金天格胶囊通过抑制血管内皮细胞衰老并促进骨形成以缓解大鼠糖皮质激素性骨质疏松

Jintiange Capsule alleviates glucocorticoid-induced osteoporosis in rats by inhibiting vascular endothelial cell senescence and promoting bone formation

摘要

目的 验证细胞衰老在糖皮质激素性骨质疏松中的作用，探究金天格胶囊治疗糖皮质激素性骨质疏松的机制。 方法 复苏人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3），诱导生成破骨细胞，将上述细胞均分为对照组（CN组）、模型组（MPS组）和金天格处理组（MPS+JTG组），使用稀释后的生理盐水溶解甲基强的松龙和金天格胶囊，待细胞贴壁后分别使用相应的药物处理对应组别的细胞。通过蛋白印迹、SA-β-Gal染色、DCFH-DA法染色、划痕实验和RT-PCR检测HUVEC细胞的衰老通路、修复能力；通过免疫荧光染色、ALP染色、Alizarin Red S染色和RT-PCR检测MC3T3细胞成骨能力；通过TRAP染色检测破骨细胞分化程度。将30只3周龄SPF级雌性SD大鼠随机分为对照组（CN组）、模型组（MPS组）和金天格处理组（MPS+ JTG组），10只/组。建立糖皮质激素性骨质疏松模型并连续灌胃给药3个月。人道主义处死大鼠后取股骨及静脉血，进行micro-CT扫描、检测大鼠股骨骨体积分数变化情况，并检测大鼠血清骨代谢指标。 结果 网络药理学结果显示，虎骨有效成分与糖皮质激素性骨质疏松存在大量交集靶点，并与P53等细胞衰老相关靶点具有较强的结合力。在细胞水平，与模型组相比，在金天格处理后的HUVEC细胞模型中，P53、P21等衰老蛋白表达被抑制（P<0.01）、氧化应激减弱（P<0.01），而细胞迁移、成血管能力增强（P<0.05）。同样，金天格处理组的MC3T3细胞成骨和矿化能力也明显增强（P<0.001），并且抑制了破骨细胞的分化。在动物水平，经过14 d MPS腹腔注射的大鼠股骨骨量较对照组明显丢失，而金天格胶囊可以缓解骨量的丢失及血清骨代谢指标紊乱（P<0.05）。 结论 金天格胶囊可以通过抑制HUVEC细胞的衰老、增强MC3T3细胞的成骨能力并抑制破骨，促进骨髓内相关血管的迁移和生成，改善成骨能力和骨骼血供并促进成骨、抑制破骨，从而缓解糖皮质激素性骨质疏松。

Abstract

Objective To investigate the role of cellular senescence in glucocorticoid-induced osteoporosis and explore the therapeutic mechanism of Jintiange (JTG) Capsule. Methods Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and mouse pre-osteoblasts (MC3T3) were treated with methylprednisolone (MPS) or MPS combined with JTG Capsule dissolved in saline. HUVEC senescence pathways and repair capacity were analyzed using Western blotting, SA-β-Gal staining, DCFH-DA assay, scratch wound healing, and RT-PCR. The osteogenic potential of MC3T3 cells was assessed using immunofluorescence staining, ALP staining, Alizarin Red S staining, and RT-PCR. Osteoclast differentiation was evaluated by TRAP staining. Thirty 3-week-old female SD rats were randomized into control, MPS, and MPS+JTG groups, and the rats in the latter two groups received daily intraperitoneal MPS injections and treated with gavage of saline or JTG Capsule suspension for 3 months. Femurs and venous blood were collected from the rats for micro-CT analysis of femoral bone volume fraction and detection of serum bone metabolism markers. Results Network pharmacology revealed that the active components of tiger bone had numerous intersection targets with glucocorticoid-induced osteoporosis with a strong binding affinity to cellular senescence-related targets such as P53. In MPS-treated HUVEC-derived osteoclasts, treatment with JTG Capsule significantly inhibited the expressions of P53 and P21, attenuated oxidative stress, and enhanced cell migration and angiogenic capacity. Similarly, JTG Capsule significantly enhanced osteogenic and mineralization capacities of MC3T3 cells and suppressed osteoclast differentiation. In the rat models, intraperitoneal MPS injection for 14 days resulted in significant bone loss in the femur, and JTG Capsule treatment obviously alleviated bone loss and ameliorated the disorder in serum bone metabolic markers. Conclusion JTG Capsule alleviates MPS-induced HUVEC senescence, enhances osteogenic capacity and suppresses osteoclastogenesis in MC3T3 cells, and promotes intraosseous angiogenesis to improve glucocorticoid-induced osteogenesis inrats.

Graphical abstract

关键词

金天格胶囊 / 糖皮质激素性骨质疏松 / 细胞衰老 / 血管再生 / 成骨分化

Key words

Jintiange Capsule / glucocorticoid-induced osteoporosis / cell senescence / angiogenesis / osteogenic differentiation

糖皮质激素性骨质疏松（GIO）是长期使用糖皮质激素后常见且严重的并发症，流行病学显示，长期使用糖皮质激素会显著增加骨折的风险，且在治疗3-6个月时骨质丢失最明显^［1］。临床研究表明，随着糖皮质激素用药时间的延长，出现骨量持续下降以及骨折风险持续升高，而停药后骨折风险可迅速降低^［2］。目前主流观点认为，GIO的核心病理生理机制在于成骨细胞与破骨细胞之间功能的失衡：糖皮质激素一方面通过抑制Wnt/β-catenin 等信号通路，抑制RUNX2、Osterix、OCN等成骨相关活性因子的释放，从而抑制成骨；另一方面则RANKL 等因子表达促进破骨，进而导致骨形成减少和骨吸收增强，最终引发骨质疏松^［3］。基于此，目前临床常用的防治方法包括维生素D、双膦酸盐、特立帕肽等，但这些药物存在用药后高钙血症、停药后反跳性骨折等局限性^［4］。

近年来，细胞衰老在骨骼代谢疾病中的作用日渐得到关注。细胞衰老作为一种不可逆的细胞周期停滞状态，常伴随DNA损伤、端粒磨损、线粒体功能障碍等特征^［5］，在机体衰老表型及增龄相关疾病的发病机制中起关键作用^［6］。在骨骼系统中，除成骨细胞和破骨细胞外，血管内皮细胞作为骨骼微环境的关键组成部分，其衰老并进一步损害骨骼局部血液供应，促进了骨质疏松的进展^［7，8］，但在GIO中的相关机制尚不明确。除此之外，研究人员进一步发现，在骨发育和形成的过程中，生长板区域血管浸润活跃并聚集了大量Osterix 阳性的前成骨细胞，提示血管与成骨细胞在空间分布上密切相关^［9］。在糖皮质激素作用下，内皮细胞功能受损，骨骼微血管密度下降伴随成骨细胞功能下降，进一步加剧骨代谢失衡与骨丢失^［10］，提示血管完整性破坏可能是GIO的重要病理环节之一。然而，糖皮质激素是否直接诱导骨血管内皮细胞发生衰老，以及此类衰老是否参与GIO的进展，目前尚缺乏系统研究。

传统中药在GIO的防治方面显示出良好潜力，其中金天格胶囊作为一种模拟天然虎骨的人工虎骨粉制剂，具有与天然虎骨相似的抗炎、镇痛及抗骨质疏松功效^［11］。然而，该药物是否通过调控血管内皮细胞衰老进而影响成骨功能，其分子机制尚未明确。因此，本研究拟探究金天格胶囊对糖皮质激素诱导的血管内皮细胞衰老及成骨、破骨功能三方面的影响，以揭示其在GIO中的作用通路，为GIO的临床防治提供新的靶点及依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD 雌性大鼠30只，3周龄，体质量40~80 g，购自南方医科大学南方医院实验动物中心。所有大鼠均饲养于南方医科大学南方医院SPF 级动物实验中心。本实验方案通过南方医科大学南方医院动物实验伦理委员会的审查与批准（伦理批号：NFEC-202511-K45-01）。

1.1.2 药物与试剂

甲基强的松龙（维克奇）；生理盐水（Solarbio）；DMEM培养基，α-MEM培养基，PBS缓冲液，RPMI 1640培养基（Gibco）；胎牛血清（Pricella）；胰酶细胞消化液、封闭用正常山羊血清、20% TritonX-100、青霉素-链霉素溶液（双抗，Pythonbio）；RNA提取试剂盒（Nest Biotechnology）；RT-PCR试剂盒（Nest Biotechnology）；EdU细胞增殖检测试剂盒（Beyotime）；Osterix抗体（Abcam）；ALP染色试剂盒（Applygen）；Alizarin Red染色试剂盒（Solarbio）；成骨诱导培养基（Cyagen）；β-半乳糖苷酶染色试剂盒；活性氧检测试剂盒（Beyotime）；Alexa Fluor 488nm抗体（Abbkine）；DAPI溶液（Solarbio）；CD31抗体；VEGF抗体；P53抗体；P21抗体；P16抗体loading buffer（Beyotime）；细胞蛋白提取试剂盒（雅酶）；PAGE凝胶快速制备试剂盒（雅酶）；ECL发光液（Abbkine）；Western及IP细胞裂解液（Keygen Biotech）；PVDF膜（Merck Millipore）；快速封闭液、基质胶、碱性磷酸酶检测试剂盒（Biosharp）；M-CSF细胞因子（AbMole）；RANKL诱导因子（RD system）；TRAP染色试剂盒（Bestbio）；大鼠骨钙素ELISA试剂盒（Mlbio）。

1.1.3 仪器

微型CT扫描分析系统micro-CT（Bruker MicroCT）；倒置全自动显微镜（尼康）；正置显微镜（尼康）；定量PCR仪（赛默飞QuantStudio 6 Flex）；GelView 6000pro成像系统（BLT）；多功能酶标仪（SpectraMax i3x）。

1.2 方法

1.2.1 对GIO—虎骨相关靶标通路进行网络药理学分析

从PubChem数据库获取虎骨有效成分结构，经Swiss ADME筛选后，利用BATMAN-TCM预测其作用靶点，并与DrugBank中GIO的潜在靶点取交集。采用Cytoscape构建“化合物-靶点-疾病”网络，利用STRING数据库构建蛋白质互作（PPI）网络。对交集靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析及可视化，进而构建“成分-靶点-通路-疾病”网络。最后，通过Autodock Vina进行分子对接验证，并使用PyMOL可视化结果。

1.2.2 细胞分组及给药

配制完全培养基。将甲基强的松龙溶解于培养基中，使激素浓度达5 μmol/L。将金天格粉末溶于完全培养基中，稀释浓度为80 μg/mL，使用0.22 μm滤器除菌。人脐静脉内皮（HUVEC）细胞及MC3T3细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，于5% CO₂的37℃培养箱中培养。将细胞分为对照组（CN组）、模型组（MPS 5 μmol/L）及金天格处理组（5 μmol/L MPS+80 μg/mL JTG）。各组细胞均使用相应药物培养24 h。

1.2.3 HUVEC 细胞活性氧检测实验

将分组处理的HUVEC细胞接种于96孔板。避光条件下加入DCFH-DA工作液，于37 ℃孵育30 min后洗涤。使用荧光倒置显微镜观察，并用Image J分析荧光强度。

1.2.4 HUVEC细胞β -半乳糖苷酶染色

将分组处理的HUVEC细胞接种于6孔板。细胞经β-半乳糖苷酶固定液室温固定15 min，PBS洗涤后，加入染色工作液于37 ℃（无CO₂）孵育过夜。使用光学显微镜观察，Image J分析染色阳性率。

1.2.5 RT-PCR检测基因表达

提取分组处理的HUVEC及MC3T3细胞总RNA，NanoDrop检测纯度后反转录。使用实时荧光定量PCR仪，按95℃预变性5 min， 95 ℃变性15 s， 60℃退火/延伸1 min，共40个循环的程序进行检测。计算P16、P21、Plexin-B2、ANG、BMP-2、OCN、RUNX2基因的相对表达量（引物序列见表1，合成于生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2.6 Western blotting 蛋白印迹检测蛋白表达

裂解分组处理的HUVEC细胞，提取总蛋白并BCA法测定浓度。蛋白经变性后，进行SDS-PAGE电泳并转印至PVDF膜。快速封闭液封闭30 min后，与按1∶2000稀释的P53、P21一抗4 ℃孵育过夜，再与按1∶5000稀释的二抗室温孵育2 h。利用化学发光法显影，GelView 6000 pro采集图像，并使用Image J分析条带灰度值。

1.2.7 细胞划痕实验

将分组处理的HUVEC细胞接种于6孔板，待细胞密度达80%~90%时，用200 μL枪头制造划痕。于划痕后0、12、24 h在光学显微镜下拍照，使用Image J计算划痕愈合率。

1.2.8 免疫荧光染色

将分组处理的HUVEC及 MC3T3细胞接种于24孔板。细胞经多聚甲醛固定、TritonX-100 透化及山羊血清封闭后，与相应按1∶200 稀释的一抗4 ℃孵育过夜，再与按1∶500稀释的荧光二抗室温孵育2 h。DAPI 复染细胞核后，于荧光倒置显微镜下观察并拍照，Image J 分析荧光强度。

1.2.9 成管实验

将Matrigel基质胶铺板于24孔板。设置分组及给药，培养24 h。消化细胞并重悬，将细胞悬液接种于凝胶基底上。在37 ℃、5% CO₂条件下培养4 h后拍照。使用Image J进行数据分析。

1.2.10 MC3T3 细胞成骨诱导

向分组处理的MC3T3细胞中加入成骨诱导分化培养基，2 d/次换液，诱导14 d。分别进行ALP染色和茜素红染色，观察染色效果。

1.2.11 Edu 细胞增殖实验

将分组处理的MC3T3细胞与EdU培养基共孵育2 h。细胞经固定、透化后，加入Click反应液避光孵育30 min，DAPI复染核。于荧光倒置显微镜下观察并计算EdU阳性细胞比率。

1.2.12 破骨细胞TRAP染色

提取大鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM），于含50 ng/mL M-CSF和100 ng/mL RANKL的诱导液中培养7 d。按试剂盒说明书进行TRAP染色，苏木素复染后，于光学显微镜下观察多核破骨细胞形态及密度。

1.2.13 大鼠分组与给药

将30只SPF级雌性SD大鼠随机分为3组（n=10）：对照组（CN）、模型组（MPS）、金天格处理组（MPS+JTG）。MPS组与MPS+JTG组大鼠每日腹腔注射2.1 mg/kg甲基强的松龙，连续14 d。MPS+JTG组每日追加灌胃360 mg/kg金天格混悬液^［12］，MPS组与CN组灌胃等量生理盐水，持续3个月。

1.2.14 取材及micro-CT 扫描

干预结束后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，通过观察呼吸停止等指征确认大鼠死亡后，在无菌条件下分离股骨。经多聚甲醛固定后，使用 Micro-CT 扫描仪分析两组大鼠股骨标本的体 积分数变化情况。

1.2.15 大鼠血清OCN及TRAP的测定

处死大鼠后，立即取下腔静脉血液，室温下静置1 h。4℃ 3000 r/min条件下离心得到大鼠血清，置于-80 ℃保存。按照OCN及TRAP检测试剂盒说明书测量大鼠血清OCN、TRAP值。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 10 进行数据的统计分析，使用Image J 进行图像分析，数据以平均数±标准差的形式表示，每个实验至少重复3次。利用Shapiro-Wilk检验评估各数据的正态性，若数据符合正态分布，进一步通过 Levene 检验验证组间数据的方差齐性。针对本研究设置的对照组、MPS组及MPS+JTG组，若数据同时满足正态性与方差齐性，则采用one-way ANOVA进行组间差异性检验，并通过Turkey's检验进行组间两两多重比较。本研究中所有统计检验均为双尾检验，当P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GIO与虎骨相关靶标通路进行网络药理学筛选

通过构建虎骨-GIO药理学作用网络，经韦恩图分析共筛选出了126个共同作用靶点（图1A）。构建化合物—靶点—疾病网络，可发现虎骨有效成分与糖皮质激素性骨质疏松存在多靶点的对应关系（图1B）。接下来，将这126个共同作用靶点导入STRING数据库并利用Cytoscape软件分析，进行蛋白互作网络构建及核心靶点筛选，发现IL6、TP53（P53）、TNF、MMP9、BCL2等可能是虎骨干预GIO的关键靶点（图1C、D）。进一步通过GO功能及KEGG通路富集分析，富集结果显示主要涉及IL17信号通路、细胞凋亡相关通路、cAMP信号通路等（图1E、F）。分子对接也进一步验证，虎骨主要有效成分之一的谷氨酸与P53、IL6等核心靶点均有较高的结合能力（图1G、H），在结构层面支持了网络药理学结果。

2.2 金天格胶囊缓解氧化应激并通过影响P53/P21抑制血管内皮细胞的衰老

与CN组比，糖皮质激素处理组（MPS）细胞内绿色荧光强度和范围明显增强，而金天格胶囊共处理组（MPS+JTG）的荧光信号较MPS组明显减弱（图2A、B）。半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）及定量分析显示，与MPS组相比，MPS+JTG处理组细胞衰老的程度下降，与CN组相当（图2C、D）。qPCR结果显示， MPS 组衰老细胞数量及P16、P21 基因表达较CN组明显增加，而MPS+JTG组中这些表型得到逆转（图2G~I）。蛋白印迹进一步证实，MPS组中P21和P53蛋白表达上调，而金天格胶囊干预则可抑制二者表达（图2E~H）。

划痕实验结果显示，糖皮质激素显著抑制了HUVEC细胞的迁移与增殖，而金天格胶囊可以抑制这一表型（图3A、G）。此外，对成血管相关指标VEGF和CD31的免疫荧光检测进一步揭示，金天格胶囊处理后的HUVEC细胞中VEGF和CD31的表达水平高于MPS组，恢复至接近对照组水平（图3B、C、E、F）。体外成血管实验发现，与MPS组相比，金天格胶囊处理能诱导细胞形成更完整、分支更多的管状结构（图3D、H）。此外，对血管生成素（ANG）和神经丛蛋白B2（Plexin-B2）等成血管相关基因的qPCR实验进一步验证了上述结论（图3I、J）。

2.3 金天格胶囊可以逆转糖皮质激素导致的成骨能力下降

EdU 染色显示，MPS处理抑制了MC3T3-E1 细胞的增殖，而金天格胶囊干预可以恢复其增殖能力（图4 A、B）。在成骨分化和矿化功能方面，碱性磷酸酶（ALP）及茜素红（A.R.S）染色表明，MPS 削弱了MC3T3-E1细胞的矿化能力，而金天格胶囊可以逆转这一抑制表型，将细胞的矿化能力恢复至与CN 组相近（图4F）。免疫荧光显示，MPS导致成骨分化、增殖关键因子Osterix（OSX）的表达下调，但金天格胶囊能使其表达恢复至与CN组相当（图4 G-H）。进一步进行qPCR 分析，金天格胶囊可以上调成骨标志基因骨钙素（OCN）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）以及Osterix上游因子RUNX2的表达，从而逆转MPS 导致的成骨相关基因抑制（图4C~E）。在破骨细胞方面，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示，经MPS处理的破骨细胞数量、密度明显升高，而MPS+JTG组破骨细胞的密度较MPS降低（图4I）。

2.4 金天格胶囊能缓解糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松及骨代谢紊乱

实验结果表明，使用金天格胶囊灌胃（MPS+JTG组）的大鼠股骨皮质较使用生理盐水灌胃（MPS组）的大鼠丢失较少，其小梁微管结构也较MPS 组明显改善（图5A）。对3组大鼠股骨标本的Micro-CT 扫描进行定量分析，可见MPS+JTG 组大鼠股骨骨体积（BV）、组织体积（TV）以及骨体积/组织体积（BV/TV）都较MPS 组大鼠增加（图5B~D），与对照组（CN组）相近。另外，MPS组大鼠血清中骨钙素（OCN）低于对照组（P<0.0001，图5E），而抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP-5b）这一破骨细胞功能标志则高于对照组（P<0.0001，图5F）。

3 讨论

近年来，随着糖皮质激素在临床上应用的广泛，GIO作为其副作用之一，发病率也逐年升高。骨质疏松的发生与发展与血管内皮细胞、成骨细胞等多种细胞的衰老密切相关，也是成骨-破骨失衡的重要病理基础^{［6， 7］}。同时，成骨细胞和破骨细胞的失衡也是导致骨量丢失的关键因素^［13］。临床上发现，金天格胶囊与双膦酸盐类、维生素D、雌激素、地舒单抗等药品联用可以有效缓解骨质疏松^［14］，但对其机制的研究主要集中于成骨—破骨平衡，对细胞衰老及血管内皮细胞等方面研究较少。因此，本研究拟从金天格胶囊可能抑制血管内皮细胞衰老、促进血管形成，同时恢复成骨—破骨平衡的角度，探究缓解GIO的新机制。

基于金天格胶囊（人工虎骨粉）已被证实具有和天然虎骨极为相似的成分、理化性质、药理作用和有效成分^［11］，本研究为了证明人工虎骨粉与GIO之间的潜在治疗关系，以虎骨为对象展开网络药理学分析。通过数据筛选及PPI 网络拓扑学分析，我们发现核心靶点包括IL6、TNF、TP53、INS、SRC和BCL2。其中，TP53（P53）是评估衰老的关键因子，通过调控参与 DNA 修复、细胞凋亡和细胞周期停止等生理过程^［15］与细胞衰老关系紧密，揭示了虎骨干预GIO的潜力可能与其抗细胞衰老作用相关。对虎骨-GIO共同靶点的KEGG通路富集分析进一步揭示了多条与细胞衰老相关的信号通路，如IL-17的激活可以通过NF-kappaB信号通路促进P16、P21、P53等衰老相关蛋白的表达^［16］；而cAMP水平升高则可能通过促进P53与其负调控因子HDM2的结合来抑制P53的积累^［17］。这些通路均为虎骨治疗GIO提供了潜在的机制解释。因此，网络药理学研究初步揭示，人工虎骨粉可能通过干预细胞衰老等过程发挥治疗GIO的潜力，并找出了其潜在的作用机制网络，为后续深入探究金天格胶囊的具体作用机制奠定了理论基础。

根据上述网络药理学分析提示的细胞衰老关键作用，我们进一步探究了金天格胶囊对骨骼微环境中关键细胞，即血管内皮细胞衰老的影响。血管内皮细胞的衰老在GIO中的研究尚不明确^［18］。研究显示，使用非致死量的外源性过氧化氢处理成纤维细胞，会导致细胞产生类似衰老的生长停滞，这表明氧化剂在细胞衰老中具有重要作用^［19］。活性氧（ROS）是一种由氧衍生的，化学性质活泼的物质，当活性氧过度累积时，会对胞内核酸、蛋白质等物质造成损伤，进而引起氧化应激，促进细胞的衰老和功能减退^［20］。此外，ROS作为P16、P21等信号通路的信号分子，其水平升高已被视为细胞衰老的重要标志之一^［21］。本研究的体外实验发现，糖皮质激素可以诱导HUVEC出现氧化应激和衰老标志物表达上调，而金天格胶囊的干预则可缓解这一现象。除此之外，P53和P21基因的激活会促进细胞衰老^［22］，Western blotting结果显示，金天格胶囊可能通过抑制P53和P21蛋白的表达，缓解DNA损伤应激导致的细胞周期停滞，从而延缓内皮细胞衰老。以上结果均说明，金天格胶囊可能通过抗氧化及抑制P53和P21蛋白缓解糖皮质激素诱导的血管内皮细胞的衰老。血管内皮细胞的衰老状态直接影响其血管生成能力。作为一种血管生成蛋白，血管生成素（ANG）可以通过与内皮细胞表面的受体蛋白Plexin-B2结合诱导血管内皮细胞的增殖和血管形成^［23］。Plexin-B2 蛋白作为Plexin 家族的重要成员，在脑、心脏、肺、肝脏等器官中表达，具有参与血管生成、维持稳态等作用^［24］。近期研究表明，破骨细胞来源的ANG可结合邻近血管内皮细胞上的Plexin-B2，被内吞并转运至细胞核，进而促进内皮细胞增殖与血管生长^［25］。本研究通过划痕实验和成管实验证实，金天格胶囊通过缓解内皮细胞衰老，显著改善了细胞的血管生成能力。同时成血管相关指标VEGF、CD31、ANG、Plexin-B2等表达的上调，进一步验证了金天格胶囊可能通过抑制血管内皮细胞的衰老促进血管生成，缓解糖皮质激素所导致的血管生成抑制。

骨骼的血供是骨形成与修复的基础，而血管内皮细胞的功能状态可能影响成骨细胞活性与骨代谢平衡^［26］，骨血管生成的减少是抑制成骨、促进破骨，进而引发骨代谢失衡和骨量丢失的关键病理环节之一^{［10， 27］}。因此，我们进一步研究了金天格胶囊对成骨细胞功能及骨形成—骨吸收平衡的调控作用。RUNX2 是成骨细胞和软骨细胞分化的主要调节因子，通过调节多种信号参与骨组织的生成和软骨细胞的成熟^［28］，且其是成骨细胞分化的早期标志，并可能诱导早期骨原细胞中谱系定向及间充质成骨分化所需的基因表达^［29］。成骨细胞特异性转录因子（OSX）是一种属于SP/KLF家族的特异性转录因子^［30］，同时也是RUNX2 的下游目标之一^［31］，且其表达上调已被证实可改善动物模型的骨质疏松表型^［32］。在本研究中，金天格胶囊提高了MC3T3细胞矿化的能力及OSX、RUNX2、BMP-2等成骨基因表达，促进成骨；同时还抑制了破骨细胞的分化，维持了成骨—破骨的平衡。本实验结果说明了金天格胶囊可以促进成骨细胞的增殖、矿化，并上调成骨相关基因的表达，从而抑制糖皮质激素诱导的成骨抑制；同时抑制破骨细胞的活性和数量，有效缓解糖皮质激素导致的骨代谢失衡，达到对GIO的治疗作用。这一发现与先前内皮细胞相关研究的趋势高度相似，在一定程度上说明了血管的形成与完整是成骨—破骨平衡的重要前提。最后，在体内实验中，金天格胶囊成功改善了大鼠股骨的微观结构及血清骨代谢指标的紊乱，验证了其缓解GIO的效果。

本研究整合了网络药理学、分子生物学及动物实验，创新性地从“血管—衰老—成骨耦联”视角验证了金天格胶囊缓解GIO的多种机制。该药物一方面可能通过抑制P16、P21和P53缓解血管内皮细胞衰老，改善骨内血管生成，确保骨形成的血流供应；另一方面可能通过激活RUNX2 / OSX 轴促进成骨细胞功能，增加成骨分化及矿化能力，同时抑制破骨，最终缓解骨代谢失衡。本研究对金天格胶囊缓解GIO提供了新的机制上的依据，并为GIO的防治提供了新的靶点方向。

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基金资助

国家自然科学基金(82002352)

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