多功能中空硫化铜复合纳米颗粒联合光热光动力治疗抑制食管癌的恶性进展

Hollow copper sulfide nanocomposites combined with photothermal and photodynamic therapy inhibits malignant behaviors of esophageal cancer cells

摘要

目的 制备负载光敏剂IR780的中空Cu₉S₈复合纳米载药系统，探讨其对食管癌光热-光动力（PTT-PDT）的联合治疗效果及潜在作用机制。 方法 采用牺牲模板法制备具有中空结构的Cu₉S₈纳米颗粒，并利用相变材料月桂酸将光敏剂IR780进行包覆，构建复合纳米颗粒IR780@Cu₉S₈。通过透射电镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、紫外-可见光谱（UV-Vis）等对其形貌与结构进行系统表征。通过CCK-8、细胞活死染色、ROS及线粒体膜电位检测、细胞划痕、Transwell等方法评估其在近红外（808 nm，1.5 W/cm²，5 min）激光照射下对食管癌细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性行为的影响。通过构建小鼠食管癌同种移植模型，进一步评估IR780@Cu₉S₈复合纳米颗粒在体内PTT-PDT联合抗肿瘤疗效及生物安全性。 结果 本研究制备的IR780@Cu₉S₈复合纳米颗粒呈均一空心类球形结构，光热转换效率约为44.0%。在近红外照射下，IR780@Cu₉S₈可实现显著的PTT-PDT协同抗肿瘤疗效，KYSE150细胞活力下降（P<0.001），增殖、迁移和侵袭能力也得到抑制（P<0.001）。体内实验同样表明其可在808 nm激光照射后，具有PTT与PDT协同增效，可抑制荷瘤小鼠肿瘤体积的生长（P<0.001），同时具有良好的生物相容性。 结论 IR780@Cu₉S₈复合纳米颗粒通过整合PTT与PDT的优势，实现光动力与光热效应的协同抗肿瘤作用，为食管癌的联合治疗及靶向药物递送研究提供了新策略。

Abstract

Objective To develop a hollow Cu₉S₈-based nanoparticles loaded with the photosensitizer IR780, investigate its photothermal and photodynamic (PTT-PDT) effects against esophageal cancer cells and analyze the underlying mechanisms. Methods Hollow Cu₉S₈ nanoparticles were synthesized using a sacrificial-template strategy, and IR780 was encapsulated within a lauric acid matrix to serve as a phase-change material for preparing IR780@Cu₉S₈ composite nanoparticles. The composite nanoparticles were characterized for morphology and structural attributes using transmission electron microscopy, X-ray diffraction, and UV-visible spectroscopy. The effects of IR780@Cu₉S₈ on proliferation, invasion, and migration of esophageal cancer cells under near-infrared (NIR) irradiation (808 nm, 1.5 W/cm², 5 min) were assessed using CCK-8 assay, live/dead staining, reactive oxygen species, mitochondrial membrane potential assay, wound-healing assay, and Transwell assay. The in vivo PTT-PDT therapeutic efficacy and biosafety of IR780@Cu₉S₈ was evaluated in a mouse model bearing subcutaneous esophageal cancer xenografts. Results The synthesized IR780@Cu₉S₈ nanoparticles exhibited a uniform quasi-spherical morphology with a photothermal conversion efficiency of 44.0%. Under NIR irradiation, IR780@Cu₉S₈ produced pronounced synergistic PTT-PDT effects against KYSE150 cells, causing a significant reduction of cell viability and marked suppression of cell proliferation, migration, and invasion. In the tumor-bearing mice, IR780@Cu₉S₈ and 808 nm laser irradiation exhibited strong synergistic PTT-PDT effects and significantly inhibited tumor growth with a good biocompatibility. Conclusion The IR780@Cu₉S₈ composite nanoparticles achieve synergistic PTT-PDT antitumor activity in esophageal cancer cells which can be a promising strategy for combined therapy and targeted drug delivery for esophageal cancer.

Graphical abstract

关键词

食管癌 / 光热治疗 / 光动力治疗 / IR780 / Cu₉S₈

Key words

esophageal cancer / photothermal therapy / photodynamic therapy / IR780 / Cu₉S₈

根据世界卫生组织国际癌症研究署2022年统计报告显示，食管癌在全球恶性肿瘤发病和死亡中分别位于第11、7位^［1］。尽管传统手术、放疗、化疗及其联合治疗方案在改善食管癌患者的疗效与预后方面取得了一定进展，但对于术后复发或局部无法切除的患者而言，现有疗法仍面临疗效有限、并发症发生率较高以及生活质量下降等挑战，临床迫切需要更为安全有效的联合治疗策略^［2］。随着纳米科技的发展，光动力治疗（PDT）、光热治疗（PTT）等新兴疗法的诞生，为食管癌治疗提供了新的思路^［3］。

PDT是利用光敏剂（PS）和特定波长的激光光源，在氧分子参与下产生大量活性氧（ROS），其可通过两种途径导致细胞死亡：微血管系统破坏和免疫应答^［4，5］。由于PS倾向于定位在癌细胞内，ROS扩散距离短，且所用光源局部照射，PDT对周围神经和细胞外基质的影响较小，因而适用于被关键结构（如主动脉、气管等）包围的肿瘤，包括食管癌、肺癌^{［6， 7］}。对于不能耐受手术、术后复发或局部无法切除的食管癌患者，PDT能够在内镜下对病灶区域实现相对选择性的能量沉积与组织损伤，具有微创、选择性强和毒性低等优势，已成为该类患者重要的补充治疗手段^［8］。值得注意的是，PDT（尤其是以他拉泊芬为基础的挽救性PDT）在EC领域已积累了较为明确的临床证据。一项多中心Ⅱ期研究显示，对于放化疗/放疗（CRT/RT）后出现局部残留或复发的患者，他拉泊芬的局部完全缓解率可达88.5 %，提示其具有良好的局部清除能力与临床可行性^［9］；近年的回顾性研究亦支持其在局部复发食管鳞癌人群中可获得较持久的局部控制且总体安全性良好^{［10， 11］}。

尽管PDT在食管癌的早期治疗方面具有一定优势，但其进一步临床推广仍面临瓶颈，包括高效PS的匮乏、光源在组织中的穿透深度有限以及乏氧和酸性微环境对ROS生成与治疗反应的抑制。因此，构建新型纳米药物递送系统以提升PS递送效率、改善乏氧并增强PDT疗效，是推动PDT肿瘤诊疗转化的重要方向。同时，将PDT与PTT、免疫治疗等策略联合应用，有望进一步放大疗效并拓展其在食管癌中的适用范围。

PTT通过光热转换剂（PTA）在特定波长的光源照射下，将光能转化为热能，从而诱导肿瘤细胞热损伤与消融。当肿瘤局部温度升至41 ℃时，细胞可产生热休克蛋白，以减轻热损伤的影响；温度维持在42~52 ℃，短时间即可引起细胞坏死；若组织温度大于60 ℃，蛋白变性和胞膜破坏可导致细胞瞬时死亡^{［4，12-15］}。PTT按温度划分，可分为传统的光热治疗（>45 ℃）和温和光热治疗（≤45 ℃）。传统的PTT对于肿瘤细胞具有较高杀伤力的同时也无法避免对正常细胞造成损伤；相较于传统的PTT，温和光热治疗安全性更高，但单独应用时杀伤能力也更低。此外，由于PTT受到深部组织穿透深度有限、对周围组织的热损伤、热休克蛋白介导的耐热性等因素的影响，单独PTT往往难以实现肿瘤的完全消融并存在复发风险，因而更适合与其他疗法联合以获得协同增效。

为弥补PDT与PTT各自的局限性，研究者提出并发展了多种基于纳米递送系统的联合治疗策略，能够在一定程度上克服单一治疗模式下的局限性，从而提高治疗效率、降低剂量及减少副反应^［16］。纳米材料因尺寸小、比表面积大，兼具靶向递送与控释潜力，并可借助肿瘤组织增强渗透与滞留效应（EPR）实现被动富集，从而在局部光照下产生更强治疗效应^{［17， 18］}。铜基纳米材料是一种在纳米尺度下制备的含铜材料，具有高比表面积和独特的理化性质，其在近红外光照下通常具有良好的光热转换能力，同时可作为载体递送PS或药物，提高PDT或放化疗敏感性，因而在多模式协同治疗中展现出广阔应用前景^［19-21］。然而，现有部分多功能纳米体系仍存在组成复杂、可重复性不足及作用机制不清等问题，限制了其进一步转化^{［16， 22， 23］}。由此，开发合成路线简洁、组成明确且兼具多重治疗功能的纳米平台，已成为亟待解决的关键科学问题。

本课题组前期工作中，成功优化并制备了中空Cu₉S₈纳米颗粒，其具有良好的光热转换潜力，且中空结构利于提高药物的负载^{［24， 25］}。IR780作为一种具有优异近红外吸收特性与光热转化效率的小分子PS，在PDT研究中得到广泛应用^［26-28］。基于此，本研究首次引入相变材料月桂酸作为稳定载体，将IR780包载于中空Cu₉S₈内部，构建成分相对稳定且制备方法可控的IR780@Cu₉S₈纳米递送系统，在近红外照射下可实现温和光热效应并高效诱导ROS生成，从而协同发挥PDT-PTT作用，进一步促进肿瘤细胞凋亡与坏死，为EC的临床转化提供新思路。

1 材料和方法

1.1 细胞与实验动物

1.1.1 细胞系

KYSE150细胞、HUVEC细胞、AKR细胞由河南省微生态与食管癌防治重点实验室提供。

1.1.2 实验动物

6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量18±3 g，无特定病原体（SPF）级别，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司［生产许可证号：SCXK（京）2024-0001］，在SPF级动物房饲养［使用许可证号：SYXK（京）2024-0010］，环境温度20~26 ℃，湿度40%~60%。本研究经医学伦理委员会批准（伦理批号：D-2025-002），实验设计及实施过程中严格遵循动物实验的“3R”原则。

1.2 主要试剂与仪器

氯化铜（CuCl₂，纯度>99.0%）、氢氧化钠（NaOH，纯度>99.9%）、L-抗坏血酸（AA，纯度>99.7%）、硫代硫酸铵（（NH₄）₂S，22%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，相对分子质量约55 000）、IR780［阿拉丁（中国上海）］；CCK-8检测试剂（Inviegech）；ROS检测试剂盒、DAPI、triton X-100、多聚甲醛（PFA，4%）、Calcein-AM/PI细胞毒性测定试剂盒、Hoechst 33342、结晶紫染色液（碧云天生物技术有限公司）；细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（凯基生物技术有限公司）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），荧光素（FITC）TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、Anti-Ki-67抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

倒置光学显微镜（尼康），Evos M7000荧光显微镜（赛默飞科技有限公司），激光共聚焦显微镜（徕卡仪器有限公司），JEM-200透射电子显微镜（日立），紫外分光光度计（岛津公司），Zetasizer Pro纳米粒度电位仪（马尔文仪器有限公司），HIKMICRO手持红外热成像仪（浙江海康微影传感科技有限公司），LWIRPO-808-7F激光器（北京镭志威光电技术有限公司）。

1.3 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的制备及表征

称取0.017 g的CuCl₂与0.10 g的PVP，依次溶解于50 mL去离子水中，在磁力搅拌条件下反应5 min。随后加入2 mL含有0.016 g NaOH的水溶液，继续搅拌5 min。加入2 mL含有0.0352 g AA的水溶液，搅拌5 min后，再加入23 μL的（NH₄）₂S溶液，待反应20 min，离心分离收集产物，即得到中空Cu₉S₈。

将Cu₉S₈（1 mg）、月桂酸（0.4 g）和IR780（0.005 g）加入1 mL甲醇中混合，避光搅拌2 h后分离收集产物，并用去离子水和甲醇清洗2遍，即可得到负载月桂酸及IR780的中空Cu₉S₈纳米颗粒，命名为IR780@Cu₉S₈。

使用透射电子显微镜（TEM，200 kV，×200 000）观察Cu₉S₈及IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的形貌，紫外可见分光光度计测定IR780、Cu₉S₈及IR780@Cu₉S₈的吸收光谱，X射线衍射仪（XRD）检测IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的组成及晶体结构，粒径仪检测Cu₉S₈及IR780@Cu₉S₈的粒径大小。

1.4 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的光热性能检测

使用808 nm激光器，以不同功率密度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 W/cm²）照射IR780@Cu₉S₈（50 μg/mL）溶液，记录温度变化；选取1.5 W/cm² 的激光密度照射不同浓度（0、10、20、50、100、200 μg/mL）IR780@Cu₉S₈溶液，照射时间均为10 min，每30 s记录1次温度，绘制升温曲线。为测试其光热稳定性，将IR780@Cu₉S₈（50 μg/mL）溶液进行循环激光照射，每30 s记录1次温度。光热转换效率（η）计算方法如下：η=（m×c×（T_max-T_max，H2O ））/（I×（1-10^-A808 ）×τ_s ）。其中，m为溶液质量，c为水的比热容（4.2 J/g·℃），T_max 和T_max，H2O 分别为IR780@Cu₉S₈与纯水的最高温度，I为激光功率密度（1.5 W/cm²），A₈₀₈ 为808 nm处的吸光度，{\tau }_s为冷却曲线线性拟合所得时间常数。

1.5 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的细胞毒性检测

1.5.1 CCK-8细胞活力检测

将KYSE150细胞（简称细胞）或HUVEC细胞以5×10³/孔接种于96孔板中，待细胞培养到80 %时，用不同浓度（0、5、10、20、50、100、200、400 μg/mL）IR780@Cu₉S₈处理，光照组（+L）在37 ℃孵育4 h后，给予1.5 W/cm²、808 nm激光照射5 min，继续37 ℃孵育2 h。随后加入100 μL/孔 RPMI 1640培养基和10 μL/孔 CCK-8检测液，孵育2 h后使用BioTek多功能酶标仪测定吸光度A_{450 nm}。细胞活力=（A_实验组-A_背景组）/（A_对照组-A_背景组）×100 %。

1.5.2 细胞活死染色

将细胞以1×10⁵/孔接种于12孔板中，培养至约80%时按对照组、Cu₉S₈、IR780@Cu₉S₈、Con+L、Cu₉S₈+L、IR780@Cu₉S₈+L进行处理（后续体外实验均按此分组），药物浓度为50 μg/mL，+L组在药物处理后，继续37 ℃孵育4 h后，随后给予1.5 W/cm²的808 nm激光照射5 min，继续37 ℃孵育2 h，加入500 μL/孔 Calcein-AM/PI工作液，37 ℃避光孵育30 min。使用Evos M7000荧光显微镜观察细胞荧光染色情况并拍照。

1.5.3 克隆实验

将细胞以1×10³/孔接种于6孔板中，37 ℃孵育48 h后给予不同处理，随后继续培养至皿底出现明显细胞菌落，加入4% PFA固定1.5 h，10 %结晶紫染色1 h，PBS清洗3次，进行拍照并计数。

1.5.4 划痕实验

将细胞以1.5×10⁵/孔接种于12孔板中，待细胞贴壁长至80%时，将细胞划开。PBS洗去掉落细胞，按组别进行不同处理，分别在37 ℃孵育0、24 h时采用尼康显微镜对划痕区域拍照，并分析不同时间点划痕面积的变化，计算划痕相对迁移率。

1.5.5 Transwell实验

将细胞饥饿处理24 h，按组别进行处理后制成细胞悬液。小室上层加入60 μL提前配置好的基质胶，待基质胶凝固后弃去上清，加入100 μL RPMI 1640培养基37 ℃水化30 min，上层加入100 μL提前准备好的细胞悬液（3×10⁵/mL），下层加入500 μL完全培养基，37 ℃孵育48 h。随后使用4% PFA固定1 h，10 % 结晶紫染色30 min，PBS清洗3次，棉签擦去上层基质胶，使用尼康显微镜观察小室底部细胞数目并拍照。

1.5.6 ROS荧光染色

将细胞以1×10⁵/孔接种于12孔板中，待细胞培养至约80%时按照组别进行不同处理，随后加入300 μL/孔ROS工作液，37 ℃避光孵育30 min，使用Evos M7000荧光显微镜观察细胞内荧光变化并拍照。

1.5.7 JC-1荧光染色

将细胞以5×10³/皿接种于共聚焦皿中，培养48 h后按照组别进行处理，加入300 μL/孔JC-1工作液，37 ℃避光孵育30 min，使用配置的洗液洗涤3次，经Hoechst 33342工作液染核后，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.6 动物实验

1.6.1 小鼠皮下荷瘤构建及处理

将AKR细胞悬液（2×10⁷/mL） 100 μL/只皮下注射至小鼠背部，建立荷瘤模型。肿瘤体积达到80 ~ 100 mm³时，将小鼠随机分为6组（3只/组）：对照组（生理盐水）、Cu₉S₈、IR780@Cu₉S₈、Con+L、Cu₉S₈+L、IR780@Cu₉S₈+L。每2 d给予瘤内注射生理盐水、Cu₉S₈（2 mg/kg）、IR780@Cu₉S₈（2 mg/kg），注射30 min后，+L组给予808 nm照射肿瘤部位（45 ℃，5 min），共治疗6次。每2 d监测小鼠体质量及肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积（mm³）=（长度×宽度²）/2。观察期结束（第13天）对小鼠施行安乐死，取小鼠血液、肿瘤及主要脏器进行后续实验。实验过程中，肿瘤体积一旦超过2000 mm³，即对小鼠施行安乐死。

1.6.2 溶血实验

小鼠新鲜血样（1 mL）经乙二胺四乙酸（EDTA）稳定后，2000 r/min、4 ℃离心10 min，得到红细胞后用PBS洗涤3次，用生理盐水将洗涤后的红细胞稀释成2 %的红细胞悬液。用2 %红细胞悬液配置不同浓度的IR780@Cu₉S₈，阳性对照组用纯水配置，阴性对照组为2 %红细胞悬液，在37 ℃下孵育1 h。按2000 r/min离心10 min后，对EP管进行拍照记录并收集上清，检测吸光度A_{540 nm}。溶血率（%）=（A_sample-A_c（-））/（A_c（+）-A_c（-））×100 %，其中，A_sample、A_c（-）和A_c（+）分别为样品组、阴性对照组和阳性对照组在540 nm处的吸光度。

1.6.3 组织病理学染色

收集的肿瘤和脏器在4% PFA溶液中固定24 h，脱水后进行石蜡包埋，制成厚度为4 ~ 5 μm的切片。然后分别进行下列染色：（1）HE染色：使用苏木精和伊红双染法对组织切片进行染色。（2）组织免疫化学染色： 组织切片用二甲苯透化，梯度乙醇溶液脱水，柠檬酸缓冲液修复抗原后，用链霉亲和素过氧化物酶免疫组化检测试剂盒进行免疫组化染色（使用一抗Anti-Ki67 Rabbit pAb（1︰500），二抗为试剂盒内酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物）。用3，3'-二氨基联苯胺（DAB）染色显色，苏木素染色后，脱水、透化，随后用中性树胶封片。（3）组织免疫荧光染色：组织切片用二甲苯透化，梯度乙醇溶液脱水，按照一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（FITC）说明书配置不同工作液对组织切片进行破膜、平衡、标记，最后用DAPI染色30 min后封片。统一使用切片扫描仪观察最终结果。

1.7 统计学分析

使用ImageJ-win6对图片进行定量分析，Origin 2021、GraphPad Prism 10进行统计分析。所有细胞实验均重复3次，计量资料以均数±标准差表示。采用单因素或双因素方差分析及事后Tukey检验分析各组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的制备及表征

成功制备单分散的中空类球形结构的Cu₉S₈纳米颗粒，负载IR780后，Cu₉S₈的结构未见明显改变，其表面可见月桂酸均匀分布（图1A）。IR780@Cu₉S₈复合纳米颗粒的XRD图谱（黑色曲线）与Cu₉S₈的标准PDF卡片（PDF#36-0379，红色曲线）的对比显示（图1B），纳米颗粒的衍射峰与标准Cu₉S₈的峰位置一致，特征峰出现在约27°、34°、47°和56°，符合Cu₉S₈的典型衍射特征，表明IR780@Cu₉S₈中Cu₉S₈保持了原有的晶体结构。IR780@Cu₉S₈的紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）（图1C）在208 nm及780 nm处的吸收峰验证了IR780的成功负载，同时在630 ~ 930 nm范围内的高吸收证明了其光热转换的潜力，因此可选用808 nm激光器用于后续实验。另外，通过动态光散射检测IR780@Cu₉S₈的平均水合粒径为155.43±1.52 nm（图1D），可通过EPR效应在肿瘤部位蓄积。

2.2 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的光热性能评估

使用808 nm激光器照射相同浓度（50 μg/mL）的Cu₉S₈和IR780@Cu₉S₈溶液显示，10 min后IR780@Cu₉S₈升至52.4 ℃，稍高于Cu₉S₈（50.2 ℃）（图2A）。不同激光功率密度及不同浓度IR780@Cu₉S₈溶液的光热性能结果显示溶液温度随时间的增加逐渐上升（图2B、C），且升温速率与溶液浓度和激光器的功率密度正相关。经过5次循环激光照射后，IR780@Cu₉S₈溶液的升降温曲线未见显著改变（图2D），其光热稳定性良好。利用IR780@Cu₉S₈溶液的升降温曲线，计算得出其光热转换效率约为44.0%（图2E、F）。

2.3 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的体外细胞毒性检测

KYSE150细胞和HUVEC细胞的CCK-8结果显示（图3A），即使IR780@Cu₉S₈浓度达到400 μg/mL，2种细胞的活力仍可达到85%以上，IR780@Cu₉S₈具有良好的生物相容性。而在808 nm激光照射后，KYSE150的细胞活力逐渐降低，呈现浓度依赖性，证实IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的光热毒性作用，并计算得出IC₅₀为31.47 μg/mL（图3B、C）。利用细胞活/死染色可视化评估IR780@Cu₉S₈的细胞毒性结果显示（图3D），单纯的激光照射并不能导致细胞发生死亡，Cu₉S₈在808 nm激光照射后可通过PTT促进肿瘤细胞死亡，部分细胞呈现红色荧光，而IR780@Cu₉S₈+L组细胞死亡更加显著。ROS荧光染色结果显示（图3E、F），IR780@Cu₉S₈+L组细胞内绿色荧光强度显著增强（为对照组的34.27倍），且高于Cu₉S₈+L组（为对照组的16.86倍）（P<0.001）。JC-1染色检测线粒体损伤情况显示（图4），与对照组相比，Cu₉S₈+L组红色荧光（JC-1聚集体）逐渐减弱，绿色荧光（JC-1单体）逐渐增强，而IR780@Cu₉S₈+L组中此现象更加显著，线粒体损伤更严重。

2.4 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒对体外细胞功能抑制能力的评估

细胞克隆实验显示（图5A、C），Cu₉S₈+L组克隆形成数约为对照组的45.4 %，而IR780@Cu₉S₈+L组仅为对照组的14.5 %。Transwell细胞侵袭实验结果显示（图5B、D），IR780@Cu₉S₈+L处理后穿过小室进入下层的数量为对照组的18.4%。IR780@Cu₉S₈+L抑制24 h划痕愈合的能力与其他组相比差异有统计学意义（P<0.001，图5E、F）。

2.5 IR780@Cu₉S₈纳米颗粒的体内抗肿瘤疗效及安全性评估

建立C57BL/6皮下荷瘤小鼠模型评估IR780@Cu₉S₈体内抗肿瘤疗效（图6A）。皮下荷瘤体积增长曲线及各组皮下荷瘤离体照片显示（图6B、C），Cu₉S₈+L组肿瘤体积增长减缓，而IR780@Cu₉S₈+L组肿瘤有消融趋势（P<0.001），对肿瘤离体质量进行称重后得到相似的结果（图6D）。HE染色、免疫荧光染色显示（图7A~C），与其他组相比，Cu₉S₈+L和IR780@Cu₉S₈+L组中坏死面积增多、Ki-67阳性信号减少、TUNEL绿色荧光增多，表明肿瘤细胞凋亡水平高于其他各组，且IR780@Cu₉S₈+L的促凋亡效果更加显著。

在整个观察期内，各组小鼠的体质量未见明显下降（图8A），不同浓度IR780@Cu₉S₈处理小鼠血液后的溶血率均低于5%（图8B）。各组小鼠血常规及血生化主要指标未见异常（图9）；小鼠各重要脏器的HE染色结果仍未见显著的病理损伤（图10），IR780@Cu₉S₈纳米颗粒在体内具有良好的生物安全性。

3 讨论

在恶性肿瘤局部治疗领域，PDT及PTT以其可控、微创、可重复等优势，逐渐发展为传统手术与放化疗的重要补充治疗手段。然而其进一步临床应用仍受多因素制约：PDT疗效高度依赖肿瘤氧合状态与PS的有效递送，肿瘤缺氧与非特异性分布易造成ROS生成不足；PTT虽可实现快速热损伤，但热扩散可能引发邻近正常组织损害；同时，PS/PTA的体内稳定性、肿瘤富集效率以及长期代谢与安全性均需要更系统、规范的评估^［29-31］。上述限制在解剖结构复杂、邻近重要器官且对功能完整性要求较高的实体肿瘤中尤为显著。相较于多数实体瘤，食管癌作为典型管腔型肿瘤，具有“病灶可内镜直达、照射路径可控、组织厚度有限且邻近关键结构（如气管、主动脉等）”的显著特点，使PDT-PTT与其临床需求呈现更高匹配度：首先，内镜/光纤介导的局部光照便于实现照射范围与剂量精细控制，为微创、重复治疗提供器械基础；其次，对于无法耐受手术、CRT/RT后局部残留或复发以及局部难切除的患者，亟需一种可在局部实现稳定控制、并发症可控且可重复施行的替代策略^{［32， 33］}；最后，食管壁薄且功能敏感的解剖特点决定了治疗策略必须在“实现足够杀伤”与“最大限度保护正常黏膜及周围结构”之间达到更高水平的平衡。在此背景下，食管癌的PDT研究正从单一的挽救性治疗逐步向材料与功能一体化、多模式协同增效的方向发展，其中基于纳米药物递送系统整合PDT与PTT的策略尤为引人关注。

将PDT与PTT联合应用治疗食管癌具有以下潜在优势^{［6， 34， 35］}：首先，具有微创性及可操作性：通过内镜或光纤介导的局部光照，避免大范围切除，从而最大限度保护食管结构与功能。其次，选择性高且边界可控：PS/PTA在肿瘤组织的富集加上局部照射的空间限制，可在一定程度上减少正常黏膜及邻近组织受损^{［32， 36］}。最后，可协同增效：温和热效应可促进局部血流与灌注、改善氧合并可能增强细胞膜通透性，从而为PDT的ROS生成与作用提供更有利条件；同时，ROS介导的线粒体与膜氧化损伤可提高细胞对热应激的敏感性，形成“热-氧化”双通路协同的杀伤效应^［37-39］，这种互补性为降低单一模式所需剂量、减少副反应提供了潜在空间。需要注意的是，多功能纳米药物递送系统虽总体呈现“靶向递送—协同治疗—诊疗一体化”的发展趋势，但复杂多组分体系常伴随转化障碍：组成复杂导致批间差异与重复性不足，多步骤制备增加放大生产难度，体内行为与作用机制难以清晰阐释，最终限制临床可及性^{［29， 40， 41］}。因此，在确保疗效的前提下，构建“组成简洁、功能明确、机制可解释”的体系更具实际意义。

本研究在前期成功优化制备的中空Cu₉S₈基础上，利用相变材料月桂酸实现IR780的稳定负载，构建了具有PDT-PTT双重治疗功能的IR780@Cu₉S₈复合纳米平台。与部分多组分、多步骤的多功能纳米系统（如DOX@H-Cu₉S₈/PEG^［42］、MPDA-BSA@IR780^［43］）相比，该平台在组成和合成路径上更加简洁：采用成熟的牺牲模板法获得中空结构，并通过简单溶剂搅拌完成负载，有利于后续规模化制备与质量控制。另外，IR780@Cu₉S₈的光热转换效率约44%，在已有报道的Cu₉S₈与Cu_2-xS类光热剂（多集中于20%~40%或约40%范围内^{［42， 44-46］}）中处于相对较高水平，提示其可作为效率较优的PTT核心材料。体内外实验结果表明，其在近红外照射下产生的局部热效应可直接导致部分肿瘤细胞的热损伤；同时，光照触发的ROS生成进一步加剧线粒体与细胞膜氧化损伤，增强细胞对热应激的敏感性，最终呈现出显著的PDT-PTT协同抗肿瘤效应。其次，月桂酸的引入不仅承担“稳定包载”的结构角色，更提供了热触发释放的功能支撑。在光照升温过程中，其相变行为可实现热敏响应释放，有助于提高PS在肿瘤局部的有效暴露与释放精度，降低非特异性分布带来的系统毒性风险^{［39， 46］}。体内安全性结果显示，在有效抑制肿瘤生长的同时，主要脏器未见明显毒性或功能损伤，提示该平台具有较好的生物相容性，为进一步研究与转化奠定了基础。

本研究制备的IR780@Cu₉S₈复合纳米材料以相对简洁的成分组成实现了PDT-PTT协同增效、稳定包载与热控释放的多功能整合，为食管癌的光热联合应用研究提供了新的材料范式。但目前PDT与PTT联合治疗在食管癌的治疗研究中仍处于前临床纳米平台与局部递送/器械化探索阶段，且面临若干关键挑战：包括光源穿透深度限制、PS/PTA在食管内的递送与精准定位、热损伤正常粘膜的风险、食管狭窄或穿孔并发症的可能性、以及如何在复杂的食管肿瘤微环境中实现最佳治疗参数优化等^［36］。因此，未来将在粒径控制、光吸收效率及靶向修饰等方面进一步优化，以期提升其在深部肿瘤及复杂病灶环境中的治疗效果。综上所述，IR780@Cu₉S₈复合纳米材料通过相对简洁的组分实现了稳定包载、热响应释放及PDT-PTT协同增效的功能集成，为食管癌的联合治疗提供了更具转化潜力的设计策略，同时也为其他实体瘤的局部精准治疗优化提供了实验依据与理论支撑。

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