasion, and apoptosis of breast cancer cells and the underlying mechanisms. Methods Breast cancer cell lines T-47D and MCF-7 treated with 0, 12.5, 25, 50, and 100 nmol/L erianin for 12, 24, 36, 48, and 72 h were examined for cell viability using CCK-8 assay. The effects of erianin on cell proliferation, migration, invasion, senescence and apoptosis were evaluated using clone formation, wound healing, Transwell invasion, and senescence assays and flow cytometry. mRNA microarray analysis and the Enrichr database were used to explore the biological functions of erianin. Western blotting was used to detect the changes in protein expressions related to apoptosis, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and the Wnt/β-catenin pathway. Results Erianin concentration-dependently inhibited cell viability, proliferation, migration, and invasion, and promoted senescence in T-47D and MCF-7 cells. Microarray analysis identified 1064 differentially expressed genes (DEGs), including 948 upregulated and 116 downregulated genes, which were involved primarily in EMT regulation, collagen-containing extracellular matrix, calcium ion binding, the PI3K-Akt signaling pathway, the Wnt/β-catenin signaling pathway, and apoptosis. Flow cytometry confirmed that erianin concentration-dependently induced apoptosis in the breast cancer cells, upregulated the expressions of Bax and caspase-3, decreased Bcl-2 expression, and lowered the expressions of EMT-related proteins (Snail, N-cadherin, and β‑catenin) and Wnt/β‑catenin signaling proteins (TCF4, Cyclin D1, and c-Myc). In the breast cancer cells treated with 100 nmol/L erianin, the application of a Wnt/β‑catenin agonist significantly increased the proteins expressions of TCF4, Cyclin D1, and c-Myc. Conclusion Erianin inhibits proliferation, migration, and invasion and induces senescence and apoptosis in breast cancer cells possibly by suppressing the Wnt/β-catenin signaling pathway to induce cell apoptosis and reverse EMT of the cells.

Graphical abstract

关键词

毛兰素 / 乳腺癌 / 上皮-间充质转化 / Wnt/β-catenin信号通路

Key words

erianin / breast cancer / epithelial to mesenchymal transition / Wnt/β-catenin signaling pathway

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因，占全球癌症总数11.6%，发病率仅次于肺癌^［1］。作为高度异质性的恶性肿瘤，乳腺癌在形态学特征、生物学行为、临床进展及预后转归等方面均展现出显著多样性^［2］。在治疗策略上，早期乳腺癌（I期和II期）患者主要采用改良根治术或保乳手术治疗。尽管可以有效切除病灶，但外科手术也会造成较的大身体创伤，损害患者肢体功能，且术后复发率高达15%^［3］。晚期乳腺癌（III期和ⅣIV期）患者主要采用化疗，方案包括多种药物组合，如蒽环类药物、抗代谢物、烷化剂和铂类化合物。然而，化疗药物与严重副作用有关，包括胃肠道紊乱、骨髓抑制、卵巢和甲状腺毒性以及耐药性产生^［4］，5年存活率低至32%^［5］。因此，探索新的辅助治疗方法并明确分子机制对提高乳腺癌患者生存时间具有重要临床意义。

毛兰素是从传统药用植物铁皮石斛中分离得到的一种天然联苄类化合物，可通过抗血管生成、诱导细胞死亡和周期停滞、调节免疫炎症反应以及调控多种信号通路等多种生物学途径发挥抗肿瘤效应^［6］。据研究报道，毛兰素可通过促进结直肠癌中GPX4泛素化降解触发铁死亡^［7］；亦可通过抑制急性髓系白血病中PI3K/AKT信号抑制肿瘤细胞增殖^［8］。此外，毛兰素还能选择性抑制丙酮酸羧化酶进而抑制肝癌细胞增殖和迁移^［9］。这表明，毛兰素具有多靶点抗肿瘤潜力，有望成为一种有前景的癌症辅助治疗药物。在乳腺癌研究方面，毛兰素可抑制SRC介导的胆固醇代谢、阻断NFATc1和整合素β3-MMP9信号，从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移和骨转移^{［10， 11］}。Wnt/β-catenin信号通路在人恶性肿瘤中普遍被激活，可促进癌细胞增殖和上皮间质转化（EMT）^［12］。已有研究表明一些中药成分通过调控该通路对乳腺癌产生治疗效果^［13］。然而，毛兰素是否通过该通路影响乳腺癌进展尚不明确。因此，本研究通过体外实验探讨毛兰素对乳腺癌T-47D和MCF-7细胞表型的影响，包括细胞活力、增殖、迁移、侵袭、衰老和细胞凋亡；在分子机制方面，本研究重点探讨毛兰素对EMT和Wnt/β-catenin信号通路的影响，旨在为临床研究毛兰素治疗乳腺癌提供初步的实验证据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌细胞株T-47D和MCF-7（武汉赛维尔生物科技有限公司）；毛兰素（上海迈瑞尔生化科技有限公司）；10%胎牛血清、1%链霉素/青霉素、DMEM培养基（赛维尔）；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TRIzol试剂（赛默飞世尔科技公司）；RNA 6000 Nano试剂盒（安捷伦科技有限公司）；Bax、Caspase-3、Bcl-2、Snail、N-cadherin、β-catenin、TCF4、Cyclin D1、c-Myc、HRP标记的抗兔IgG、GAPDH抗体（碧云天）。Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001（上海翌圣生物科技股份有限公司）。

1.2 细胞培养

人乳腺癌细胞株T-47D和MCF-7培养在含10%胎牛血清和1%链霉素/青霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO₂的加湿培养箱中培养。

1.3 CCK-8实验

收集对数生长期T-47D和MCF-7细胞，以3000/孔的细胞密度接种于96孔板，培养24 h后加入含0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素的DMEM培养基，于37 ℃和5%CO₂培养箱中培养。培养12、24、36、48、72 h后，加入10 μL/孔 CCK-8溶液，继续培养2 h后，使用酶标仪测量光密度A_{450 nm}。细胞活力（%）=［（A_实验组-A_空白孔）/（A_对照组-A_空白孔）］×100%。

1.4 克隆形成实验

使用0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素处理T-47D和MCF-7细胞48 h后，以500/孔的细胞密度接种到6孔板，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中，培养14 d，中途不换液，使用4%多聚甲醛固定细胞15 min，使用0.1%结晶紫染色15 min，洗涤干燥后使用倒置显微镜拍照，使用Image-J软件计数细胞克隆数。克隆形成率（%）=克隆细胞数/500×100%。

1.5 细胞划痕实验

使用0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素处理T-47D和MCF-7细胞48 h后，以2×10⁵/孔接种到6孔板，培养24 h后进行划痕实验。使用10 μL枪头在细胞单层上垂直划出均匀的划痕，在0 h拍照记录划痕初始状态。培养24 h后，使用显微镜拍照记录划痕区域作为24 h。细胞迁移率=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.6 Transwell侵袭实验

将基质凝胶用PBS稀释后均匀铺在Transwell上室，并在37 ℃培养箱中干燥1 h。使用0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素处理T-47D和MCF-7细胞48 h后，将包含5×10⁴个细胞的无胎牛血清的DMEM加入Transwell上室，Transwell下室加入含20%胎牛血清的DMEM。培养48 h后，使用多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色15 min后，在倒置显微镜下观察计数拍照。细胞侵袭率（%）=（处理组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数）×100%。

1.7 细胞衰老实验

使用0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素处理T-47D和MCF-7细胞48 h后，以2×10⁵/孔接种到6孔板。根据细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明，首先移去培养基，然后加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温下固定15 min。PBS清洗后，加入1 mL/孔β-半乳糖苷酶染色工作液，在37 ℃培养箱中培养过夜。在倒置显微镜下随机选6个视野进行拍照分析。

1.8 毛兰素mRNA微阵列分析

使用100 nmol/L毛兰素处理T-47D细胞48 h，每组设置3个生物重复。使用TRIzol试剂提取细胞总RNA。RNA浓度由NanoDrop 2000紫外分光光度计测定，RNA完整性通过RNA 6000 Nano试剂盒评估。随后，文库构建、质量控制和深度测序由华大基因公司进行，使用DESeq2软件分析两组样品中的mRNA，R软件中的limma包鉴定差异表达基因（DEGs），阈值设置为|LogFC|>1和P<0.05。

1.9 DEGs生物学功能分析

通过Enrichr网站（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/）分析DEGs可能的生物学功能途径和信号机制，包括基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和WikiPathways信号通路富集分析。其中，GO包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.10 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

使用0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素处理T-47D和MCF-7细胞48 h后，再用不含EDTA的胰酶消化细胞，转移到离心管内，1000 g离心5 min，弃上清，用PBS轻轻重悬制成细胞悬液并计数。取1×10⁵重悬细胞，1000 g离心5 min，弃上清，加入500 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，轻轻混匀。避光孵育10 min，然后使用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.11 Western blotting实验

使用0、12.5、25、50、100 nmol/L毛兰素处理T-47D和MCF-7细胞48 h后，收集细胞并使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏氟乙烯膜上，使用5%脱脂牛奶封闭膜1 h。然后，与兔抗Bax（1∶1000），Caspase-3（1∶1000），Bcl-2（1∶1000），Snail（1∶1000），N-cadherin（1∶1000），β-catenin（1∶1000），TCF4（1∶1000），Cyclin D1（1∶1000）以及c-Myc（1∶1000）在4 ℃下孵育过夜。使用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗（1∶5000）在室温下孵育1 h。使用ECL化学发光试剂盒观察蛋白质条带。内参选用GAPDH（1∶5000）。使用Image-J对结果进行定量分析。

1.12 统计学分析

使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.5和R 4.3.0软件进行统计分析并绘制图表。本研究中实验均独立重复至少3次，计量资料以均数±标准差表示，两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 毛兰素抑制乳腺细胞活力

CCK-8结果显示，不同浓度（0、12.5、25、50、100 nmol/L）毛兰素作用于T-47D和MCF-7细胞12、24、36、48、72 h后，细胞活力随毛兰素浓度的升高、作用时间的延长而降低（P<0.05，图1）。在毛兰素浓度为100 nmol/L、处理时间48 h时，细胞活力抑制效果最显著。

2.2 毛兰素抑制乳腺癌细胞增殖

克隆形成实验结果显示，T-47D和MCF-7细胞增殖能力随毛兰素浓度的升高而降低（P＜0.001，图2）。

2.3 毛兰素抑制乳腺癌细胞迁移

细胞划痕实验结果显示，T-47D和MCF-7细胞迁移能力随毛兰素浓度的升高而降低（P<0.05，图3）。

2.4 毛兰素抑制乳腺癌细胞侵袭

Transwell侵袭实验结果显示，T-47D和MCF-7细胞侵袭能力随毛兰素浓度的升高而降低（P<0.001，图4）。

2.5 毛兰素诱导乳腺癌细胞衰老

细胞衰老实验结果显示，T-47D和MCF-7衰老细胞数随毛兰素浓度的升高而增加（P<0.05，图5）。

2.6 毛兰素mRNA微阵列和生物学功能分析

基于|LogFC|>1和P<0.05标准，火山图共筛选出1064个DEGs，其中948个表达上调基因，116个表达下调基因（图6）。GO富集分析显示，毛兰素在乳腺癌中的生物学功能可能与EMT的调节、含胶原蛋白的细胞外基质及钙离子结合等功能相关；KEGG和WikiPathways富集分析显示，毛兰素可能通过调节PI3K-Akt信号通路、Wnt/β-catenin信号通路以及细胞凋亡影响乳腺癌的发生与进展（图7）。

2.7 毛兰素诱导乳腺癌细胞发生凋亡

流式细胞术结果显示，T-47D和MCF-7细胞凋亡率随毛兰素浓度的升高而增加（P<0.001，图8）。Western blotting结果显示，T-47D和MCF-7细胞中促凋亡蛋白Bax和caspase3表达随毛兰素浓度的升高而增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达随毛兰素浓度的升高而降低（P<0.05，图9）。

2.8 毛兰素抑制乳腺癌细胞EMT过程

Western blotting结果显示，T-47D和MCF-7细胞中EMT标志蛋白Snail、N-cadherin、β-catenin表达随毛兰素浓度的升高而降低（P<0.001，图10）。

2.9 毛兰素阻断乳腺癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路

Western blotting结果显示，T-47D和MCF-7细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白TCF4、Cyclin D1、c-Myc表达随毛兰素浓度的升高而降低；加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001（40 μmol/L）后，TCF4、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达较100 nmol/L毛兰素组有所增加（P<0.01，图11）。

3 讨论

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，其发病机制复杂且治疗抵抗性强，亟需开发新型治疗策略。近年来，植物来源活性成分在肿瘤治疗中因其独特药理活性、优异疗效、较低毒性和天然生物靶点结构契合度而备受关注^{［14， 15］}。毛兰素是铁皮石斛的主要活性成分之一，属于植物雌激素类天然联苄化合物，具有广泛而有效的药用价值和生物活性^［16］。已被证实在结直肠癌^［7］、肝癌^［9］、胰腺癌^［17］、胃癌^［18］及肺腺癌^［19］等多种实体瘤中表现出显著的抗肿瘤活性，但其在乳腺癌中的潜在作用机制尚不完全明确。因此，本研究通过体外实验系统性探索毛兰素在乳腺癌细胞中作用机制。细胞实验表明，毛兰素呈浓度依赖性抑制乳腺癌细胞T-47D和MCF-7增殖、迁移和侵袭能力，并诱导细胞衰老和凋亡，强调毛兰素具有作为有效小分子药物抑制乳腺癌进展的潜力。在分子机制方面，本研究发现毛兰素可以抑制乳腺癌细胞中的Wnt/β-catenin信号并逆转EMT过程。

为深入揭示其作用机制，本研究使用100 nmol/L毛兰素处理T-47D细胞48 h后进行mRNA微阵列分析来指导后续研究方向。生物信息学富集结果显示，大量癌症相关术语被发现与毛兰素相关。其中，毛兰素的DEGs显著富集于细胞凋亡、EMT以及Wnt/β-catenin等癌症相关信号通路，后续实验从以下3个层面展开机制研究。

在细胞凋亡方面，细胞凋亡作为维持组织稳态和清除潜在有害细胞的关键生理机制，也是抗癌治疗的重要靶点^［20］。其中，Bax和caspase-3作为关键的促凋亡蛋白，与抗凋亡蛋白Bcl-2之间的平衡在肿瘤细胞存活中起核心调控作用^{［21， 22］}。 本研究通过流式细胞术发现，毛兰素处理可呈浓度依赖性提高乳腺癌细胞的凋亡率；Western blotting结果进一步证实，随着毛兰素浓度升高，Bcl-2蛋白表达下调，而Bax和Caspase-3则显著上调，表明毛兰素可有效诱导乳腺癌细胞凋亡。

在转移抑制方面，远处转移导致的治疗失败和预后不良是晚期乳腺癌患者管理的主要障碍^［23］。EMT作为肿瘤细胞发生转移的标志性事件之一，其特征是将肿瘤细胞极性的上皮细胞转化为具有迁移能力的间充质细胞，以获得更强的侵袭和迁移能力的过程^［24］。EMT过程受到多种转录因子调控（如Twist1、Slug和Snail），它们通过抑制上皮标志物E-cadherin表达，进而促进间充质标志物Vimentin和N-cadherin表达，从而介导细胞表型转变^［25］。近年来的研究也证实，抑制EMT可以有效延缓乳腺癌进展。如依折麦布通过靶向TGFβ2并抑制EMT过程来抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭能力^［26］。蟾毒灵通过调控STAT3/EMT信号轴并抑制EMT，有效抑制乳腺癌细胞增殖和转移并增加细胞凋亡^［27］。本研究通过Western blotting同样发现，毛兰素能抑制乳腺癌细胞中Snail、N-cadherin和β-catenin表达，从而进一步强调了毛兰素具有抑制乳腺癌EMT的潜力。

在分子机制层面，Wnt/β-catenin信号通路是一种高度保守的信号通路，通过参与多种生物过程，包括致癌转化、基因组不稳定性、癌细胞增殖、干性、新陈代谢、细胞死亡、免疫调节和转移等影响肿瘤的发生、发展^［28］。尤其值得注意的是，Wnt/β-catenin信号通路通过驱动EMT，成为癌症转移和耐药的核心驱动因素，从而促进肿瘤进展^［29］。当E-cadherin表达下调时，位于细胞核的β-catenin能够与转录因子TCF/LEF形成复合物，诱导EMT相关转录因子表达，从而激活EMT^［30］。因此，Wnt/β-catenin信号通路作为癌症中普遍被激活的通路，被激活后可促进癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。为验证毛兰素抑制乳腺癌细胞的增殖与转移是通过影响该通路实现的，本研究通过Western blotting检测了毛兰素对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响，结果显示，随着毛兰素浓度的升高，β-catenin结合因子TCF4及其下游靶基因Cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平逐渐受到抑制，通过回复实验对比100 nmol/L毛兰素组和100 nmol/L毛兰素+Wnt/β-catenin激动剂组，发现后者表达增加，证实了毛兰素通过抑制Wnt/β-catenin信号通路下调TCF4、Cyclin D1和c-Myc表达，进而影响乳腺癌侵袭转移的机制。结合既往研究，铁皮石斛中其他主要活性物质，如石斛碱、石斛酚和白藜芦醇等，也通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肿瘤疗效^［31-33］。本研究首次明确毛兰素作为铁皮石斛的另一重要成分，在乳腺癌中也展现出抑制Wnt/β-catenin信号通路的潜力。此外，该通路不仅调控EMT过程，还被证实广泛参与细胞凋亡信号^［34-36］。基于以上结果，推测毛兰素可能通过阻断Wnt/β-catenin信号通路，协同诱导细胞凋亡并逆转EMT过程，从而发挥抗乳腺癌作用。

本研究的不足之处：研究主要基于T-47D和MCF-7乳腺癌细胞系展开，在动物体内模型中的效果仍有待验证；研究采用雌激素受体、孕激素受体阳性的乳腺癌细胞系，尚不能明确对HER2阳性或三阴性乳腺癌是否具有相似作用；研究虽证实毛兰素可抑制Wnt/β-catenin信号通路，但该通路的上游调控机制尚不明确，毛兰素是否直接作用于通路关键分子（如β-catenin、TCF4）仍需在后续研究中进一步探索。

综上所述，毛兰素能够抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，并促进细胞衰老和凋亡，其分子机制可能与阻断Wnt/β-catenin信号通路并抑制EMT有关。毛兰素有望成为治疗乳腺癌的候选药物。

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基金资助

安徽省卫健委科研项目(AHWJ2023A30031)

六安市科技计划项目(2024lakjey09)

安徽省教育厅科研项目(2022AH040357)

安徽省教育厅自然科学重点项目(2024AH051976)

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