新生大鼠肝脏间充质干细胞的体外培养扩增及其生物学表征

In vitro culture, expansion, and biological characterization of mesenchymal stem cells derived from neonatal rat liver

摘要

目的 采用“组织块联合酶解法”提取新生大鼠肝脏间充质干细胞（L-MSCs），为开展脂肪肝、肝硬化等慢性肝病治疗及肝脏再生医学研究提供理想的种子细胞。 方法 无菌分离1周龄SD新生大鼠肝脏，经漂洗、剪碎、0.1% II型胶原酶/0.05% IV型胶原酶消化15~20 min、100目筛网过滤后，进行L-MSCs原代培养。通过细胞形态学观察、细胞表面标志物CD分子及成脂、成骨诱导分化潜能检测，多维度鉴定所培养的目的细胞。 结果 原代接种培养6~8 d后，短梭形贴壁生长的细胞呈漩涡状铺满皿底。流式细胞仪检测分析第4代细胞表面标志物，高表达CD90（99.33%±0.06%）、CD73（99.60%±0.10%）、CD44（99.50%±0.10%）、CD29（97.60%±0.17%），平均阳性率为（99.01%±0.86%）；低表达CD45（0.87%±0.12%）、CD34（0.95%±0.22%）、CD11b/c（1.71%±0.28%），平均阳性率为（1.18%±0.44%），显著低于前者（P<0.01），符合MSCs的免疫表型特征。诱导成脂、成骨分化实验均为阳性。 结论 “组织块联合酶解法”能够成功提取新生大鼠L-MSCs。

Abstract

Objective To isolate liver-derived mesenchymal stem cells (L-MSCs) from neonatal rats using tissue explant method combined with enzymatic digestion. Methods Liver tissues aseptically harvested from 1-week-old SD rats were rinsed, minced, and digested with D-Hanks solution containing 0.1% type-II collagenase and 0.05% type-IV collagenase for 15-20 min. After filtration through a 100-mesh screen, the cells were cultured for primary L-MSC isolation. The target cells were identified by morphological observation, flow cytometric analysis of surface CD markers, and adipogenic/osteogenic differentiation assays. Results Six to eight days after primary seeding, short spindle-shaped adherent cells formed a confluent monolayer arranged in a swirling pattern. Flow cytometry of passage-4 cells showed high expressions of CD90 [(99.33±0.06)%], CD73 [(99.60±0.10)%], CD44 [(99.50±0.10)%], and CD29 [(97.60±0.17)%] with an average positive rate of (99.01±0.86)% and low expressions of CD45 [(0.87±0.12)%], CD34 [(0.95±0.22)%], and CD11b/c [(1.71±0.28)%] with an average positive rate of (1.18±0.44)%, which was significantly lower than that of CD90, CD73, CD44, and CD29 (P<0.01), consistent with the immunophenotypic characteristics of MSCs. Both adipogenic and osteogenic induction tests of the cells yielded positive results. Conclusion L-MSCs can be successfully isolated from neonatal rat liver using tissue explant method combined with enzymatic digestion.

Graphical abstract

关键词

新生大鼠 / 肝脏间充质干细胞 / 组织块联合酶解法 / 细胞形态 / 细胞免疫标志物 / 三系分化潜能

Key words

newborn rats / liver mesenchymal stem cells / tissue explant-enzymatic digestion combined method / cell mophorlogy / surface markers of mesenchymal stem cells / trilineage differentiation

间充质干细胞（MSCs）是一类具有强大自我更新能力、多向分化潜能、低免疫原性以及旁分泌功能的异质细胞群^［1-4］。研究表明，在肝脏微环境及其血管周围组织中富集一类具有MSCs特性的细胞亚群，即肝脏间充质干细胞（L-MSCs）^［5-8］。相较于骨髓、脂肪、脐带来源的MSCs，L-MSCs表现出了更强的肝向分化倾向性，在脂肪肝、肝硬化等慢性肝病治疗及肝脏再生医学研究中具有显著的独特优势^［9-13］。因此，建立高效的L-MSCs体外分离、纯化及扩增体系，对于深化肝脏再生基础研究，推动临床应用转化，具有双重价值，这亦是肝脏领域研究的关键所在。

2006年Herrera等^［14］在《Stem Cells》首次报道从“成人”肝脏实质中分离出L-MSCs，开启了肝源性MSCs研究之先河。然而，反观国内相关研究，2005年以前仅有零星文献报道原代L-MSCs的分离培养，且其细胞来源均局限于人或啮齿类动物“胚胎”的肝脏组织，未见“幼年期”动物肝脏的应用，这主要归因于胚胎时期的结缔组织中MSCs含量相对较高。但在胚胎获取过程中，常伴随母体死亡，会严重影响实验的可持续性与伦理合规性，限制了其广泛应用^［15-17］。值得注意的是，自2005年之后的近20年间，国内关于L-MSCs的体外原代培养研究几乎处于停滞状态，形成了明显的领域空白，这不仅制约了L-MSCs基础研究的深入，也阻碍了其潜在的临床转化与发展。因此，针对该领域培养方法的系统优化与完善已迫在眉睫。

故鉴于受试动物的“胚胎—成年”两极难以覆盖出生后的早期阶段，而不同发育阶段的动物源性MSCs在增殖、分化及免疫表型上又存在异质性^{［18， 19］}，新生动物的肝脏组织中是否存在L-MSCs仍缺乏直接证据。因此，本研究拟以7日龄SD大鼠肝脏为细胞源，建立L-MSCs体外培养扩增体系，系统解析其多向分化潜能、免疫表型及自我更新能力等生物学表征，旨在填补新生动物L-MSCs研究领域的空白，为肝脏再生医学提供高活性、可重复的优质种子细胞。

1 材料和方法

1.1 实验动物

7日龄雄性SDawley新生大鼠3只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［质量合格证号为SCXK（沪）2022-0004］。实验过程遵守国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》规定，受试动物在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛等痛苦（伦理批号：FJTCM IACUC2024249）。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM培养基、胎牛血清（Gibco），间充质干细胞专用培养基（厦门生物角科技有限公司），Ⅱ型、IV型胶原酶、油红O染色试剂盒（北京鼎国昌盛生物公司），茜素红染色试剂盒（北京索莱宝生物有限公司），间充质干细胞表面标志物检测试剂盒（苏州赛业生物有限公司）。超净工作台（苏州安泰净化设备有限公司），水平多功能离心机（Beckman Coulter），CO₂培养箱（上海力康公司），倒置生物显微镜（Leica），流式细胞仪（Becton Dickinson）。

1.3 新生大鼠L-MSCs的原代培养及扩增

选取7日龄新生大鼠1只，经乙醚麻醉、颈椎脱臼处死后，迅速于超净台中开腹，钝性分离出肝脏，置于预冷的含1%青霉素/链霉素的D-Hanks缓冲液中漂洗3次以去除血污。用眼科剪将肝脏组织剪碎成体积约1 mm³的小块，并将其转移至含0.1%Ⅱ型胶原酶/0.05% IV型胶原酶的D-Hanks消化液中，于37 ℃恒温水浴锅中振摇消化15~20 min。消化结束后，经100目细胞筛网挤压过滤，以去除未消化完全的大组织团块及筋膜等。收集筛网下含消化充分的微细小组织块滤液于15 mL锥底离心管中，经300×g离心5 min后，弃上清，沉淀用低糖型MSCs专用培养基重悬于培养瓶中，并将其置于CO₂培养箱中静置培养。首次换液于接种48 h后进行，此后每隔2~3 d半量更换1次新鲜培养液。待细胞融合度达90%时，进行首次体外传代扩增。上述实验过程重复3次。

1.4 目的细胞形态学观察

于倒置显微镜下持续观察和记录原代培养及传代扩增的细胞形态、分布及融合度等生长情况，并用显微成像系统仪拍照记录。

1.5 细胞表面标志物CD分子检测

选取生长状态良好的第4代细胞，参照苏州赛业生物公司提供的间充质干细胞表面标志物检测试剂盒说明书，制备适宜浓度的单细胞悬液样本后，依次加入针对目标表面标志物的一抗及相应二抗，各自于4 ℃避光孵育30 min，经PBS离心洗涤2次以去除未结合抗体，最后采用流式细胞仪检测与分析细胞表面标志物的表达水平。上述操作重复检测3次，数据以均数±标准差表示。

1.6 细胞成脂/成骨分化潜能检测

选取3皿生长状态良好、融合度达90%的第4代细胞，2皿进行成脂诱导分化，1皿进行成骨诱导分化。将原培养液更换为3 mL相应的成脂或成骨诱导液后，置于培养箱中进行诱导培养，之后每隔3 d半量更换1次诱导液。诱导成脂10 d、20 d后，分别行油红O染色检测脂滴形成；诱导成骨21 d后，行茜素红染色检测钙结节沉积。

1.7 统计学分析

流式细胞仪检测的各组实验数据，采用GraphPad Prism10.0软件统计，数据以均数±标准差表示，并用独立样本t检验进行比较分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代细胞生长情况观察

原代培养3 d，以肝脏组织块为中心，细胞从其周围“出芽式”迁移爬出，单个细胞呈短梭形，形成较小的“细胞团晕”（图1A~C）；4~8 d后，“岛屿状”的细胞团簇逐渐形成，并向组织块周围蔓延，范围扩大，逐渐趋于融合（图1D~F）。

2.2 传代细胞生长情况观察

第1~6代细胞呈短梭形，形态均一，匀质性较好，增殖迅速，倍增时间约为36~48 h；细胞融合后，呈“成纤维样”漩涡状贴壁生长（图2A~F），细胞未出现胞体“蝉翼样”变薄变宽及两极“针尖样”细长拉丝等老化现象。

2.3 细胞表面标志物CD分子检测

流式细胞仪检测与分析第4代细胞表面标志物：细胞高表达CD90（99.33%±0.06%）、CD73（99.60%± 0.10%）、CD44（99.50%±0.10%）、CD29（97.60%± 0.17%），平均阳性率为（99.01%±0.86%）；低表达CD45（0.87%±0.12%）、CD34（0.95%±0.22%）、CD11b/c（1.71%±0.28%），平均阳性率为（1.18%±0.44%），显著低于前者（P<0.01），符合MSCs免疫表型特征。

2.4 第4代细胞诱导成脂分化潜能检测

第4代细胞经成脂诱导分化液培养10 d后，细胞形态由短梭形逐渐变为多边形，胞质内出现呈“戒环样”围绕胞核分布的未成熟脂肪小颗粒（图4A）；经油红O染色后，“戒环样”分布的脂肪小颗粒呈现红色（图4B、C）。经诱导培养20 d后，脂肪小颗粒融合，形成体积较大的成熟单室脂肪滴，并将胞核挤向边缘一侧（图4D）；经油红O染色后，“水泡样”的成熟脂肪滴呈现鲜艳深红色（图4E、F）

2.5 第4代细胞诱导成骨分化潜能检测

第4代细胞经成骨诱导分化液培养21 d后，细胞聚集生长，局部形成散在分布、大小不等的黑色矿化样结晶物（图5A）；经茜素红染色后，“蘑菇样”散落分布在细胞周围的结节状球形颗粒物呈现鲜艳深红色（图5B、C）。

3 讨论

肝脏作为高度异质化的器官，其细胞组分具有显著的复杂性，主要由肝细胞、星状细胞、库普弗细胞、肝窦内皮细胞以及胆管上皮细胞等构成^［20-22］，近年来多种肝源性干细胞群亦相继被发现，包括L-MSCs、肝干细胞、卵圆细胞及肝上皮样祖细胞等^［23-26］。如何从异质化的肝脏组织中实现原代L-MSCs的高效分离与高纯度的体外扩增，已成为慢性肝病研究及其治疗应用的关键与技术挑战。

目前原代MSCs的体外分离培养，主要包括化学酶消化法^{［27， 28］}、密度梯度离心法^{［29， 30］}以及组织块法等^{［31， 32］}。其中，化学酶消化法虽然能高效解离肝实质，快速获得初始细胞悬液，显著缩短操作时间，但往往目的细胞得率不高，纯度偏低；而组织块法虽然能够通过保留微小组织块，使其在培养的初期充当“微器官”，模拟体内微环境的旁分泌信号，促进MSCs迁出，可避免消化酶对细胞活性的损伤，为细胞早期贴壁提供锚定的“位点”，但组织块法培养时间较长，杂细胞较多，且培养瓶长期反复暴露在室外，容易造成微生物污染。

而本研究则在权衡上述两种培养方法各自利弊后，采用混合酶消化法，即0.1% Ⅱ型胶原酶/0.05% IV型胶原酶液联合组织块法的技术策略，以有效平衡传统单一实验方法的局限性。其中用Ⅱ型胶原酶靶向分解细胞间胶原，IV型胶原酶特异性降解基底膜成分，双酶协同，可高效释放肝内间质细胞，减少肝实质细胞的污染，同时避免了因过度消化造成的对L-MSCs膜蛋白的化学损伤而导致的细胞活性下降。后续实验结果也表明所培养的目的细胞迁移出组织块的时间明显早于单纯组织块法，72 h后镜下即可观察到细胞从组织块周围“出芽”“细胞岛屿形成”“细胞集落融合”等连续的生长过程，同时传代细胞的倍增时间亦于48 h内即可进入对数生长期，也提示了这一改良策略尤其适用于血管基质丰富、细胞异质性高的“新生”大鼠肝脏组织。

最后，课题组参照和遵循国际细胞治疗协会（ISCT）制定的MSCs鉴定标准^［33］，从细胞形态、免疫标志物、多向分化潜能3方面对所培养的细胞进行了鉴定。结果显示，细胞形态均一，呈短梭形，贴壁生长，增殖活跃，倍增时间为36~48 h。流式细胞仪检测第4代细胞表面抗原，高表达CD90、CD73、CD44、CD29，阳性率为（99.01%±0.86%）；低表达CD45、CD34、CD11b/c，阳性率为（1.18% ± 0.44%），显著低于前者，符合MSCs的免疫表型特征，且纯度较高，排除了单核巨噬细胞、造血干细胞等杂细胞污染的可能性。最后，第4代细胞经成脂诱导分化液培养10 d、20 d后，油红O染色可见早期及晚期鲜红色脂滴形成；经成骨诱导分化液培养21 d后，茜素红染色可见深红色钙结节沉积。上述结果共同证实待测细胞具备良好的成脂、成骨多向分化潜能。故综合以上3项生物学表征指标，所培养的目的细胞完全符合MSCs鉴定国际标准；同时结合其细胞来源于肝脏组织，可判定为L-MSCs，与文献报道一致^［34］。

综上，针对“新生”动物L-MSCs的体外培养体系研究尚属空白，本实验以7日龄“新生”大鼠为供体，采用“组织块联合酶解法”策略，依循ISCT标准，系统验证了其细胞干性、免疫表型及多向分化潜能，在国内首次成功建立了“新生”大鼠L-MSCs原代培养、体外扩增及多维度鉴定体系，不仅为深入探究肝脏再生机制、揭示脂肪肝及肝硬化等肝病发病机理提供了理想的体外细胞模型，更为干细胞治疗相关疾病的临床前沿转化搭建了高质量的细胞生物学平台。

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