电针“百会”“足三里”通过激活海马星形胶质细胞改善单次长时间应激小鼠恐惧记忆消退障碍

Electroacupuncture at Baihui and Zusanli improves fear memory extinction in single prolonged stress mice by activating hippocampal astrocytes

摘要

目的 探究电针对单次长时间应激（SPS）小鼠恐惧记忆消退的影响及星形胶质细胞（AST）参与的潜在机制。 方法 将36只雄性C57BL/6J小鼠随机分为6组（6只/组）：实验一分为对照组、模型（SPS）组、电针治疗（EA）组和帕罗西汀阳性药（PRX）组；实验二分为Saline组和CNO组，通过化学遗传病毒抑制小鼠海马AST。除对照组外，其余各组采用SPS法进行模型制备。造模7 d后，EA、Saline和CNO组取“百会”“足三里”进行电针干预，PRX组予帕罗西汀溶液灌胃，连续干预10 d。采用条件性恐惧实验和高架十字迷宫实验评价小鼠恐惧记忆消退和焦虑样行为，其中CNO组在检测开始前30 min予CNO腹腔注射；采用Western blotting检测小鼠海马GFAP和CX43的蛋白表达。 结果 与对照组比较，SPS组小鼠恐惧再暴露阶段3~15 min内的凝滞时间、消退测试阶段的凝滞时间增加（P<0.05），恐惧消退指数、进入开放臂的时间降低（P<0.01），GFAP的平均荧光强度和AST的分支数量在距离胞体40~60 μm降低（P<0.05），海马GFAP和CX43蛋白的表达降低（P<0.05）。与SPS组比较，EA组与PRX组小鼠恐惧再暴露阶段3~6 min内的凝滞时间、消退测试阶段的凝滞时间降低（P<0.05），恐惧消退指数、进入开放臂的时间增加（P<0.05），GFAP的平均荧光强度增加（P<0.001），海马CX43蛋白的表达增加（P<0.05）；EA组海马AST的分支数量在距离胞体50 μm增加（P<0.05）。与Saline组比较，CNO组小鼠恐惧再暴露阶段3~9 min内和消退测试阶段的凝滞时间增加（P<0.05），恐惧消退指数和进入开放臂的时间降低（P<0.05）。 结论 电针“百会”“足三里”可通过激活海马AST改善SPS小鼠的恐惧记忆消退障碍和焦虑样行为。

Abstract

Objective To explore the effect of electroacupuncture (EA) on fear memory extinction in single prolonged stress (SPS) mice and the potential mechanism involving astrocytes. Methods Thirty-six male C57BL/6J mice were randomly divided into the control, SPS model, EA treatment, paroxetine positive drug (PRX), Saline and CNO group. In Saline and CNO group, chemical genetic virus was used to inhibit the hippocampal astrocytes. Except for control group, the other groups were subjected to SPS modeling. After 7 days, the EA, Saline and CNO group were treated with EA at Baihui and Zusanli, while PRX group was given paroxetine solution for 10 days. Fear conditioning test and elevated plus maze test were used to evaluate fear memory extinction and anxiety-like behaviors, and the CNO group was administered CNO 30 minutes before the tests start. Immunofluorescence staining was used to observe the changes in the number and morphology of hippocampal astrocytes, and hippocampal expressions of GFAP and CX43 proteins were detected using Western blotting. Results In the mouse models with SPS, EA intervention significantly reduced the freezing time during fear re-exposure for 3-15 min and in the fear extinction phase. EA intervention also significantly increased the extinction coefficient, time spent in the open arms, the mean fluorescence intensity of GFAP, the number of astrocyte branches 50 μm from the soma, and the expression of CX43 proteins in the hippocampus of SPS mice. Conclusion EA at Baihui and Zusanli improves fear memory extinction and anxiety-like behaviors in SPS mice by activating hippocampal astrocytes.

Graphical abstract

关键词

创伤后应激障碍 / 电针 / 恐惧记忆消退 / 星形胶质细胞

Key words

post-traumatic stress disorder / electroacupuncture / fear memory extinction / astrocytes

创伤后应激障碍（PTSD）是一种以恐惧记忆消退障碍、焦虑为核心症状的精神障碍^［1］。一项伞状系统评估发现，经受过自然灾害、战争等创伤事件人群的患病率高达23.95%^［2］，然而目前PTSD的治疗方法仍存在中断率高、副作用大、早期预防手段不足等局限性^{［3， 4］}。因此，寻求安全有效的防治方法意义重大。海马是大脑中负责学习记忆以及恐惧、焦虑等情绪的重要区域，研究发现PTSD患者和动物模型的大脑中均出现海马体积变小、神经元损伤等病理改变^{［5， 6］}。而星形胶质细胞（AST）在海马中作为高度异质的细胞群，与神经递质传递、神经元保护等密切相关^［7］，越来越多的证据表明AST参与恐惧记忆和压力相关疾病的形成和病理重塑^{［8， 9］}。

电针具有操作简便、价格低廉且无明显不良反应的独特优势，其对PTSD的临床疗效已得到广泛认可^{［10， 11］}。研究表明，电针治疗可能通过修复海马脑区的结构和神经元损伤改善PTSD^［12］；此外，电针能够预防抑郁样小鼠海马AST的萎缩，调节脑卒中小鼠AST的活性^{［13， 14］}。“百会”“足三里”是针灸治疗PTSD的临床试验和动物实验中出现频率较高的两个穴位^［15］，本课题组前期研究也显示电针“百会”“足三里”能够干预PTSD模型小鼠的恐惧记忆异常和睡眠时间减少^［16］。然而，电针对PTSD模型小鼠海马AST的影响以及电针是否通过AST发挥治疗作用，目前尚无研究报道。单次长时间应激（SPS）模型能够诱导啮齿动物表现出PTSD样行为^［17］。本研究通过观察SPS小鼠恐惧记忆消退、焦虑样行为和AST的变化，探讨电针对SPS小鼠PTSD样行为的改善作用和潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

5~7周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠共36只，体质量18~20 g，由杭州子源实验动物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004。所有小鼠饲养于安徽中医药大学科研中心动物房，温度20~24 ℃，相对湿度45%~65%，提供自由摄食和饮水，12 h/12 h的明暗光照周期。经过7 d适应性喂养后开始实验。本实验遵循安徽中医药大学动物使用的相关伦理要求（伦理批号：AHUCM-mouse-2024164）。

1.2 主要试剂和仪器

异氟烷（深圳瑞沃德），盐酸帕罗西汀片（天津葛兰素史克），0.9%氯化钠注射液（安徽丰原药业），4%多聚甲醛固定液（广州硕谱），GFAP抗体（北京博奥森），辣根酶标记山羊抗兔、辣根酶标记山羊抗小鼠（北京中杉金桥），CX43抗体、β-actin抗体、山羊抗小鼠AF594、山羊抗小鼠FITC（成都正能），山羊血清（武汉博士德），DAPI染色液、抗荧光淬灭剂（上海碧云天），增强型化学发光液（上海天能），氯氮平-N-氧化物（CNO）、rAAV-GFAP-hM4D（Gi）-mCherry-WPREs（武汉枢密）。

一次性无菌针灸针（苏州医疗用品厂），SDZ-Ⅱ型电子针疗仪（苏州华佗），45 mm直头灌胃针（安徽白鲨），ANY-maze条件恐惧箱（Ugo Basile），SuperMaze高架十字迷宫装置（上海欣软），脑立体定位仪、小动物专用呼吸麻醉机（深圳瑞沃德），微量进样器（上海高鸽），电泳仪、电泳槽、转膜槽、曝光仪（上海天能），冷冻切片机（LEICA），激光共聚焦显微镜（OLYMPUS）。

1.3 实验分组与模型制备

1.3.1 实验分组

实验一：研究电针对SPS小鼠的恐惧记忆消退和AST的影响，分为对照组、SPS组、电针治疗（EA）组和帕罗西汀阳性药（PRX）组，6只/组。采用SPS法对SPS组、EA组和PRX组小鼠进行模型制备，造模后7 d开始干预：EA组予电针“百会”和“足三里”，PRX组予帕罗西汀溶液灌胃，对照组和SPS组予和上述2组小鼠相同条件的麻醉和抓取处理，不进行其他干预。干预10 d后进行行为学检测。

实验二：研究AST参与电针干预作用的潜在机制，分为Saline组和CNO组，6只/组。将化学遗传病毒（rAAV-GFAP-hM4D（Gi）-mCherry）通过定位注射的方法注射到各组小鼠海马CA1区，病毒表达14 d后采用SPS法对2组小鼠造模，造模后7 d进行电针干预，干预10 d后进行行为学检测，并在检测开始前30 min予CNO腹腔注射（图1）。

1.3.2 模型制备

参照文献^［18］采用SPS法，包括连续束缚、强迫游泳、异氟烷麻醉、单次电击4个步骤进行模型制备：将小鼠放在50 mL离心管内固定2 h后，立即迫使其在装有约2/3水，水温22±2 ℃的圆柱桶中游泳20 min，其中桶高50 cm，半径12 cm。休息15 min后，迅速使小鼠暴露于5%异氟烷至失去意识，待其清醒、能够站立后继续将其麻醉，重复3次。休息15 min后，将小鼠置于电击箱内接受单次强度为2 mA的足底电击，持续2 s，最后将小鼠放回笼中。以小鼠出现警觉性增高、易激惹、毛发竖立等应激反应为造模成功。

1.4 干预方法

1.4.1 电针方法

取“百会”和双侧“足三里”，穴位定位参考《实验动物常用穴位名称与定位第3部分：小鼠》^［19］。小鼠经异氟烷（氧流量0.5 L/min，浓度2%）诱导麻醉后，剃除穴位局部被毛，俯卧位固定于操作台。穴位常规消毒后，采用0.20 mm×13 mm一次性无菌针灸针，“百会”以45°角向前斜刺2 mm，“足三里”直刺4 mm。针刺后连接SDZ-Ⅱ型电子针疗仪，电极负极连接“百会”，正极连接一侧“足三里”，次日改连对侧，双侧交替。选择疏密波，频率3 Hz/15 Hz，电流强度1 mA，留针30 min^{［16， 20］}；EA组电针后予和PRX组相同条件的抓取处理。

1.4.2 帕罗西汀灌胃方法

将盐酸帕罗西汀片溶解于0.9%氯化钠溶液中，制备浓度2.5 g/L的帕罗西汀溶液；予小鼠帕罗西汀溶液（剂量为10 mg/kg）灌胃^［21］；灌胃后予和EA组相同条件的麻醉处理。

1.5 行为学测试

1.5.1 条件恐惧实验（FCT）

使用连接ANY-maze软件的条件恐惧箱（242 mm×242 mm×300 mm），从SPS造模后第14天开始分别进行适应、训练、恐惧再暴露测试和消退测试4个阶段，每个阶段间隔24 h，共4 d（即干预结束后第1天开始恐惧再暴露测试）。适应：将小鼠置于恐惧箱5 min，使其熟悉环境。训练：将小鼠置于恐惧箱5 min，予3次（2 s/次，电流强度1 mA）的足底电击，每次间隔73 s。恐惧再暴露测试：将小鼠在同一时间重新暴露于恐惧箱，即恐惧环境中15 min（此阶段不予足底电击），仅记录小鼠凝滞时间。消退测试：将小鼠在同一时间置于恐惧箱5 min（此阶段不予足底电击），仅记录小鼠凝滞时间。“凝滞时间”的判断标准为小鼠头、尾及四肢静止不动的时间。恐惧消退指数（%）=［（恐惧再暴露0~3 min凝滞时间-恐惧消退0~3 min凝滞时间）÷恐惧再暴露0~3 min凝滞时间］×100%^［22］。每只小鼠测试结束后，均使用75%乙醇清洗设备以消除气味对实验的影响。

1.5.2 高架十字迷宫实验（EPMT）

SPS造模后第18天进行EPMT。高架十字迷宫由2个开放臂（50 mm×250 mm）、2个闭合臂（50 mm×250 mm×50 mm）和一个中心区域（50 mm×50 mm）组成，上方为连接SuperMaze软件的摄像机。将小鼠面对闭合臂放在中心区域，使其自由活动5 min，摄像机记录其运动轨迹，分析小鼠在开放臂的停留时间。进入开放臂的判定标准为小鼠4爪均进入开放臂。每只小鼠测试结束后，均使用75%乙醇清洗设备以消除气味对实验的影响。

1.6 化学遗传病毒与立体定位注射

异氟烷吸入麻醉后（氧流量0.5 L/min，浓度2%），将小鼠固定于脑立体定位仪，常规消毒后剪开颅顶皮肤，充分暴露前、后囟，调平。通过微量注射泵以0.1 μL/min的速度，将500 nL的病毒（rAAV-GFAP-hM4D（Gi）-mCherry）分别注射至双侧海马（前囟后2.3 mm，旁开1.75 mm，深1.60 mm）。每次注射后留针10 min，缓慢上提玻璃电极后缝合小鼠头部，将其放在保温毯上复温，待其苏醒后放回笼中休息。病毒转染1月后，行为学测试前30 min予CNO组小鼠2 mg/kg腹腔注射CNO以激活病毒，Saline组予等体积的生理盐水以排除CNO对行为学的影响。

1.7 Western blotting实验

实验一行为学检测结束后每组随机选取3只小鼠，5%异氟烷麻醉后迅速断头处死，取海马组织按比例加入裂解液，研磨，提取蛋白样品。制胶，上样，电泳，将蛋白转印到NC膜后，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，PBST洗膜3次（10 min/次），一抗4 ℃孵育过夜（稀释比例：GFAP 1∶1 000、CX43 1∶1 000、β-actin 1∶1 000），PBST洗膜3次（10 min/次），二抗室温摇床孵育2 h（稀释比例：辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG 1∶10 000、辣根过氧化物酶标记抗兔IgG 1∶10 000），PBST洗膜3次（10 min/次）。避光条件下使用化学发光剂显影曝光，采用Image J软件进行灰度值分析，将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白β-actin的灰度值后进行归一化处理，得到目的蛋白相对表达量。

1.8 免疫荧光染色

行为学检测结束后每组随机选取3只小鼠，经5%异氟烷麻醉后进行灌流，取脑组织于4%多聚甲醛固定，蔗糖脱水。使用冷冻切片机将脑组织制备为厚度30 μm的大脑切片，10%山羊血清室温封闭1 h，PBS清洗3次（15 min/次），加入抗GFAP抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜。PBS清洗3次，加入山羊抗小鼠AF594、山羊抗小鼠FITC（1∶100），室温下避光孵育1.5 h，按1∶4比例加入DAPI染色液孵育30 min以标记细胞核。PBS清洗3次，使用抗荧光淬灭剂密封脑片，激光共聚焦显微镜观察观察GFAP和病毒荧光蛋白的表达。使用Image J软件进行平均荧光强度和Sholl分析。Sholl分析是一种以胶质细胞胞体为圆心画一系列同心圆后，通过神经元分支与其产生的交点个数，反映胶质细胞结构复杂程度的经典方法^［23］。

1.9 统计学分析

使用Prism 8.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。数据符合正态分布，两组间比较使用t检验；数据符合正态分布且方差齐，除恐惧再暴露阶段凝滞时间和Sholl分析的数据比较使用双因素方差分析，其余数据的比较使用单因素方差分析，进一步两两比较使用Tukey-Kramer法。若数据不符合正态分布，采用秩和检验，组间比较采用独立样本Kruskal Wallis单因素秩方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 电针能改善SPS小鼠的恐惧记忆消退障碍和焦虑样行为

与对照组比较，SPS组小鼠恐惧再暴露阶段3~15 min的凝滞时间增加（P<0.05）、消退测试阶段的凝滞时间增加（P<0.001）、恐惧消退指数降低（P<0.01）、进入开放臂的时间降低（P<0.01）。与SPS组比较，EA组与PRX组小鼠恐惧再暴露阶段3~6 min的凝滞时间降低（P<0.05）、消退测试阶段的凝滞时间降低（P<0.001）、恐惧消退指数增加（P<0.05）、进入开放臂的时间增加（P<0.05），恐惧再暴露阶段6~15 min的凝滞时间呈降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05，图2）。

2.2 电针能修复SPS小鼠海马GFAP下调和AST结构损伤

与对照组比较，SPS组小鼠海马CA1区GFAP的平均荧光强度和AST的分支数量在距离胞体40~60 μm降低（P<0.05）。与SPS组比较，EA组和PRX组海马CA1区GFAP的平均荧光强度增加（P<0.001），AST的分支数量呈增加趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），EA组小鼠AST的分支数量在距离胞体50 μm增加（P<0.05，图3）。

2.3 电针能回调SPS小鼠海马GFAP和CX43蛋白的表达

与对照组比较，SPS组小鼠海马GFAP和CX43蛋白的表达降低（P<0.05）。与SPS组比较，EA组和PRX组小鼠海马CX43蛋白的表达增加（P<0.05），GFAP蛋白的表达呈增加趋势，但差异无统计学意义（P>0.05，图4）。

2.4 抑制海马CA1区AST能阻断电针对SPS小鼠恐惧记忆消退障碍和焦虑样行为的改善作用

免疫荧光染色结果显示，化学遗传学病毒（rAAV-GFAP-hM4D（Gi）-mCherry）的荧光蛋白mCherry（红色荧光）与AST标志蛋白GFAP（绿色荧光）高度重合，病毒主要表达在海马CA1区AST上。

行为学结果显示，与Saline组比较，CNO组小鼠恐惧再暴露阶段3~9 min和消退测试阶段的凝滞时间增加（P<0.05），恐惧消退指数和进入开放臂的时间降低（P<0.05，图5）。

3 讨论

中医基础理论中虽没有PTSD这一概念，但结合其临床表现，认为PTSD属神志病，病位主要在脑，同时与心、肝、肾等脏腑经络均密切相关^［24］。“百会”是督脉要穴，又称“三阳五会”，具有聚百脉、统诸阳、安五脏、定神志之功效；而“足三里”是足阳明胃经的合穴，胃经作为多气多血之经，与脾经相表里，能够补益气血、补养心神，二者配伍可共同发挥通督调神、健脑养神的作用^［25］。因此，本研究选择电针“百会”“足三里”对PTSD模型小鼠进行干预。

帕罗西汀是国际医疗审核权威机构批准的，用于治疗成人PTSD的首选药物^［26］。研究表明帕罗西汀能够有效减轻SPS小鼠的PTSD样行为^［27］。因此，本研究将帕罗西汀作为阳性对照药以验证电针干预的有效性。通过FCT和EPMT，本研究发现模型小鼠在恐惧再暴露和消退测试阶段的凝滞时间、恐惧消退指数增加，进入开放臂的时间减少，提示模型小鼠出现恐惧记忆消退障碍和焦虑样行为，而电针干预能够逆转上述实验结果。且EA组的行为学结果与PRX组相比差异无统计学意义，说明电针“百会”“足三里”能够改善SPS小鼠的恐惧记忆消退障碍和焦虑样行为，且疗效与帕罗西汀相当。这与本课题组前期研究的结果一致^［28］。

既往研究表明，杏仁核-海马-前额叶皮层神经回路在恐惧记忆的获取、巩固及消退等不同阶段表现出显著的功能特异性，例如海马作为学习和记忆的核心区域，主要负责恐惧记忆的形成和消退^{［29， 30］}。本课题组近期一项研究结果显示，SPS小鼠海马脑区的反应性AST显著下降，且激活SPS小鼠海马AST能降低其恐惧记忆的获取^［31］。同时也有研究表明，SPS小鼠海马CA1区的AST出现数量降低和形态损伤^{［32， 33］}。因此，本研究聚焦于SPS小鼠海马CA1脑区AST的变化。然而，目前电针对SPS小鼠海马AST的影响并不明确。GFAP作为一种特异性表达于中枢神经系统AST中的中间丝状蛋白，能够维持AST结构稳定，是AST的重要标志物^［34］。本研究通过免疫荧光法，发现电针干预后SPS小鼠海马CA1区GFAP的平均荧光强度和AST的分支数量增加，提示电针“百会”“足三里”能够恢复SPS小鼠海马AST降低的数量和损伤的形态结构。此外，CX43是AST中表达的主要连接蛋白^［35］，研究表明上调CX43的表达能够减轻小鼠的空间记忆和AST功能障碍^［36］。本研究通过Western blotting检测发现，电针能够显著逆转SPS小鼠海马中降低的CX43和GFAP的表达，提示电针可能通过调控AST中的CX43干预小鼠的PTSD样行为。

CNO是一种人毒蕈碱设计受体激动剂，能通过激活受体hM4Di使化学遗传病毒发挥调控作用^［37］。为深入探索AST是否参与电针干预SPS小鼠这一过程，本研究通过化学遗传技术特异性地操纵海马CA1区的AST，观察抑制AST对电针干预SPS小鼠的影响。使用CNO激活化学遗传病毒，使小鼠海马的AST受到抑制后，行为学结果显示，电针对SPS小鼠恐惧消退指数和进入开放臂的时间的改善作用均被阻断，说明电针可能通过激活海马AST改善SPS小鼠的恐惧记忆消退障碍。相关研究表明，AST能通过CX43半通道释放ATP、谷氨酸等多种神经活性物质参与PTSD的病理改变^［9］，且细胞外ATP稳态失调会引起神经系统功能异常，导致焦虑、抑郁、精神分裂症等疾病^［38］。然而，本研究仅检测了海马CX43的表达，并未检测电针对海马ATP的影响。此外，AST还具备调控能量代谢、维持离子稳态、调节突触可塑性等多样化的功能^［9］。而一项临床研究发现，针灸可能通过抑制失眠患者过度激活的AST以减轻神经炎症^［39］；另有研究表明，针灸治疗能够增强模型小鼠腹侧海马CA1区的突触功能，改善其焦虑样行为^［40］。本研究仅验证了海马AST参与电针干预SPS小鼠的作用机制，电针如何激活海马AST并影响AST何种功能进而发挥作用尚未明确。未来将进一步探索电针激活海马AST的潜在机制，以及电针对SPS小鼠海马AST功能的影响。

综上所述，电针“百会”“足三里”能够通过激活海马AST缓解SPS诱导的小鼠恐惧记忆消退障碍和焦虑样行为，电针的效应可能与调节海马CX43的表达有关。本研究运用化学遗传学技术探索电针对PTSD核心症状的干预作用以及潜在机制，为PTSD的临床治疗提供了新的思路。

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基金资助

国家自然科学基金(82404890)

安徽省临床医学研究转化专项(202304295107020105)

安徽省高等学校科学研究项目(2024AH040137)

安徽省高等学校科学研究项目(2024AH051044)

新安医学与中医药现代化研究所“揭榜挂帅”项目(2023CXMMTCM013)

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