通腑养髓治法通过抑制PKR介导的突触损伤改善Wilson病TX小鼠认知功能

Modified Gandou Decoction improves cognitive function of TX mice with Wilson's disease by inhibiting the PKR/eIF2α pathway

摘要

目的 通过建立PKR沉默Wilson病模型毒牛奶（TX）小鼠，探讨通腑养髓治法（MGDD）通过PKR/eIF2α通路介导的突触损伤对TX小鼠认知功能的改善机制。 方法 将36只TX小鼠随机分为TX组、TX+MGDD组、C16组（PKR抑制剂干预组）及C16+MGDD组，9只/组。C16组与C16+MGDD组先腹腔注射PKR抑制剂C16（300 μg/kg，持续30 d），之后分别灌胃生理盐水或MGDD；TX组与TX+MGDD组则分别灌胃等体积生理盐水或MGDD，持续4周。行为学测试（巴恩斯迷宫与旷场实验）后取脑组织，进行免疫荧光、TUNEL染色、透射电镜（TEM）、RT-qPCR及Western blotting分析。 结果 行为学方面，与C16组相比，C16+MGDD组在边上路程减少（P<0.05），但在中央时间、中央路程、边上时间及目标洞口潜伏期等方面差异无统计学意义。免疫荧光显示，C16+MGDD组阳性细胞数较C16组减少，与TX+MGDD组相近；同时，MGDD治疗的TX小鼠在C16干预前后8-OHdG阳性细胞数差异无统计学意义。TEM观察显示，MGDD或C16干预均能增加突触与囊泡数量，改善突触膜结构清晰度，但MGDD联合C16未产生叠加效应。Western blotting结果显示，C16+MGDD组突触相关蛋白PSD93、PSD95、Synapsin1和Synaptophysin表达较C16组上调（P<0.05）；与TX+MGDD组相比，除PSD93外，其余蛋白表达有差异（P<0.05）。在PKR/eIF2α通路方面，RT-qPCR显示C16+MGDD组Pkr、eIF2alpha等mRNA表达与C16组差异无统计学意义；Western blotting提示C16+MGDD组P-eIF2α与CHOP蛋白水平下降，而P-CREB上升，P-PKR与ATF4变化差异无统计学意义。 结论 通腑养髓治法可能通过抑制PKR/eIF2α通路活性，促进突触相关蛋白表达，改善突触结构与功能，从而缓解Wilson病TX小鼠的认知功能障碍。

Abstract

Objective To assess the effect of the Modified Gandou Decoction (MGDD, developed based on the TongFuYangSui strategy in traditional Chinese medicine) for improving cognitive function in a PKR-silenced Wilson's disease (WD) TX mouse model and explore the underlying mechanism. Methods Thirty-six TX mice were randomized into TX group, TX+MGDD group, C16 group, and C16+MGDD group. In C16 and C16+MGDD group, the mice received daily intraperitoneal injections of 300 μg/kg C16 (a PKR inhibitor) for 30 days, and saline injections were given in the other two groups; after WD modeling, the mice in TX+MGDD and C16+MGDD groups received MGDD gavage for 4 weeks, while the other two groups were given saline gavage. After the treatments, the mice were examined using behavioral tests, followed by immunofluorescence staining, TUNEL staining, TEM, RT-qPCR and Western blotting analysis of the brain tissue. Results In behavioral tests, the mice in C16+MGDD group showed significantly shorter time spent in the perimeter than those in C16 group without significant differences in other parameters. Immunofluorescence staining revealed obviously lowered hippocampal oxidative stress level in C16, TX+MGDD, and C16+MGDD groups compared with TX group. Both MGDD and C16 treatment alone increased the number of hippocampal synapses and vesicles and improved ultrastructural synaptic damages, but their combination exhibited no synergistic effect. The C16+MGDD group showed significantly higher expressions of PSD93, PSD95, synapsin1 and synaptophysin than C16 group, but had comparable PSD93 expression with TX+MGDD group. While the mRNA expressions in the PKR/eIF2α pathway were similar between C16+MGDD and C16 groups, the protein levels of P-eIF2α and CHOP were significantly lower and P-CREB protein level was higher in C16+MGDD group. Conclusion MGDD improves cognitive dysfunction in WD TX mice possibly by inhibiting the PKR/eIF2α pathway, promoting expressions of synaptic proteins, and improving synaptic structure and function.

Graphical abstract

关键词

Wilson病 / 通腑养髓治法 / PKR/eIF2α通路 / 突触可塑性 / 认知功能障碍

Key words

Wilson's disease / TongFuYangSui / PKR/eIF2α pathway / synaptic plasticity / cognitive dysfunction

Wilson病（WD）是一种由ATP7B基因突变导致的常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，其特征是铜在肝、脑等器官异常蓄积，引发一系列临床症状^［1-3］。神经系统受累是WD的常见表现，约半数患者以神经系统症状为首发表现，包括震颤、肌张力障碍、构音障碍等，并常伴有认知功能损害，如记忆力减退、学习能力下降和执行功能障碍，严重影响患者的生活质量^{［4， 5］}。目前的标准治疗方案以铜螯合剂（如青霉胺、曲恩汀）和锌剂为主，旨在促进铜排泄或抑制铜吸收^［6-8］。然而，部分患者在治疗过程中可能出现神经症状的“矛盾性”加重^［9，10］，且现有疗法对已形成的认知功能障碍改善效果有限，提示我们需要探索新的治疗策略。近来研究发现，双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）/真核细胞起始因子2α（eIF2α）通路是细胞应对氧化应激等多种胁迫的关键信号枢纽，PKR/eIF2α通路的持续激活与神经退行性疾病的发生发展密切相关。在阿尔茨海默病（AD）中，激活的PKR磷酸化eIF2α，磷酸化的eIF2α水平与神经元变性显著相关。更重要的是，研究已证实该通路在记忆形成和突触可塑性中扮演着“刹车”的角色，抑制其活性可增强认知记忆。近期研究直接将铜毒性与PKR/eIF2α通路联系起来，发现慢性铜暴露可通过激活该通路，导致小鼠海马突触蛋白丢失和空间记忆障碍^{［11， 12］}。我们团队的前期工作也证实，在WD的TX小鼠模型中，下调PKR能够有效阻止铜诱导的突触功能障碍和认知损伤^{［13， 14］}。这些证据表明，PKR/eIF2α通路是介导铜神经毒性的关键信号通路，也是干预WD认知障碍的潜在治疗靶点。

传统中医药在治疗神经系统疾病方面积累了丰富的经验。尽管中医理论中无“铜离子”概念，但WD病程隐匿、缓慢进展的特点与《黄帝内经》“伏邪”及周仲瑛教授“伏毒”学说高度契合，即病邪深伏体内，日久耗伤正气，最终发病^{［15， 16］}。基于此，我们团队前期创制了以清热解毒、通腑利湿为核心治法的肝豆汤，临床应用显示其总好转率达84.1%^［17］。针对脑型WD患者“毒损脑髓”的核心病机，我们在肝豆汤基础上加用芍药、山茱萸、三七等活血养髓之品，形成了“通腑养髓”治法及其代表方剂改良肝豆汤（MGDD），临床观察证实其对改善神经症状具有一定疗效。我们前期的动物实验也表明，“通腑养髓”法能通过调控Cyt-C/Caspase通路，减轻铜诱导的海马神经元损伤，改善WD模型（TX小鼠）的认知功能^［18］。

基于以上背景，我们提出科学假说：“通腑养髓”法可能通过抑制铜过载诱导的PKR/eIF2α通路过度激活，减轻其对突触蛋白合成的抑制，修复突触结构与功能，从而改善WD模型小鼠的认知功能。为验证此假说，本研究将采用WD的TX小鼠模型，以特异性PKR抑制剂C16作为阳性对照，系统评价MGDD对TX小鼠认知行为、海马突触超微结构、突触相关蛋白表达以及PKR/eIF2α通路关键分子活性的影响。本研究旨在阐明“通腑养髓”法改善WD认知障碍的分子机制，为中医药治疗神经退行性疾病提供新的实验证据，并将传统中医理论与现代分子生物学研究进行有效对接。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

本实验选用C3HeB/FeJAtp7btx-J/J（TX）小鼠作为Wilson病动物模型，该品系购自美国Jackson实验室。所有小鼠均饲养于安徽中医药大学神经病学研究所实验动物中心，饲养环境保持12 h∶12 h明暗循环、室温20~22℃、相对湿度50%~60%，并保证自由饮水和摄食。在基因型鉴定方面，我们于小鼠4周龄时采集1~2 mm尾尖组织，使用小鼠尾巴基因型鉴定试剂盒（YK-MG-100， Ubigogen Biosciences）提取DNA模板。采用特异性引物（正向：5'-AGAGTGTGTGCCCT CAGTATCAAAT-3'；反向：5'-TCAAAGAAGGTCAC GGGGC-3'）进行PCR扩增，并通过DNA测序验证基因型。最终，我们筛选出两性纯合子TX小鼠用于后续繁殖。本研究所用动物为5月龄雄性TX小鼠，所有实验操作均遵循安徽中医药大学动物伦理委员会审批的实施方案（伦理批号：AHUCM-2023034）执行。

1.1.2 实验药物

MGDD由大黄20 g，黄连20 g，莪术20 g，姜黄20 g，鱼腥草30 g，泽泻24 g，三七3 g，芍药20 g，山茱萸30 g组成，所有药物均购于北京同仁堂。

1.1.3 主要试剂

PKR-IN-C16（Selleck）；8-OHdG、PKR（Abcam）；TUNEL神经元凋亡检测试剂盒（Service bio）；PSD93、PSD95、Synapsin1、Synaptophysin、P-eIF2α、CHOP、P-CREB、ATF4（Cell Signaling Technology）；P-PKR（Invitrogen）；α-tubulin、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（ZENBIO）；RIPA裂解液（Solarbio）；SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit （With gDNA Eraser）、改良组织/细胞RNA快速提取试剂盒（含基因组DNA清除柱）、2×SYBR Green qPCR MIX（With ROX）（SparkJade）。

1.2 研究方法

1.2.1 MGDD的制备

采用传统水煎法制备，具体流程如下：将组方中药材用蒸馏水浸泡30 min后，加入200 mL蒸馏水煎煮至沸腾，随后加入大黄，转为文火继续煎煮30 min；过滤药液后，药渣再次加入200 mL蒸馏水重复煎煮1次；合并两次滤液，浓缩至150 mL，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 动物分组与药物干预

实验动物分为4组：TX组、TX+MGDD组、C16组和C16+MGDD组。为构建PKR沉默Wilson病模型，C16组和C16+MGDD组小鼠每天早晨腹腔注射PKR抑制剂C16（300 μg/kg，0.2 mL/只），连续干预30 d；TX组和TX+MGDD组则注射等量生理盐水。完成造模后，TX+MGDD组和C16+MGDD组灌胃给予MGDD药液，TX组和C16组灌胃等体积生理盐水，灌胃干预持续4周。具体实验流程见图1。

1.2.3 行为学测试

旷场实验：使用50 cm×50 cm×40 cm的实验箱，将其划分为中央区和外周区。实验时将单只小鼠置于箱内预定位置，记录其在中央区和外周区的运动距离与停留时间。每次测试结束后用75%乙醇彻底清洁箱体，避免气味干扰。

巴恩斯迷宫：采用直径122 cm、高99 cm的圆形平台，周边均匀分布20个直径10 cm的孔洞，其中一个设置逃生通道作为目标洞口。实验时将小鼠随机朝向放置于平台中心，记录其寻找目标洞口的潜伏期及头部探究潜伏期。测试期间保持环境安静，每次实验后以75%乙醇擦拭平台消除嗅觉线索。

1.2.4 8-OHdG免疫荧光检测

心脏灌注后取脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，经蔗糖溶液脱水后制备20~30 μm冠状切片。切片经3%牛血清白蛋白封闭30 min后，与8-OHdG一抗（1∶50， Abcam）4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次后，与Cy3标记的二抗室温避光孵育1 h，DAPI复染细胞核，于荧光显微镜下观察并采集图像，后使用Image J进行定量分析。

1.2.5 TUNEL染色

按TUNEL神经元凋亡检测试剂盒说明书进行操作。简要流程如下：脑组织石蜡切片脱蜡至水，蛋白酶K修复抗原后，加入TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育1 h。DAPI复染细胞核，封片后于荧光显微镜下观察。凋亡细胞核呈现绿色荧光，随机选取5个视野使用Image J计数凋亡细胞数量。

1.2.6 透射电镜样品制备与观察

取1 mm³海马组织，迅速投入4℃电镜固定液中前固定24 h；0.1 mol/L PBS（pH 7.4）冲洗后，1%四氧化锇-PB溶液后固定2 h。经梯度乙醇脱水、环氧树脂渗透包埋后，60 ℃聚合48 h。制备60~80 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，日立H-7650型透射电子显微镜观察并采集图像。

1.2.7 RT-qPCR检测

取约10 mg海马组织，采用改良组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取总RNA，检测RNA浓度和纯度。按SPARK script Ⅱ RT Plus Kit说明书去除基因组DNA并反转录合成cDNA。采用2×SYBR Green qPCR MIX进行荧光定量检测，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.8 Western blotting检测

取100~130 mg海马组织，加入1 mL RIPA裂解液（含PMSF）冰上匀浆提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白上样，根据目标蛋白分子量选择8%或12% SDS-PAGE胶进行电泳分离，转至PVDF膜后，5%脱脂牛奶封闭2 h。加入一抗（PKR 1∶2000、PSD93 1∶1000、PSD95 1∶1000、Synapsin1 1∶1000、Synaptophysin 1∶1000、P-eIF2α 1∶1000、CHOP 1∶1000、P-CREB 1∶1000、P-PKR 1∶1000、ATF4 1∶1000、α-tubulin 1∶1000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后与HRP标记二抗（1∶10 000）室温孵育2 h，ECL化学发光法显影，Image J软件分析条带灰度值。

1.2.9 统计学分析

实验数据以均数±标准差表示。经Shapiro-Wilk检验证实数据符合正态分布（P>0.05），Brown-Forsythe检验确认方差齐性（P>0.05），故采用参数检验进行统计分析。两组间比较使用t检验，多组间比较采用单因素或多因素方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PKR抑制剂C16有效抑制TX小鼠海马PKR磷酸化

Western blotting验证PKR抑制剂C16对Wilson病模型TX小鼠的干预效果，结果显示，C16处理降低了TX小鼠海马P-PKR与总PKR的蛋白比率（P<0.01，图2）。

2.2 “通腑养髓”治法与PKR抑制剂C16均改善TX小鼠焦虑样行为与空间记忆损伤

旷场实验结果显示，经MGDD或C16治疗后，TX小鼠的中央区域活动均有增加趋势。与C16组相比，C16+MGDD组在边缘区域的路程减少（P<0.05），提示联合用药可能进一步缓解焦虑情绪。但在中央时间、中央路程及边上时间等指标上，C16+MGDD组与C16组无显著差异（图3）。

在巴恩斯迷宫测试中，MGDD和C16治疗均能缩短TX小鼠的逃逸潜伏期（P<0.05）。然而，C16+MGDD组与C16组或TX+MGDD组相比，在逃逸潜伏期上未显示出显著差异，表明联合用药在改善空间记忆方面未产生叠加效应（图4）。

2.3 “通腑养髓”治法与PKR抑制剂C16均可减轻TX小鼠海马神经元凋亡与氧化损伤

TUNEL染色结果显示，MGDD和C16治疗均能有效降低TX小鼠海马神经元凋亡率（P<0.05）。联合用药组（C16+MGDD）的抗凋亡效果与单独用药组相比，未见显著增强（图5）。

免疫荧光结果显示，MGDD和C16治疗均能减少TX小鼠海马CA1区8-OHdG（DNA氧化损伤标志物）阳性细胞数（P<0.05）。C16+MGDD组的阳性细胞数与C16组或TX+MGDD组相比差异无统计学意义（图6）。

2.4 “通腑养髓”治法与PKR抑制剂C16均可修复TX小鼠海马突触超微结构损伤

透射电镜观察海马CA1区突触超微结构发现，TX组小鼠突触结构模糊，突触后致密物质（PSD）变薄，突触间隙变宽，突触囊泡数量较少。经MGDD或C16干预后，突触结构得到明显改善，表现为突触前后膜结构清晰，PSD增厚，突触囊泡数量增多。C16+MGDD组的改善程度与单独使用MGDD或C16的组别相似，未观察到明显的叠加效应（图7）。

2.5 “通腑养髓”治法与PKR抑制剂C16均可上调TX小鼠海马突触相关蛋白表达

Western blotting结果显示，MGDD和C16治疗均能上调TX小鼠海马组织中突触前蛋白Synapsin1、Synaptophysin以及突触后蛋白PSD93、PSD95的表达水平（P<0.05）。进一步比较发现，与C16组相比，C16+MGDD组的PSD95、Synapsin1和Synaptophysin蛋白表达水平均升高（P<0.05），但PSD93的表达差异无统计学意义（图8）。

2.6 “通腑养髓”治法通过抑制PKR/eIF2α通路并激活CREB信号发挥对TX小鼠的神经保护作用

RT-qPCR结果显示，各组间Pkr和eIF2alpha的mRNA表达水平差异无统计学意义（图9）。

MGDD和C16治疗均能降低TX小鼠海马组织P-PKR和P-eIF2α水平，同时升高P-CREB水平（P<0.05）。在比较C16组和C16+MGDD组时，我们发现联合用药组的P-eIF2α水平进一步下降（P<0.05），而P-PKR水平无显著变化，这符合C16作为PKR抑制剂的药理作用。此外，eIF2α磷酸化下游的应激分子ATF4和CHOP在TX组中表达升高，MGDD和C16治疗后均下降。C16+MGDD组的CHOP蛋白水平较C16组降低（P<0.05），而P-CREB水平则升高（P<0.05），ATF4水平变化差异无统计学意义（图10）。

3 讨论

WD特别是脑型患者认知功能障碍的病理生理机制复杂，铜诱导的突触损伤可能是其认知功能障碍的重要原因。如何抑制铜诱导的突触损伤是WD临床治疗需要突破的瓶颈，亦是WD认知功能障碍防治的重要途径。PKR/eIF2α通路在神经退行性疾病中发挥重要作用，激活PKR及其下游的eIF2α通路可抑制突触相关蛋白表达，导致突触结构损伤和进一步的认知功能下降，受到越来越多的学者关注。本研究以此为切入点探讨“通腑养髓”法改善WD认知功能的潜在分子机制。WD的病机本质可概括为“先天禀赋不足，铜毒内蕴，化热生痰，上扰脑窍”。铜毒作为“伏邪”长期蕴结体内，郁久化热，煎灼津液成痰，形成“铜毒内伏，痰瘀阻络，毒损脑络”的复杂病机^{［16， 19］}。“通腑养髓”法中的黄连、大黄清热解毒，芍药、三七活血养髓，山茱萸、泽泻补肾利湿，全方共奏“清铜毒、化痰瘀、养脑髓”之效。本研究以PKR/eIF2α通路介导的突触损伤切入，利用WD模型TX小鼠探讨“通腑养髓”法改善认知功能的潜在分子机制，为“通腑养髓”法治疗脑型WD提供科学依据。

WD的神经系统损伤是一个涉及氧化应激、细胞凋亡和突触功能障碍的复杂病理过程^{［13， 20］}。本研究观察到TX小鼠在行为学层面表现出显著的空间学习记忆能力下降和焦虑样行为，这与临床脑型WD患者的认知功能障碍特征高度吻合^［21］。突触是多种学习形式的基础， 其功能紊乱可导致认知损害，在神经系统退行性疾病的发病中起重要作用。Synaptophysin是衡量突触完整性的“金标准”指标，在大脑疾病研究中常用其确定突触密度变化以评估神经元受损程度^［22］。Synapsin1为神经元特有的磷酸化蛋白，通过调控突触前囊泡动员与释放，左右信号传递效率^［23］。突触后致密区富集的PSD-93作为骨架蛋白，可聚集多种受体/信号分子，搭建突触后信号网络^［24］。同家族的PSD-95则在神经元成熟及突触发育阶段发挥桥梁作用，可影响可塑性与记忆^［25］。上述四种蛋白的表达下调均提示突触功能受损。我们的研究在细胞层面发现，海马区突触相关蛋白（Synaptophysin、Synapsin1、PSD93、PSD95）表达显著下调，突触超微结构出现明显破坏，这些发现与近期研究提出的“突触功能障碍是WD认知损害核心环节”的观点相一致。本研究中，经MGDD治疗后，TX+MGDD组在中央时间、中央路程、边上时间、边上路程及目标洞口潜伏期均减少，TX小鼠的空间学习记忆能力下降和焦虑样行为得到有效改善，同时Synaptophysin、Synapsin1、PSD93、PSD95的表达水平显著上调，说明MGDD治疗有效逆转了这些病理改变，而且在某些指标上MGDD表现出与PKR特异性抑制剂C16相当的改善效果，显示出其作为中药复方的独特治疗价值。说明“通腑养髓”法改善WD认知功能的效果确切可靠，探索其相关机制具有重要意义。

WD神经损伤的病理生理机制复杂，其中，铜过载诱导的氧化应激是核心环节之一。过量的铜离子通过Fenton反应催化活性氧（ROS）的生成，导致神经元脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，最终引发突触功能障碍和神经元凋亡^{［13， 20， 26-28］}。WD的“铜毒内伏，痰瘀阻络，毒损脑络”的中医病机这一传统认识与现代医学发现的铜过载诱发氧化应激、激活PKR/eIF2α通路、启动细胞凋亡程序的分子机制高度契合^［29-32］。本研究通过TUNEL染色和8-OHdG免疫荧光检测，首次在实验层面证实“通腑养髓”法能够有效阻断“铜毒-氧化-凋亡”这一病理级联反应。治疗组小鼠不仅神经元凋亡数量显著减少，而且凋亡细胞的形态学特征也发生明显改善，这从细胞形态学层面印证了“髓复神安”的传统理论。突触是神经元相接触部分的功能特化区，是其发挥生理学作用的关键部位。在突触超微结构层面，透射电镜观察显示，模型组小鼠突触数量明显减少，突触间隙模糊不清，突触前后膜结构紊乱，生动呈现了中医所述“铜毒蚀髓”的病理状态。经MGDD治疗后，突触密度显著增加，突触囊泡排列有序，突触间隙界限清晰，直观展示了“髓养则神复”的治疗效果。这些结构改善与突触相关蛋白表达上调相互印证，说明“通腑养髓”法能够在分子和结构两个层面协同修复突触功能单元。表明突触功能与WD认知功能障碍病理生理密切相关，“通腑养髓”法改善WD认知功能障碍的作用机制与抑制ROS介导的突触损伤和神经元凋亡密切相关。

整合应激反应（ISR）是细胞应对内外环境胁迫的关键防御机制，其核心是真核细胞起始因子eIF2α的磷酸化^{［33， 34］}。eIF2α 是真核细胞蛋白质合成的“总开关”，其磷酸化即关闭翻译，而记忆巩固离不开蛋白稳态重塑，干预 eIF2α的磷酸化被视为增强记忆“最通用且高效”的策略之一^［35］。在哺乳动物细胞中，4种eIF2α激酶（PKR， PERK， GCN2， HRI）分别被不同类型的应激信号激活^{［33， 34， 36］}。其中，PKR作为一种应激激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，不仅是抗病毒免疫的关键分子，还能被氧化应激等多种非病毒信号激活，进而磷酸化eIF2α^{［37， 38］}，抑制蛋白合成。但磷酸化的eIF2α像一把“双刃剑”，它按下总体蛋白合成的暂停键，却同时给激活转录激活因子4（ATF-4）的翻译开绿灯，增加的P-eIF2α可通过特异性促进ATF4的表达。ATF4 水平升高后，其作为内质网应激和凋亡信号传导的重要转录因子，又进一步促进下游效应因子促凋亡分子C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达，驱动神经元的凋亡^［39-41］。ATF4和cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）形成负向调控轴，ATF4竞争结合以抑制CREB的磷酸化，导致 CREB 靶基因转录受阻，从而损害突触可塑性及长期记忆巩固^［42-44］。我们的前期研究发现，TX小鼠海马中PKR及其底物eIF2α的磷酸化水平均显著升高，表明在铜毒性作用下，该应激通路被持续激活，介导突触功能障碍，导致神经元损伤^［13］。MGDD治疗能够显著降低P-PKR和P-eIF2α的水平，其效果与特异性PKR抑制剂C16相似。这有力地证明了抑制PKR/eIF2α通路是MGDD发挥神经保护作用的关键机制之一。通过抑制该通路，MGDD解除了对蛋白质翻译的全局性抑制，使得突触蛋白得以恢复合成，从而修复了突触结构和功能。为了进一步验证MGDD的作用靶点，我们设计了联合用药实验。本研究结果显示，在已使用C16抑制PKR活性的基础上，MGDD仍能进一步降低P-eIF2α、ATF4和下游促凋亡蛋白CHOP的水平，并上调P-CREB的水平。这一现象提示MGDD的作用机制可能比单纯抑制PKR更为复杂。eIF2α的磷酸化由4种激酶共同调控，其中PERK同样能被内质网应激（一种由氧化应激诱发的细胞状态）激活^{［33， 34， 36］}。因此，MGDD可能不仅抑制PKR，还可能通过其他途径（如调节PERK活性或增强eIF2α去磷酸化）来调控eIF2α的磷酸化状态。此外，MGDD在C16干预后仍能显著上调多种突触蛋白的表达，也暗示其可能通过促进蛋白转录、稳定mRNA或其它突触保护机制发挥作用。中药复方多成份、多靶点的特点在此得到了体现。MGDD与特异性PKR抑制剂C16联合使用时，在多数指标上未表现出叠加效应，这一结果恰恰提示，PKR/eIF2α通路可能是MGDD发挥神经保护作用的关键枢纽。当该通路已被C16有效抑制时，MGDD的增效空间随之减小，这从侧面印证了其作用靶点与此通路的高度相关性。综上，“通腑养髓”法治疗WD认知功能障碍的作用机制与调控 PKR/eIF2α通路密切相关。

综上所述，研究首次从多维度证实，MGDD通过调控PKR/eIF2α信号通路，促进突触相关蛋白表达，改善突触超微结构，最终缓解铜过载引起的认知功能障碍，为“通腑养髓”法治法的临床应用提供了坚实的实验依据。

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基金资助

国家自然科学基金(81904086)

国家自然科学基金(81603596)

国家自然科学基金(81673948)

大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所专项(2023CXMMTCM002)

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