过表达miR-593-5p通过靶向PLK1抑制胃癌细胞的迁移、侵袭、增殖并促进其凋亡

Overexpression of miR-593-5p inhibits migration, invasion and proliferation and promotes apoptosis of gastric cancer cells by targeting PLK1

摘要

目的 miRNA与胃癌（GC）发生发展相关，探讨miR-593-5p靶向Polo-likekinase1（PLK1）对人GC细胞生物学功能的影响。 方法 培养4种人胃癌细胞系（MGC-803、AGS、HGC27、MKN-45）及正常的人胃黏膜上皮细胞系（GES-1）。采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术分别检测miR-593-5p、PLK1 在各细胞系中RNA的表达情况，并筛选出一株miR-593-5p表达量较高和一株miR-593-5p表达量较低的细胞系做为工具细胞用于转染及功能实验。通过生物信息学网站TargetScans Human 7.2检测miR-593-5p与PLK1基因二者是否存在结合位点。采用脂质体转染胃癌工具细胞，构建miR-593-5p模拟物及其miR-593-5p 模拟物阴性对照分别瞬时转染至miR-593-5p表达量低的细胞系MGC-803中，将miR-593-5p抑制物及其抑制物阴性对照分别瞬时转染至miR-593-5p表达量高的细胞系MKN-45中，构建过表达和抑制miR-593-5p的胃癌细胞株。荧光显微镜下观察转染荧光效果，并采用RT-PCR技术验证并检测miR-593-5p是否转染成功。蛋白质免疫印迹实验检测分别过表达及抑制miR-593-5p后胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中PLK1蛋白表达水平。采用划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验及流式细胞技术分别检测在胃癌细胞系中成功过表达和抑制miR-593-5p 前后对胃癌细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡能力的影响。 结果 PCR结果显示，与正常胃黏膜细胞相比，GC细胞系中miR-593-5p的显著表达降低且PLK1的表达增加（P<0.05），其中MGC-803细胞系miR-593-5p的表达最低，MKN-45细胞系miR-593-5p的表达最高。经生物信息学网站TargetScansHuman7.2检测miR-593-5p与PLK1基因存在相应的3’UTRs结合位点。在MGC803细胞系中过表达miR-593-5p与对照组相比较，PLK1蛋白的表达减少（P<0.05），细胞迁移、侵袭和增殖能力降低、细胞凋亡率增加（P<0.05）。在MKN-45细胞系中沉默miR-593-5p与对照组相比较，PLK1蛋白的表达增加。细胞迁移、侵袭和增殖的能力增加、细胞凋亡率降低（P<0.05）。 结论 过表达miR-593-5p可以抑制GC细胞的迁移、侵袭和增殖，并促进GC细胞的凋亡，其作用机制可能与PLK1表达的靶向下调有关。

Abstract

Objective To explore the role of miR-593-5p targeting Polo-like kinase 1 (PLK1) in regulating biological behaviors of human gastric cancer (GC) cells. Methods Four GC cell lines (MGC-803, AGS, HGC-27, and MKN-45) and normal human gastric mucosal epithelial GES-1 cells were examined for miR-593-5p and PLK1 expressions using RT-PCR, and MGC-803 cells with the lowest miR-593-5p expression and MKN-45 with highest miR-593-5p expression were selected for subsequent experiments. TargetScan7.2 was used to predict the binding between miR-593-5p and PLK1. MGC-803 cells were transfected with miR-593-5p mimic or mimic NC via liposome, and MKN-45 cells were transfected with miR-593-5p inhibitor or inhibitor NC. The changes in cellular PLK1 protein expression levels were detected using Western blotting, and the changes in biological behaviors of the cells were evaluated using scratch assay, Transwell assay, CCK-8 assay, and flow cytometry. Results Compared with GES-1 cells, the GC cell lines showed significantly downregulated miR-593-5p and upregulated PLK1 expressions. TargetScan7.2 identified binding sites between miR-593-5p and PLK1 3'UTR. In MGC-803 cells, miR-593-5p overexpression caused significant reduction of PLK1 protein expression, inhibited cell migration, invasion, and proliferation, and promoted cell apoptosis. Conversely, miR-593-5p inhibition in MKN-45 cells upregulated PLK1 expression, enhanced cell migration, invasion, and proliferation, reduced cell apoptosis. Conclusion miR-593-5p overexpression inhibits GC cell migration, invasion, and proliferation, and promotes apoptosis, likely by directly downregulating PLK1, suggesting the role of miR-593-5p as a tumor suppressor in GC and its potential therapeutic relevance.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / miR-593-5p / PLK1 / 生物学功能

Key words

gastric cancer / miR-593-5p / PLK1 / Biological function

胃癌（GC）是我国高发的消化道肿瘤之一，也是全球范围内严重的公共卫生问题。根据研究显示GC发病率及病死率分别位居恶性肿瘤中的第5位和第4位^［1］。因其起病隐匿、高侵袭性及异质性，治疗效果不佳^［2-4］。尽管近年来对GC治疗有了很大的进展，包括根治性手术、化放疗及免疫治疗等，但晚期GC患者的5年总生存率仍然不理想^［5-9］。因此，探索GC的发生和发展相关的分子机制，寻找敏感性和特异度高的GC诊断标志物迫在眉睫。

miRNA是一种内源性短链非编码RNA，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移潜能有关^{［10， 11］}。miR-593-5p作为miRNA家族的一员，在诸多恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生发展相关^［12-14］。有研究表明miR-593-5p在GC组织和细胞系中呈低表达，其表达降低与GC进程密切相关^{［15， 16］}。然而，miR-593-5p如何调控GC的发生发展尚不明确。因此，进一步寻找miR-593-5p的目标基因并探索其可能的机制。保罗样激酶1（PLK1）是一种高度保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。其中PLK1是PLK激酶家族中最广泛研究的成员，参与细胞周期调控和癌症形成有关^{［17， 18］}。通过生物信息学网站TargetScan（https：//www.targetscan.org/）提示，miR-593-5p和PLK13'UTR之间存在互补结合位点，PLK1是miR-593-5p的下游靶基因^［19］。但在GC中miR-593-5p和PLK1之间是否存在靶向关系尚不清楚。

本研究旨在分子层面与细胞层探讨miR-593-5p和PLK1的表达情况，以及miR-593-5p如何通过PLK1调控在GC侵袭转移中发挥作用予以验证。初步阐释miR-593-5p介导PLK1影响GC细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡，增进miR-593-5p与PLK1生物功能的理解，阐明其对GC细胞侵袭转移的影响及可能机制，以期为GC临床诊疗水平提升提供新的参考。

1 材料和方法

1.1 细胞及主要试剂

人胃黏膜上皮细胞GES-1和GC细胞株（MGC-803、AGS、HGC-27、MKN-45）由甘肃省人民医院重点实验室提供。胎牛血清、RPMI 1640、DMEM培养液（逍鹏生物）；电化学发光（ECL）曝光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物）；PLK1兔抗人单克隆抗体、GAPDH兔抗人单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；胰蛋白酶、逆转录试剂盒、PCR引物（塞维尔科技）；Opti-MEM培养基（赛默飞世尔科技）；miR-593-5p mimic及miR-593-5p inhibitor（上海吉玛制药）；Transwell小室（康宁生物）；凋亡检测试剂盒（BD）。

1.2 细胞培养和转染

细胞置于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养。在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养；当细胞生长至80%时，加入适量胰蛋白酶消化进行传代。细胞转染miR-593-5p mimic、miR-593-5p mimic NC和miR-593-5p inhibitor、miR-593-5p inhibitor NC由GemmaGene（中国上海）提供。MGC-803和MKN-45细胞接种于六孔板中，当细胞融合度达到80%时，使用Lipofectamine3000（美格生物）分别转染相同量的miR-593-5p mimic、miR-593-5p inhibitor、miR-593-5p mimic NC和miR-593-5p inhibitor NC。根据上述转染方法，分别定议细胞分组为空白对照组、mimic组、inhibitor组、mimic NC组和inhibitor NC组。

1.3 RT-PCR法检测GC细胞中miR-593-5p和PLK1mRNA表达

TRIzol试剂提取细胞系总RNA，后合成cDNA，按照2× M5 Hiper Premix EsTaq（with Tli RNaseH）扩增试剂盒标准步骤进行PCR扩增，聚合酶链反应条件扩增条件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，共40个循环，用2^-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。引物由塞维尔公司合成（表1）。

1.4 Western blotting检测miR-593-5p和PLK1的蛋白表达

通过RIPA裂解法从转染后的MKN-45、MGC-803细胞中提取总蛋白，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量蛋白浓度。10%SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上。膜转移后，使用蛋白无阻断快速封闭溶液封闭，然后在4 ℃下过夜孵育一抗（GAPDH 1∶10 000；PLK1 1∶1000稀释），次日复温1 h后，用缓冲液清洗条带，然后加入山羊抗兔二抗（稀释比为 1∶5000），孵育2 h后，用缓冲液洗涤，接着加入ECL化学发光液显色，最后通过Image J分析条带。

1.5 Transwell实验检测细胞侵袭能力

用无血清培养基按照按1∶8的比例稀释Matrigel基质胶，向上层小室中加入60 μL，迅速晃动24孔板使基质胶均匀铺满小室底面，用枪头充分吹打混匀，随后放入培养箱中孵育，使基质胶聚合成薄膜。调整细胞密度以1×10⁵/mL接种于小室上室加100 µL，下室加10%胎牛血清的培养基500 µL，48 h后取出小室，甲醇固定，结晶紫染色后擦除上层内细胞，磷酸缓冲盐溶液洗3次，随机选5个视野计数。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

转染后，细胞密度达到90%，无血清培养12 h，以无菌直尺作依靠，无菌牙签在每孔中心轴划痕，拍照（0 h），后每24、48 h拍照1次。实验重复3次。

1.7 CCK-8 实验检测

成功转染的MGC-803和MKN-45细胞系被消化、离心、重悬，配置成2×10/mL的细胞悬液，置于96孔板中，接种100 μL/孔，每组设置4个重复孔，并在每个孔周围加入等量的PBS缓冲液。分别在0、22、46、70 h孵育后，孵育结束时向每个孔加入10 μL CCK-8溶液，并继续孵育2 h。各组用酶标仪检测A_{450 nm}。相对细胞活力=（A_实验组-A_{空白对照组}/A_NC组-A_{空白对照组}）×100%。

1.8 流式细胞术实验检测细胞凋亡能力

成功转染的MGC-803和MKN-45细胞系用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤2次，铺平后离心2000 r/min，5 min，收集细胞。加入适量的1×结合缓冲液重悬细胞至1×10⁵/mL。加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，在低光线下孵育15 min。加入400 μL的1×结合缓冲液，吹打混匀，尽快用流式细胞术检测凋亡。

1.9 统计学分析

使用SPSS26.0软件进行统计分析。每个实验重复3次，计量结果用\mathrm{均数}±标准差表示，两组数据间的比较采用t检验，3组及以上数据的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学网站预测PLK1是miR-593-5p的下游靶基因

使用生物信息学网站TargetScan和miRtarbase预测miR-593-5p在GC细胞中可能存在并发挥作用的下游靶点，我们发现PLK1可能是miR-593-5p的一个有效靶点。进一步使用TargetScan发现miR-593-5p与 PLK13'UTR存在结合位点（图1）。

2.2 GC细胞系中miR-593-5p呈低表达、PLK1呈高表达

使用qRT-PCR检测了人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）和4个GC细胞系（MGC-803、AGS、HGC-27、MKN-45）中miR-593-5p和PLK1的mRNA表达水平。4个GC细胞系中miR-593-5p的表达水平低于GES-1，MGC-803细胞系中miR-593-5p的表达水平最低，且MKN-45细胞系中表达最高（P<0.05，图3A）。4个GC细胞系中PLK1的表达水平高于GES-1（P<0.05，图3B）。

2.3 脂质体转染miR-593-5p mimic/inhibitor至GC细胞

在荧光显微镜下观察当miR-593-5p mimic的浓度为40 nmol/L时，此时在MGC-803细胞株中的转染效率效果最佳（图2A）。当miR-593-5p inhibitor的浓度为60 nmol/L时，此时在MKN-45细胞株的转染效率最佳（图2B），转染48h后，在荧光显微镜下观察转染荧光效果，收集细胞备用。

2.4 在过表达/抑制miR-593-5p后GC细胞中miR-593-5p和PLK1mRNA的表达水平

PCR结果显示：将miR-593-5p mimic染至MGC-803细胞系后，miR-593-5p的表达增加，与转染空白对照组和mimic NC组后，PLK1的表达降低（P<0.001，图4A、C）。将MKN-45细胞系转染miR-593-5p inhibitor后，与空白对照组和inhibitor NC组相比，miR-593-5p的表达降低，PLK1的表达增加（P<0.001，图4B、D）。

2.5 过表达/抑制miR-593-5p后GC细胞中PLK1蛋白的表达

在MGC-80细胞中转染miR-593-5p mimic/mimic NC后，miR-593-5p mimic组较空白对照组和mimic NC组相比，PLK1蛋白表达降低（图5A、B，P<0.001）。MKN-45细胞系转染miR-593-5p inhibitor后，与空白对照组和inhibitor NC组相比，miR-593-5p inhibitor组的PLK1表达增加（图5C、D，P<0.001）。

2.6 miR-593-5p过表达/抑制对GC细胞迁移的影响。

MGC-803细胞系过表达miR-593-5p后，miR-593-5p mimic组的GC细胞迁移能力较空白对照组和mimic NC组降低，GC细胞的迁移能力被抑制（P<0.01，图6A、B）。MKN-45细胞系转染miR-593-5p inhibitor后，与空白对照组和inhibitor NC组相比，miR-593-5p inhibitor组的GC细胞迁移能力增强，抑制miR-593-5p表达后GC细胞的迁移能力增强（P<0.01，图6C、D）。

2.7 miR-593-5p过表达/抑制对GC细胞侵袭能力的影响

MGC-803细胞系中过表达miR-593-5p后，miR-593-5p mimic组中迁移到隔室的GC细胞数量低于空白对照组和mimic NC组（P<0.01，图7A、B）。与空白对照组和inhibitor NC组相比，MKN-45细胞系转染miR-593-5p inhibitor后，迁移到隔室的GC细胞数量增加（P<0.01，图7C、D）。

2.8 miR-593-5p过表达/抑制对GC细胞增殖的影响

在MGC-803细胞中转染miR-593-5p mimic后，miR-593-5p mimic组的细胞增殖能力较空白对照组和miR-593-5p mimic NC组显著降低（P<0.01，图8A）。在MKN-45细胞中转染miR-593-5p inhibitor后，miR-593-5p inhibitor组的细胞增殖能力较空白对照组和miR-593-5p inhibitor N组显著增强（P<0.01，图8B）。

2.9 miR-593-5p过表达/抑制对GC细胞凋亡的影响

在MGC-803细胞中转染miR-593-5p mimic和mimic NC后，miR-593-5p mimic组的GC细胞总凋亡率较mimic NC及空白组增加（P<0.01，图9）。在MKN-45细胞中转染miR-593-5p inhibitor和inhibitor NC后，miR-593-5p inhibitor组的GC细胞总凋亡率较inhibitor NC及空白对照组降低（P<0.01，图10）。

3 讨论

胃癌作为全球范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一^［20-22］，具有异常增殖等生物学特性推动肿瘤的恶性发展^［23］，深入探究其发病机制并寻找有效的治疗靶点一直是研究的重点。本研究聚焦于miR-593-5p对胃癌细胞生物学行为的影响及其与PLK1的靶向关系，取得了一系列具有重要意义的结果。​

在本研究中，我们首先通过PCR实验方法证实了miR-593-5p在胃癌细胞系中呈低表达状态，这一结果与先前部分关于其他癌症类型的研究报道一致^［16］，如在非小细胞肺癌^［19］、结肠癌^［24］、肝癌中miR-593-5p同样表现为低表达^［25］，并通过直接靶向PLK1抑制细胞增殖活力。这种在不同癌种中miR-593-5p表达的一致性暗示了其在肿瘤发生发展过程中可能扮演着重要的抑癌角色。进一步研究发现，过表达miR-593-5p能够显著抑制胃癌细胞的迁移、侵袭、增殖能力，并促进细胞凋亡。这表明miR-593-5p在胃癌细胞的恶性表型调控中起着关键作用，其低表达状态可能导致胃癌细胞失去了这一重要的负调控机制，从而促使肿瘤细胞获得更强的侵袭和转移能力，以及不受控制的增殖能^［26］。这一结果与本研究结果一致，同时降低miR-593-5p表达，其侵袭、转移及增殖能力下降。

通过生物信息学预测PLK1是miR-593-5p的直接作用靶基因，但在GC中miR-593-5p和PLK1之间是否存在靶向关系尚不清楚。PLK1作为一种在细胞周期调控、有丝分裂进程中发挥关键作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在多种肿瘤中呈现过表达状态，并与肿瘤的不良预后密切相关^［27-30］。在胃癌中，已有研究表明抑制PLK1表达可阻断其表达和功能，进而影响胃癌细胞的生长、侵袭和转移^{［31， 32］}。通过本研究发现在GC中miR-593-5p靶向调控PLK1表达。这种靶向调控关系为理解胃癌细胞生物学行为的调控机制提供了新的视角。当miR-593-5p表达上调时，其对PLK1的抑制作用增强，导致PLK1蛋白水平下降，进而影响了下游一系列与细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡相关的信号通路，当PLK1被miR-593-5p抑制后，抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。在细胞增殖和凋亡方面，PLK1的异常高表达可促进细胞周期进程，抑制细胞凋亡。本研究结果对于胃癌的临床治疗具有潜在的指导意义。一方面miR-593-5p可作为一个潜在的生物标志物用于胃癌的早期诊断和预后评估。由于其在胃癌组织中的低表达与肿瘤的恶性表型相关，检测患者体内miR-593-5p的表达水平可能有助于判断肿瘤的进展程度和患者的预后情况。另一方面，以miR-593-5p为靶点的治疗策略可能为胃癌的治疗提供新的途径。通过人工合成miR-593-5p模拟物或采用基因治疗手段上调胃癌细胞中miR-593-5p的表达，有望恢复其对PLK1的抑制作用，从而抑制胃癌细胞的恶性行为，为胃癌患者带来新的治疗希望。​

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，虽然我们在体外细胞实验证实了miR-593-5p对胃癌细胞生物学行为的影响及其与PLK1的靶向关系，但在人体复杂的生理环境中，可能存在其他因素影响这一调控网络。其次，虽然我们明确了miR-593-5p/PLK1这一调控轴对胃癌细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡的影响，但PLK1下游具体的信号通路以及miR-593-5p是否还存在其他潜在的靶基因参与胃癌的发生发展，仍有待进一步研究。未来的研究可以围绕这些方面展开，深入探究miR-593-5p在胃癌中的作用机制，为胃癌的临床治疗提供更坚实的理论基础。​

尽管本研究证实了miR-593-5p能够调控PLK1的表达，但我们认识到本研究存在一个明显的局限性，并未通过双荧光素酶报告基因实验来直接验证miR-593-5p对PLK1启动子的结合与激活能力。这一实验的缺失，无法从最直接的证据层面断定miR-593-5p是作为转录因子直接与启动子结合，还是通过影响其他中间调控因子间接起效。

综上所述，本研究揭示了miR-593-5p通过靶向PLK1抑制胃癌细胞的迁移、侵袭、增殖和促进凋亡，为理解胃癌的发病机制提供了新的线索，并为胃癌的诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。尽管存在局限性，但本研究为后续更深入的研究奠定了基础，有望推动胃癌治疗领域的进一步发展。

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基金资助

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