灯盏乙素通过调控MMP7与LCN2改善大鼠代谢功能障碍相关脂肪性肝病

Scutellarin improves metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in rats by regulating MMP7 and LCN2

摘要

目的 通过生物信息学、网络药理学及动物实验，探讨灯盏乙素（Scu）治疗代谢相关脂肪性肝病（MASLD）的靶点及机制。 方法 从GEO数据库GSE89632鉴定MASLD差异表达基因（DEGs）。利用PharmMapper预测Scu靶点，Cytoscape构建药效团-靶点网络。R语言的clusterProfiler包进行GO和KEGG通路分析。STRING工具构建PPI网络，cytoHubba和MCODE确定关键治疗（KT）基因。进行分子对接及分子动力学模拟验证。将SD大鼠随机分为对照组、模型组、Scu低/中/高剂量（50、100、200 mg·kg^-1·d^-1）组及辛伐他汀（5 mg·kg^-1·d^-1）组（n=10）。12周高脂高糖饮食造模后，给药组连续灌胃8周。 结果 共鉴定出810个DEGs 和12个PT基因。GO和KEGG分析指向炎症调控、细胞因子应答、纤维化和代谢相关通路。分子对接和动力学模拟验证了MMP7和LCN2为关键靶点。动物实验显示，Scu剂量依赖改善MASLD大鼠胰岛素抵抗、肝功能，脂质及炎症相关因子，以及肝脏病理改变，高剂量Scu效果优于辛伐他汀（P<0.05）。q-PCR及Western blotting检测发现Scu以剂量依赖的方式上调MMP7的表达，下调LCN2的表达（P<0.05）。 结论 Scu可能通过调控MMP7和LCN2发挥抗MASLD的作用。

Abstract

Objective To identify the therapeutic targets and signaling pathways that mediate the therapeutic effect of scutellarin against metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Methods The differentially expressed genes (DEGs) in liver tissues of MASLD patients and healthy individuals were obtained from the GSE89632 dataset. The potential targets of scutellarin were screened using the PharmMapper database, and a drug-target network was constructed using Cytoscape. Functional enrichment analysis was performed using GO and KEGG pathway analysis. The intersection of scutellarin's target genes and the DEGs formed the potential therapeutic (PT) genes. Protein-protein interaction (PPI) networks were constructed using STRING to identify the key therapeutic (KT) genes. Molecular docking and dynamics simulations were used to assess the drug-target relationship. In a rat model of MASLD treated with different doses of scutellarin, the changes in serum biochemical parameters and liver pathology were analyzed. Results A total of 810 DEGs and 12 PT genes were identified, and GO and KEGG analyses suggested their involvement in inflammation regulation, cytokine response, fibrosis, and metabolism. In the rat models of MASLD, treatment with scutellarin significantly improved insulin resistance, liver function, lipid levels, inflammation, and hepatic pathology in a dose-dependent manner, and high-dose scutellarin produced better therapeutic effects than simvastatin. Scutellarin treatment significantly upregulated MMP7 and downregulated LCN2 expression in the mouse livers. Conclusion Scutellarin ameliorates MASLD in rats possibly by modulating hepatic MMP7 and LCN2 expressions.

Graphical abstract

关键词

灯盏乙素 / 代谢相关脂肪性肝病 / 生物信息学 / 网络药理学

Key words

scutellarin / metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease / bioinformatics analysis / network pharmacology

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是由肝脏内脂肪堆积以及代谢功能紊乱导致的一种慢性肝病，广泛涉及肥胖、糖尿病和代谢综合征等风险因素^［1］。流行病学数据显示，MASLD的患病率在全球范围内逐年上升，全球约有25%的人口患有这种疾病，已成为严重威胁公共健康的慢性肝病^［2］。

MASLD的主要治疗方法通常包括生活方式干预和药物治疗，主要涉及饮食控制、体质量管理以及使用特定药物以降低肝脏脂肪含量。然而，目前没有针对MASLD的特效药物，现有药物大多数是为了缓解相关的代谢症状（如胰岛素抵抗、脂肪积聚等），并不能完全逆转病情^［3］。尽管在理解MASLD的免疫学和分子机制方面取得了显著进展，寻求一种特效药的有效治疗方案仍是一项重大挑战^［4］。

在MASLD药物研发面临瓶颈的背景下，天然产物因其"多成分、多靶点、多途径"的作用特征和相对较低的不良反应而展现出独特优势。许多天然产物及其活性成分已在MASH动物模型和临床前研究中显示出显著的肝保护作用^［5］。与单一靶点的合成药物不同，天然产物可同时调控脂质代谢、炎症反应、氧化应激、胰岛素抵抗和肠道菌群等MASLD的多个核心病理环节，体现了“系统治疗”的理念^［6］。天然产物往往通过调控上游信号通路（如PI3K/AKT、AMPK、Nrf2、NF-κB）产生级联效应，而非简单地抑制单一下游靶点。这种作用模式使得天然产物能够在改善肝脏病理的同时，兼顾改善全身代谢紊乱，符合MASLD作为系统性代谢疾病的治疗需求^{［7， 8］}。

灯盏乙素（Scu）是一种从菊科植物灯盏花中提取的黄酮类化合物，具有多种药理活性^［9］。其药理作用包括抗炎^［10］、抗氧化^［11］、抗纤维化^［12］和血管保护^［13］等，这些特性使其在治疗代谢相关疾病中展现出广泛的潜力。本研究进一步探索Scu作为MASLD潜在治疗药物的作用靶点和机制，为其临床应用提供理论支持。既往研究表明，灯盏乙素通过增强自噬并抑制IRE1α/XBP1 通路，恢复肝细胞自噬功能、减轻内质网应激，从而下调SREBP-1c介导的脂质合成，显著改善MASLD中的肝脂积累^［14］。灯盏乙素在急性酒精性肝损伤模型中，通过激活Nrf2/HO-1 通路抑制氧化应激，并调控AKT/p38 MAPK/NF-κB 通路减少炎症因子表达（如TNF-α、IL-6），从而降低肝损伤标志物水平并改善组织病理变化^［15］。灯盏乙素对四氯化碳诱导的肝损伤具有保护作用，通过抑制CYP2E1 和 IκBα/NF-κB 信号通路、富集肠道菌群并调控脂质代谢与胆汁酸稳态相关内源性代谢物，缓解肝损伤并促进肝功能恢复，对肝纤维化有一定的抑制作用^［16］。然而，尽管体内和体外实验均取得了积极的结果，但对Scu在治疗MASLD中的具体机制仍然了解不足。Scu的核心治疗靶点和关键作用通路尚未明确，限制了其临床转化和精准应用。

近年来，生物信息学、网络药理学的整合已成为解析复杂生物过程和加速药物发现的有力工具。生物信息学技术能够通过大规模数据分析揭示疾病的分子基础和基因关联，为潜在的治疗靶点提供支持^［17］。网络药理学则通过构建药物-靶点-通路的关联网络，帮助理解药物的多靶点特性及其系统性作用机制^［18］。分子对接和分子动力学模拟可在分子水平验证Scu与关键靶点的结合亲和力和稳定性，提供药物-靶点相互作用的结构生物学证据。动物实验验证通过建立MASLD大鼠模型，评估Scu的实际治疗效果，并在蛋白和基因水平验证预测的关键靶点。这种计算预测与实验验证相结合的策略，能够显著提高药物机制研究的可靠性和临床转化价值。

本研究旨在通过生物信息学分析识别MASLD的差异表达基因和核心病理通路，利用网络药理学方法预测Scu治疗MASLD的潜在靶点和作用机制，通过分子对接和分子动力学模拟验证关键药物-靶点相互作用，并在MASLD大鼠模型中评估Scu的治疗效果及验证核心靶点的表达变化，以便为Scu治疗MASLD的作用机制提供理论依据，并为其临床应用和药物开发提供科学支撑。

1 材料和方法

1.1 基因表达数据收集和预处理

基因表达数据集GSE89632来自GEO数据库 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），包含MASLD患者肝脏组织样本的基因表达信息。GSE89632基于GPL14951平台，包括24例健康肝脏组织样本和18例患有MASH肝脏组织样本。通过Wilcoxon秩和检验以鉴定差异表达基因（DEGs）。筛选DEGs的截断标准设定为：|Log2FC|>1，并且调整后的P.adj<0.05。使用ggplot包可视化DEGs，绘制热图和火山图以直观展示基因表达的差异。

1.2 Scu药效团靶点网络构建

基于Scu的分子结构，通过PharmMapper （https：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）数据库预测其潜在靶基因。PharmMapper数据库是一个基于药物药效团的靶标预测平台，能够根据分子结构特征匹配潜在的靶点。通过将Scu的结构输入PharmMapper数据库，获取其可能的靶基因集合，并将这些靶基因用于后续的药效团靶点网络构建。Scu药效团靶点和DEGs的交集venn图使用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作。随后，利用Cytoscape软件构建Scu的药效团-靶点网络。

1.3 GO和KEGG分析

本研究使用GO和KEGG分析对基因功能进行富集分析，包括细胞组成（CC）、生物过程（BP）、分子功能（MF）以及信号通路的分析。首先，通过R语言中的clusterProfiler包对差异表达基因（DEGs）、Scu靶基因和潜在治疗（PT）基因分别进行GO和KEGG富集分析，以揭示这些基因在MASLD中的潜在生物学作用和信号通路。显著性水平设定为P<0.05，用于筛选显著富集的GO条目和通路。随后，利用dplyr和ggplot2包对分析结果进行数据处理和可视化，以展示富集结果的显著性和分布。

1.4 PT基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

为进一步解析PT基因在MASLD中的关键作用，使用在线数据库STRING （https：//string-db.org） 构建PT基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。STRING数据库通过整合多种蛋白质模块提供基因间的相互作用信息，并设置综合评分阈值为>0.4，以确保相互作用关系的统计学显著性。构建的PPI网络通过Cytoscape中的cytoHubba插件进行分析，并基于最大团中心性（MCC）算法对基因节点进行排序，筛选出具有较高中心性的基因。同时，使用MCODE插件对PPI网络中的模块进行聚类分析，识别关键模块（模块评分>4）。最终，将PT基因与MCODE分析获得的关键模块基因进行交集，得到可能在治疗MASLD中发挥核心作用的关键治疗基因（KT基因）。

1.5 分子对接

将Scu的结构文件（mol2格式）导入AutoDockTools（v1.5.7），设置为配体并保存为pdbqt格式。同时，将RCSBPDB 蛋白质结构数据库获得KT基因对应的蛋白质结构文件（PDB格式）导入AutoDockTools，进行脱水预处理后也保存为pdbqt格式。接着，将对接盒设置为覆盖整个蛋白质结构，以确保对接过程能够捕获所有可能的结合位点。随后，使用AutoDock Vina进行分子对接验证，输出Scu与蛋白质之间的结合结果。对接结果中选择最小自由能的构象，代表最优结合模式，并使用PYMOL软件进行可视化分析。这些结果为Scu在MASLD中的治疗潜力提供了结构依据，进一步揭示其与关键治疗靶点之间的相互作用机制。

1.6 分子模拟验证

选择 Gromacs2022 作为动力学模拟软件，AMBER99SB-ILDN为蛋白力场，GAFF为小分子力场，采用 SPCE 模型对体系添加水，建立大小为13.39934 nm×13.39934 nm×13.39934 nm 的水盒子，并添加离子自动平衡体系。采用最陡峭下降算法进行能量最小化（EM），在等温等容（NVT）系统中对溶质进行限制，将系统从0 K缓慢加热到300 K，然后在等温等压（NPT）系统中以300 K的温度和1 Bar的压力进行平衡，进行100 ns 的分子动力学模拟。采用 Gromacs2022 软件内置的分析模块对模拟轨迹进行数据分析。动力学指标包含回转半径、均方根偏差、均方根波动和氢键等。

1.7 动物实验

Scu（纯度>98%）来源于本校药学院。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（SPF，6 周龄，200±20 g）来自本院动物研究中心实验室。大鼠饲养在22±2 ℃，恒湿（55±5）%的条件下，光照周期为 12 h /黑暗周期为 12 h。适应饲养1周后，将SD大鼠随机分为 6 组，10只/组：对照组（饲喂正常饲粮8周）；MASLD模型组（饲喂高脂高糖饲粮：猪油 15%、蔗糖 25%、胆固醇1%、胆酸钠 0.5%、蛋黄粉 5%、普通日粮 53.5% 12周）；LD（50 mg·kg^-1·d^-1）、MD（100 mg·kg^-1·d^-1）、HD（200 mg·kg^-1·d^-1）Scu组 ，以及SIM组（5 mg·kg^-1·d^-1辛伐他汀灌胃8 周^{［19， 20］}）。按照NAFLD活动度评分（NAS）系统进行评分，包括肝细胞脂肪变性（0~3分）、小叶炎症（0~3分）和肝细胞气球样变（0~2分）。NAS评分≥5分确认为MASLD模型成功建立。本研究经伦理审查委员会批准（伦理批号：GLMC202005007）。

1.8 生化指标检测

使用血糖仪（Accu-Check Performa）检测空腹血糖水平。使用自动生化分析仪检测脂质相关因子：甘油三酯（TG）和胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）的水平，与肝功能相关因子谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）等的水平，以及炎症因子白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。

1.9 病理染色

取肝组织一段，4%多聚甲醛固定 24 h，然后石蜡包埋。取5 μm厚的切片，然后进行HE、油红O以及Masson染色，观察肝脏病理变化。

1.10 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）

用总RNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取肝组织总RNA。利用 cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行反转录。RT-PCR采用TB Green^® Premix EX Tap试剂盒（上海金畔生物科技有限公司）。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，然后在72 ℃下循环30次，持续10 min。引物序列如表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.11 免疫印迹法

总蛋白样品采用含苯甲磺酰氟（PMSF）的放射免疫沉淀法（RIPA）裂解缓冲液提取，并用比辛胆酸（BCA）定量。将蛋白以40 μg负载，用8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶分离，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5%牛血清白蛋白（BSA）在室温下阻断120 min。将膜与针对活性MMP7和LCN2的特异性一抗在4 ℃下孵育过夜。MMP7（#3801）抗体购自Cell Signaling Technology。LCN2（#31452-1-AP）抗体购自杭州华安生物技术有限公司。抗体稀释比例均为1∶1000。辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗兔或小鼠IgG（1∶3000稀释，Abcam）作为二抗。使用增强型化学发光检测系统对膜进行可视化。采用image J 13.0软件对信号强度进行量化。

1.12 统计学分析

本研究中使用R（4.4.1）进行生物信息学和统计分析，借助R包实现多种统计方法。在GSE89632数据集中，采用wilcoxon检验比较健康组和MASLD组样本差异，以评估差异表达基因的显著性。通过分析两组样本中基因表达的差异，进一步评估差异基因在GO术语中的富集情况，重点关注其在生物过程、细胞组成和分子功能等方面的显著性富集。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MASLD中的DEGs的鉴定

火山图显示：在GSE89632数据集中，通过limma包的分析，从18944个基因中鉴定出810个差异表达基因（DEGs），其中包含452个下调基因和358个上调基因（图1A）。差DEGs聚类的热图显示（图1B）。

2.2 Scu药效团靶点网络的构建

通过PharmMapper数据库预测其药效团靶基因，并利用UniProt注释数据库对这些靶基因进行功能注释，识别出287个Scu的靶基因。通过Cytoscape软件，构建Scu与其靶基因的药效团网络（图2A）。通过将Scu的靶基因与MASLD中的差异表达基因（DEGs）取交集，共识别出12个潜在治疗基因（PT基因）（图2B）。

2.3 GO分析

GO分析结果显示（图3A~C），3组基因（DEGs、Scu靶基因和PT基因）在不同GO类别中的富集存在一定的共同点和差异。在细胞组成类别中，DEGs、Scu靶基因和PT基因主要富集在“胶原蛋白相关的细胞外基质”和“特定颗粒”等结构中。在生物过程类别中，DEGs富集于“炎症反应的调控”，Scu靶基因主要涉及“对细胞因子的应答”，而PT基因则集中于“蛋白水解的负调控”和“胶原降解过程”。在分子功能类别中，DEGs和PT基因分别富集于“免疫受体活性”和“蛋白水解酶活性”，而Scu靶基因的富集项包括“内肽酶活性”和“有机酸结合”。韦恩图显示：在细胞组成、生物过程、分子功能类别中，DEGs和Scu靶基因的共富集项比例分别为24.3%、11%、8.2%（图3D~F）。这些共富集条目集中于炎症反应及细胞外基质重塑、蛋白水解酶调控以及免疫细胞活化与颗粒内容物释放。这提示MASLD相关差异基因与Scu的药效团靶点在慢性炎症放大、肝脏微环境（ECM/纤维化）重塑以及代谢紊乱与免疫失衡耦联等关键病理环节上存在生物学收敛，为Scu干预MASLD提供了共同的分子基础。

2.4 KEGG分析

KEGG分析显示：DEGs主要富集于“TNF信号通路”“IL-17信号通路”“补体与凝血级联”“癌症的转录失调”等通路（图4A）。Scu相关基因主要参与“糖酵解/糖异生”“Ras信号通路”“脂质和动脉粥样硬化”等代谢和信号通路（图4B）。PT基因则与“补体与凝血级联”“AGE-RAGE信号通路”“脂质和动脉粥样硬化”等通路相关（图4C）。韦恩图显示：DEGs与Scu靶基因的KEGG富集分析仅显示13.5%的共同途径（图4D）。

2.5 PPI网络构建及KT基因鉴定

基于PT基因构建PPI网络（图5A），通过cytoHubba插件的MCC算法识别关键节点，形成网络图（图5B）。随后，使用MCODE插件分析PPI网络，鉴定出1个关键模块和4个关键基因。通过这两种方法交叉验证，最终得到4个KT基因，分别为MMP9、MMP7、LCN2和SELE（图5C）。

2.6 Scu与治疗靶点的分子对接验证

分子对接结果显示（表2），各蛋白质的最低自由能分别为：MMP9为-8.8、MMP7为-8.3、LCN2为-8.2、SELE为-7.1。选择自由能最低的分子对接结果进行单独展示（图6）。进一步通过分子模拟验证发现Scu与MMP7和LCN2这两个蛋白能够稳定结合。

2.7 Scu与MMP7的分子模拟验证

蛋白骨架均方根偏差在约 10 ns 后趋于平稳，随后在 0.25 nm 内小幅波动，整个复合物框架在 Scu 结合后保持良好稳定性（图7A）。模拟期间回转半径稳定在 1.46 nm，复合物无显著整体松弛或紧缩（图7B）。溶液可及表面积稳定在92.5 nm²（图7C）。MMP7头部和尾部残基第 165 位、167 位周围残基波动显著大于其它残基（图7D）。氢键配对在0.35 nm分析显示Scu和 MMP7 可以形成氢键相互作用，氢键的平均数量为 4.469（图7E）。自由能形貌图呈现出典型的"漏斗状"分布特征，MMP7-灯盏乙素复合物具有良好的构象稳定性。能量最低区域位于PC1约0.2~0.26、PC2约1.45~1.47的范围内，代表了复合物的最稳定结合构象（图7F）。Scu-MMP7 复合物在分子动力学模拟过程中整体表现为较为稳定的结合状态。

2.8 Scu与LCN2的分子模拟验证

蛋白骨架均方根偏差在约20 ns后趋于平稳，随后在 0.2 nm内小幅波动，整个复合物框架在 Scu 结合后保持良好稳定性（图8A）。模拟期间回转半径稳定在 1.54 nm，复合物无显著整体松弛或紧缩（图8B）。溶液可及表面积稳定在107 nm²（图8C）。LCN2头部和尾部残基第 100 位、103 位周围残基波动显著大于其它残基（图8D）。氢键配对在0.35 nm分析显示Scu和 LCN2 可以形成氢键相互作用，氢键的平均数量为 8.989（图8E）。自由能形貌图显示了多态分布模式。主要稳定构象位于PC1 = 0.09~0.26、PC2 = 1.53~1.56区域，结合口袋的柔性较大，允许配体采用多种结合构象（图8F）。Scu-LCN2 复合物在分子动力学模拟过程中整体表现出较好的结构稳定性。

2.9 Scu与MMP9的分子模拟验证

体系在模拟初始阶段（0~10 ns）蛋白骨架均方根偏移快速由0.10 nm 升高至 0.23~0.25 nm，随后进入较为稳定的平台期， MMP-9 主链在短暂构象松弛后整体趋于平衡，未发生明显的构象崩塌或解折叠（图9A）。模拟期间回转半径稳定在 1.8 nm，复合物无显著整体松弛或紧缩（图9B）。溶液可及表面积稳定在 130~145 nm² 缓慢振荡，在47 ns出现下降趋势，反映出蛋白在与溶剂接触区域存在构象调整（图9C）。MMP9头部和尾部残基第 179位周围残基波动显著大于其它残基（图9D）。氢键配对在0.35 nm分析显示Scu和 MMP9 可以形成氢键相互作用，氢键的平均数量为 4.48（图9E）。自由能形貌图呈现能量最低区域位于PC1约0.2~0.28、PC2约1.79~1.85的范围内，代表了复合物的最稳定结合构象（图9F）。Scu-MMP-9 复合物在模拟时间尺度内存在局部区域的构象波动。

2.10 Scu与SELE的分子模拟验证

蛋白骨架均方根偏差显示，体系在整个轨迹中主要在0.20~0.40 nm波动，未形成特别平坦的“平台期”，整个骨架构象波动幅度略大，其结合构象的收敛性和稳固程度相对较弱（图10A）。模拟期间回转半径总体保持在约 1.78 nm，随时间呈现小幅振荡，复合物整体紧致度小幅度收缩或扩张（图10B）。溶液可及表面积稳定在98 nm²（图10C）。SELE头部和尾部残基第 84 位周围残基波动显著大于其它残基（图10D）。氢键配对在0.35 nm分析显示Scu和 SELE 可以形成氢键相互作用，氢键的平均数量为 4.46（图10E）。自由能形貌图呈现能量最低区域位于PC1约0.2~0.34、PC2约1.76~1.80的范围内，表明体系在模拟过程中主要在一个优势低能构象及其相近亚构象之间转换（图10F）。Scu-SELE 复合物在模拟时间尺度内伴有一定程度的局部波动。

2.11 Scu 对MASLD的疗效

MASLD模型组NAS评分=7分，表明MASLD模型成功建立（表3）。与对照组相比，MASLD模型组大鼠体质量和肝重比水平升高，Scu 治疗后大鼠体质量和肝重比水平降低（P<0.05，图11A）。此外，Scu 能够以剂量依赖的方式抑制高脂高糖诱导的SD大鼠血清中肝功能相关因子： ALT、AST 和 ALP （P<0.05，图 11B）；以及炎症相关因子IL-1、IL-6和TNF-a的水平（P<0.05，图 11C）。并且Scu 能够以剂量依赖的方式抑制高脂高糖诱导的TG、TC、LDL的水平，而增加HDL的水平（P<0.05，图 11D）。Scu 能够以剂量依赖的方式抑制高脂高糖诱导的高血糖、高胰岛素以及胰岛素抵抗（图 11E）。

2.12 Scu对MASLD大鼠肝组织病理改变的影响

HE染色显示：MASLD组大鼠肝细胞核和脂肪空泡数量明显增多，经过Scu处理后，肝脏组织脂肪空泡的数量减少（图 12A）。油红 O 染色显示：和对照组相比。MASLD 模型组大鼠肝脏脂肪变性明显，Scu处理后，脂肪变性情况有所改善（图 12B）。Masson染色显示：和对照组相比。经过Scu处理后，肝脏组织的纤维化程度明显减轻（图 12C）。

2.13 Scu对MASLD大鼠肝组织基因及蛋白表达的影响

选择分子动力学结果最稳定的2个因子MMP7和LCN2做后续的q-PCR和Western blotting检测，结果显示，Scu可上调MASLD模型中MMP7的mRNA和蛋白的表达，以及抑制LCN2的mRNA和蛋白的表达，且高剂量Scu的效果优于辛伐他汀组（P<0.05，图13）。

3 讨论

目前，MASLD尚无FDA批准的特效药物治疗方案^［21］，大多数的治疗手段是基于生活方式的改变，例如饮食控制、体质量管理和增加运动量。生活方式的改变对于很多患者来说难以坚持，特别是肥胖和合并其他代谢综合征的患者。因此，开发有效的药物干预方案对提高患者依从性和改善生活质量具有重要意义。Scu在炎症^［15］和脂质积累^［14］等方面的活性为其成为MASLD治疗的潜在候选药物提供了基础。然而，Scu在MASLD中的具体分子作用机制尚未完全明了。本研究首次通过整合生物信息学和网络药理学方法，系统性分析了Scu在MASLD治疗中的关键靶点和信号通路。

生物信息学分析结果揭示，Scu通过调控多个关键信号通路发挥治疗MASLD的作用。KEGG分析表明，Scu的靶基因主要富集于补体和凝血级联反应、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、及脂质代谢相关通路。Scu可能通过抑制补体激活和凝血级联反应减少肝脏炎症^［22］和纤维化^［23］；抑制IL-17和TNF信号通路发挥抗炎作用^{［24， 15］}；抑制AGE-RAGE信号通路降低氧化应激^［25］和胰岛素抵抗^［26］；调节脂质代谢通路降低血脂水平和肝脏脂肪沉积^［27］。本研究中，Scu治疗显著降低了MASLD大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子水平，同时改善了血脂和胰岛素抵抗，这些效果可能是通过上述多个信号通路协同作用所致。

通过分子对接及后续的分子动力学模拟，我们在共鉴定的候选蛋白中进一步筛选出 MMP7 和 LCN2 作为结合稳定性最高的两个核心靶点。MMP7是一种锌依赖性蛋白水解酶，主要降解细胞外基质（ECM），研究证实MMP7是MASLD肝纤维化的生物标志物，其血清水平与临床显著性纤维化独立相关^［28］。此外，MMP7能够抑制氧化应激诱导的细胞凋亡并促进自噬^［29］。MMP7 通过破坏细胞-基质和细胞-细胞的结构连接、释放 ECM 限制的信号分子、改变细胞迁移/侵袭状态，从而在组织重塑、肿瘤浸润、纤维化甚至血管重构中发挥关键作用^{［30， 31］}。MMP-7 能快速切割组织因子通路抑制物 TFPI，削弱 TFPI 对外源性凝血途径的抑制作用，从而促使组织因子-Ⅶa 通路更易被激活，推动凝血与血栓形成，因此在“炎症-MMP-凝血”轴中扮演促凝调节因子^［32］。在前列腺癌小鼠模型及前列腺癌细胞中，IL-17A 明显诱导 MMP7 表达，并通过 MMP7 介导的上皮-间质转化（EMT）促进肿瘤形成和进展；因此提出了“IL-17-MMP7-EMT”功能轴^［33］。

LCN2是一种脂质运载蛋白，在炎症、氧化应激和脂质代谢中发挥重要作用^［34］。此外，研究也表明，LCN2也能促进肝脏纤维化^［35］，并且LCN2能激活肝星状细胞并促进MASH进展^［36］。在Scu治疗MASLD中，这些基因的显著调节可能对疾病的病理机制产生重要影响。LCN2 其启动子区含有 NF-κB 和 C/EBP 等关键转录因子的结合位点，提示在炎症刺激（如 IL-1β， TNF-α）或代谢应激（如肥胖、脂肪组织炎症）中可以被诱导表达^［37］。在代谢炎症中，LCN2 通过调控脂肪细胞的脂解反应和促炎细胞因子产生，参与塑造“促炎性脂肪–巨噬细胞轴”^［38］。在静脉损伤-血栓模型的蛋白质组学分析中，LCN2 与 TFRC、THBS1 等一起被鉴定为串联铁死亡与凝血/补体级联系统的关键“枢纽”蛋白，提示在血栓形成过程中 LCNC2 的表达与凝血-补体相关通路协同变化^［39］。在脑卒中与脑出血模型中，高表达的 LCN2 促进中性粒细胞浸润、血-脑屏障破坏和微血栓形成，加重脑损伤，进一步支持其与微血管凝血/血栓病理过程有关^［40］。在炎症性肠病患者中，结肠上皮、血清和粪便中的 LCN2 水平与疾病活动度密切相关；体外实验表明，Th17 细胞因子 IL-17A、IL-22 与 TNF-α可协同诱导肠上皮细胞分泌 LCN2，且 IL-23R 基因型会改变这一诱导幅度，进一步将 Th17-IL-23 轴与 LCN2 表达联系起来^［41］。

MMP7 的上游通路有NF‑κB、Wnt/β-catenin，LCN2 的上游通路有NF‑κB。Scu通过NF-κB/NLRP3信号传导抑制BLM诱导的肺纤维化的炎症和EMT^［42］。SCU 抑制 NF-κB 信号、抑制 ROS 生成、减弱炎症介质释放（例如 TNF-α、IL-1β、IL-6），因此 SCU 有可能通过抑制这些上游炎症信号，导致 LCN2 表达下降^［43］。

本研究采用了严格的标准筛选差异基因，并基于PharmMapper数据库预测了Scu的靶基因，这可能导致交集基因较少。此外，MASLD的复杂性和数据集的样本量限制也可能影响基因的表达差异和靶点的识别。因此，交集基因数量较少反映了现有方法和数据集的局限性，未来的研究可以通过扩展样本量和验证更多的靶基因来补充。

前期本研究发现Scu通过抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡和并抑制心肌细胞自噬，改善糖尿病相关的心肌损伤^［44］，此外Scu通过抑制同型半胱氨酸代谢关键酶的变化，改善糖尿病相关的肝脏损伤，以及Scu通过抑制内质网及线粒体中的氧化应激，抑制肝细胞凋亡，进而改善糖尿病相关的肝损伤^［19］。研究还发现GRg1通过调节脂质代谢，改善高脂高糖饮食诱导的MASLD SD大鼠肝损伤^{［45， 46］}。Scu通过调节Pdk4的表达，改善高脂高糖饮食诱导的MASLD^［47］。为进一步验证Scu对MASLD的治疗效果，本研究建立了高脂高糖饮食诱导的MASLD大鼠模型，用Scu对MASLD SD大鼠模型进行干预。结果表明，Scu能够以剂量依赖方式改善MASLD大鼠的多项指标，包括体质量和肝重比、肝功能相关因子（ALT、AST、ALP）、炎症因子（IL-1、IL-6、TNF‑α）和血脂指标（TG、TC、LDL、HDL）。尤其值得一提的是，高剂量Scu的改善效果甚至优于临床常用的他汀类药物辛伐他汀。

病理学观察同样支持这一结论。HE、油红O及Masson染色结果显示，Scu处理明显减少了MASLD大鼠肝细胞核和脂肪空泡数量，改善了肝脏脂肪变性及纤维化状况。目前为止，很少有文献研究MASLD条件下，Scu对MMP7和LCN2两种分子的影响情况。本研究根据生物信息学分析结果，通过q-PCR和Western blotting检测，发现Scu能够以剂量依赖方式上调MMP7表达，同时抑制LCN2表达，进一步验证了Scu通过调控MMP7和LCN2发挥抗MASLD作用的机制。

综上所述，本研究推测Scu可能通过上调MMP7，同时下调LCN2调节脂质代谢并抑制肝脏纤维化，发挥抗MASLD作用。

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