多组学整合揭示结直肠癌中的免疫-代谢异质性：针对ANGPTL4/FABP4/RBP7的预后模型及治疗策略

Multi-omics integration deciphers immune-metabolic heterogeneity in colorectal cancer: a prognostic model and therapeutic strategies targeting ANGPTL4/FABP4/RBP7

摘要

目的 探究结直肠癌肿瘤免疫微环境的异质性，以克服其导致的治疗抵抗，并开发精准预后模型。 方法 整合TCGA（n=568）与GEO（n=568）队列共1136例样本的转录组、体细胞突变及单细胞RNA测序多组学数据；基于单样本基因集富集分析（ssGSEA）和t-SNE算法将TCGA队列分为Immunity_High和Immunity_Low两个免疫亚型；通过单变量Cox回归联合LASSO-Cox回归筛选核心基因并构建预后模型；借助单细胞测序、分子对接、动力学模拟及qPCR/IHC实验验证ANGPTL4、FABP4、RBP7等核心基因的功能。 结果 Immunity_High亚型富集CD8⁺ T细胞且患者生存期显著延长，Immunity_Low亚型则以M0巨噬细胞浸润为主；基于ANGPTL4、FABP4、RBP7等12个基因构建的预后模型预测效能良好，TCGA队列3年生存率AUC达0.765、总体AUC为0.76，GEO队列总体AUC为0.70；机制层面，ANGPTL4调控巨噬细胞极化、FABP4介导成纤维细胞重编程、RBP7可上调PD-L1表达；分子对接与动力学模拟证实维甲酸和罗格列酮可与核心靶点稳定结合，最低结合能达-8.3 kcal/mol。 结论 所构建的预后模型及发现的潜在治疗靶点，为克服免疫治疗耐药提供了新策略。

Abstract

Objective To explore the heterogeneity of tumor immune microenvironment (TIME) in colorectal cancer (CRC) and the resultant treatment resistance and develop a prognostic model for predicting the treatment outcomes of CRC. Methods The multi-omics data including transcriptomic, somatic mutation and single-cell RNA sequencing data of a total of 1136 CRC samples from a TCGA cohort (n=568) and a GEO cohort (n=568) were integrated. The TCGA cohort was divided into Immunity_High and Immunity_Low subtypes by single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) and t-SNE algorithm. A prognostic model was constructed using univariate Cox regression combined with LASSO-Cox regression, and the functions of the core genes including ANGPTL4, FABP4 and RBP7 were verified by single cell RNA-seq, molecular docking, kinetic simulations and qPCR/IHC experiments. Results The Immunity_High subtype of CRC was enriched with CD8⁺ T cells and had significantly longer patient survival, while the Immunity_Low subtype was characterized by M0 macrophage infiltration. The prognostic model constructed based on 12 genes including ANGPTL4, FABP4 and RBP7 showed good predictive performance, with the AUC of 3-year survival rate reaching 0.765, an overall AUC of 0.76 in the TCGA cohort, and an overall AUC of 0.70 in the GEO cohort. Mechanistically, ANGPTL4 regulated macrophage polarization, FABP4 mediated fibroblast reprogramming, and RBP7 up-regulated PD-L1 expression. Molecular docking and kinetic simulations confirmed stable binding of retinoic acid and rosiglitazone to the core targets with the minimum binding energy of -8.3 kcal/mol. Conclusion The constructed prognostic model and the identified potential therapeutic targets provide new strategies to address immune therapy resistance for CRC.

Graphical abstract

关键词

结直肠癌 / 多组学整合 / 免疫代谢异质性 / 预后模型 / ANGPTL4/FABP4/RBP7

Key words

colorectal cancer / multi-omics integration / immune-metabolic heterogeneity / prognostic model / ANGPTL4/FABP4/RBP7

结直肠癌（CRC）是全球范围内重大公共卫生问题，每年新发病例约190万例，死亡约93.5万例。尽管诊疗手段不断进步，晚期结直肠癌患者的5年生存率仍较低（<15%），其主要原因包括肿瘤异质性、免疫逃逸机制以及化疗耐药等^［1］。肿瘤免疫微环境（TIME）作为影响患者预后和治疗反应的关键因素日益受到关注。研究表明，细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润与生存期延长相关，而M2型巨噬细胞、调节性T细胞等免疫抑制性细胞则促进肿瘤转移和治疗抵抗^［2］。然而，现有临床分期系统难以全面反映肿瘤免疫状态的复杂性，因此亟需挖掘可靠的生物标志物，实现基于分子特征的精准患者分型^［3］。

近年来，多组学研究逐步揭示结直肠癌中基因组不稳定性、免疫失调与基质重塑之间存在复杂交互作用^［4］。肿瘤突变负荷可作为免疫检查点抑制剂疗效的预测指标，但该方法未能充分考虑由人类白细胞抗原丢失所导致的抗原呈递缺陷^［5］。此外，尽管转录组水平的免疫激活或抑制信号具有预后提示价值，但其往往忽略了单细胞RNA测序所揭示的细胞类型特异性表达模式。与此同时，脂肪酸代谢相关基因如ANGPTL4、FABP4等虽被报道与结直肠癌进展相关，但其在调控TIME和影响药物敏感性方面的机制仍有待系统阐释。

因此，本研究整合TCGA与GEO数据库共1136例结直肠癌样本的多组学数据，通过免疫分型、预后模型构建筛选出核心靶点ANGPTL4、FABP4、RBP7，并结合多维度实验与计算模拟验证其功能及潜在治疗价值。本研究旨在搭建结直肠癌免疫基因组学分析与临床转化之间的桥梁，为疾病风险分层与精准治疗提供新策略。

1 材料和方法

1.1 细胞系与细胞培养

本研究采用的人结直肠癌细胞系（EIHC、DLD1、HCT116、SW480、SW620）均购自美国典型培养物保藏中心，并经过国际细胞系鉴定委员会认证。所有细胞均在37 ℃、5% CO₂的Thermo Fisher Scientific培养箱中，采用补充了10%胎牛血清（FBS，Gibco）的DMEM培养基（Gibco）进行常规培养。

1.2 数据获取

结直肠癌的转录组数据、临床信息及体细胞突变数据均从TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov）^［6］下载，数据项目标识为“TCGA-COAD”和“TCGA-READ”。用于外部验证的数据集GSE39582（包含568例结直肠癌样本）源自GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）^［7］。免疫相关基因集由免疫学数据库和分析门户（https：//www.immport.org/）^［8］提供。肿瘤突变负荷（TMB）的计算方法为：使用Perl脚本统计每兆碱基的非同义突变数量（mut/Mb）。

1.3 免疫亚型鉴定与验证

基于TCGA队列（n=568）的基因表达数据，我们利用R语言的GSVA、limma和GSEABase包进行ssGSEA，以量化28种免疫细胞类型的相对富集分数。随后，采用层次聚类算法（Sparcl包）并结合t-分布随机邻域嵌入（t-SNE，Rtsne包）进行降维可视化，将样本划分为高免疫浸润组（红色）和低免疫浸润组（蓝色）。

1.4 HLA基因差异分析与免疫细胞浸润评估

采用ggplot2和ggpubr包分析并绘制箱线图，比较不同免疫亚组间人类白细胞抗原（HLA）基因的表达差异（红色：高免疫组，蓝色：低免疫组）。同时，利用CIBERSORT算法反卷积TCGA样本的转录组数据，估算22种免疫细胞亚型的相对比例。通过Wilcoxon秩和检验（p<0.05）评估组间免疫细胞丰度的显著性差异。

1.5 免疫相关差异表达基因的筛选与共表达分析

应用limma包识别免疫亚组间的差异表达基因（DEGs），筛选标准为|log2折叠变化 （FC）|≥1且错误发现率（FDR）<0.01，结果通过火山图（ggplot2包）可视化。进一步，利用VennDiagram包取DEGs与ImmPort免疫基因集的交集。对交集基因的表达水平进行Z-score标准化，并通过热图（pheatmap包）展示其在高、低免疫组中的共表达模式（红色/蓝色分别表示高/低表达）。

1.6 预后基因筛选与风险模型构建

首先，使用sva包对TCGA（训练集）和GEO（验证集）的基因表达数据进行批次校正和标准化^［9］。从Cistrome数据库（http：//www.cistrome.org/）^［10］获取肿瘤相关转录因子（TF）信息，并通过Spearman相关分析（|相关系数|>0.4，FDR<0.001）筛选与预后基因显著相关的TF。利用ggalluvial和ggplot2包绘制Sankey图，可视化TF-基因调控网络。同时，借助STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）^［11］构建预后基因的蛋白质-蛋白质互作网络。

在TCGA训练集中，通过单变量Cox比例风险回归分析（P<0.05）初步筛选与生存相关的基因，并与GEO数据集中的表达基因取交集。对交集基因进行Lasso回归分析（glmnet包，10折交叉验证），根据最小化部分似然偏差的原则确定最优预后基因组合及其系数。风险评分计算公式为：风险评分=Σ（基因i的表达量×其对应系数）。最后，依据训练集中位风险评分，将TCGA和GEO队列的患者分别划分为高风险组（红色）和低风险组（蓝色）。

1.7 基于风险评分的生存分析

在训练集（TCGA，n=568）和验证集（GEO，n=568）中，分别对高、低风险组患者进行生存分析。采用survival包构建Cox比例风险模型，并通过survminer包绘制Kaplan-Meier生存曲线，使用Log-rank检验评估组间生存差异的显著性。利用reshape2和ggpubr/ggExtra包绘制风险评分分布、患者生存状态（红色：死亡，蓝色：存活）及生存时间的关系散点图。采用Spearman相关分析检验风险评分与总生存期（OS）的相关性。

1.8 独立预后因素分析

为评估风险评分的独立预后价值，分别进行单变量和多变量Cox回归分析。纳入的临床变量包括年龄、性别、TNM分期以及风险评分。在结果展示中，单变量分析结果以绿色框标示，多变量分析结果以红色框标示。

1.9 预后列线图构建与评估

整合临床病理特征与风险评分，利用Cox回归分析结果构建预测患者1、3、5年生存率的列线图。通过受试者工作特征曲线（ROC）评估模型的预测效能，监测1年，3年和5年预测的曲线下面积（AUC）。与共识分子分型（CMS）的预测效能（AUC=0.68）相比。图中1年、3年、5年生存率分别用绿色、紫色和红色标示。

1.10 核心靶点的生存分析（OS/DFS/PFS）

针对筛选出的核心基因，利用Kaplan-Meier曲线（survminer包）分别评估其表达水平与患者OS、无病生存期（DFS）和无进展生存期（PFS）的关联。采用Log-rank检验计算p值，并通过单变量Cox回归分析得到风险比（HR）及其95%置信区间（CI）。

1.11 免疫细胞相关性及TMB生存分析

通过tidyverse和ggplot2包绘制热图，展示风险模型核心基因与22种免疫细胞浸润水平的相关性。颜色梯度表示正（红色）负（蓝色）相关，显著性水平以星号标记。此外，采用survminer包中的surv_cutpoint函数确定TMB的最佳截断值，将患者分为高、低TMB组，并利用ggsurvplot绘制生存曲线，以分析TMB与预后的关系。

1.12 单细胞转录组数据分析

从GEO数据库下载结直肠癌单细胞RNA测序数据集GSE146771，并使用Seurat和MAESTRO包进行流程化分析。数据质控标准为：线粒体基因占比<20%，每个细胞检测到的基因数>200。对合格细胞进行标准化并筛选高变基因。采用主成分分析（PCA，前50个主成分）进行降维，再基于t-SNE算法（困惑度=30，分辨率=0.8）进行细胞聚类。通过t-SNE图展示细胞亚群分布及核心基因的表达水平［以log2（TPM+1）转换后的值表示］。

1.13 药物预测和分子对接

基于核心基因，利用COREmine医学数据库（https：//www.coremine.com/）预测潜在靶向药物，并结合文献检索进一步筛选候选化合物。从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取小分子配体的二维结构，通过Chem Office 20.0软件转化为三维结构并保存为.mol2格式。从RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载核心靶蛋白的晶体结构（分辨率≤2.5 Å），使用PyMOL 2.5.2软件去除水分子及无关配体进行预处理。利用AutoDockTools 1.5.6软件为蛋白质和配体加氢、计算电荷及设定可旋转键。以蛋白活性位点为中心设置对接网格（尺寸20×20×20 ų，网格间距1.0 Å），采用AutoDock Vina 1.5.6进行半柔性分子对接。最终，使用PyMOL和Discovery Studio 2019软件可视化分析蛋白-配体复合物的相互作用（如氢键、疏水作用、π-π堆积等）。

1.14 分子动力学模拟

采用Gromacs 2022软件进行分子动力学模拟。蛋白质与配体分别使用CHARMM36力场和GAFF2力场。将复合物置于TIP3P水盒子中（边界距离1.2 nm），并添加0.15 mol/L NaCl以中和体系电荷。模拟步骤包括：能量最小化（5000步最陡下降法）、NVT与NPT系综平衡（各100 ps，温度310 K，压力1 bar），最后进行100 ns的生产模拟（步长2 fs）。模拟轨迹分析主要包括均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）以及基于MM-PBSA方法的结合自由能计算。

1.15 药物敏感性分析

利用癌症药物敏感性基因组学（GDSC）数据库的GDSC2_Expr数据集（包含1001个癌细胞系的RNA-seq数据及药物IC₅₀值）。对结直肠癌细胞系的表达数据进行标准化和批次校正（limma包）后，根据核心基因的中位表达量将细胞系分为高、低表达组。采用oncoPredict包的岭回归模型预测各组对药物的IC50值，并通过并行计算加速。使用limma包的校正t检验比较组间IC50差异，FDR<0.05视为显著。结果以箱线图展示（绿色：低表达组，红色：高表达组）。

1.16 蛋白表达水平验证

从人类蛋白质图谱（HPA）（https：//www.proteinatlas.org/）获取核心基因在结直肠癌组织中的免疫组化（IHC）数据，并分析其蛋白表达水平与患者临床分期之间的相关性。

1.17 实时定量PCR（qRT-PCR）

RNA分离试剂盒（Vazyme）从癌细胞中提取总RNA。提取的RNA质量通过NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific）评估，其完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳进行验证。用于cDNA合成使用1μg RNA，使用Hiscipt III RT SuperMix（Vazyme）。在Bio-Rad CFX96系统上使用ChamQ SYBR Master Mix（Vazyme）和表1中列出的生工生物工程（上海）有限公司合成的引物进行qPCR扩增。相对表达量（2^-ΔΔCt）使用单因素方差分析和Tukey检验分析（P<0.05）。

1.18 统计学分析

本研究所有生物信息学分析均使用R（4.2.0版本）和Perl语言完成。生存差异比较采用Log-rank检验。相关性分析采用Spearman秩相关检验。不同亚组间免疫评分及ESTIMATE评分的比较采用Wilcoxon秩和检验。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验。P<0.05认为差异具有统计学意义，研究设计流程图（图1）。

2 结果

2.1 结直肠癌免疫浸润的多维特征

基于TCGA队列中的568例结直肠癌样本，采用ssGSEA将其划分为高免疫浸润（Immunity_H，n=403）和低免疫浸润（Immunity_L，n=165）两个亚组。图2A的热图结果显示，免疫相关基因呈现明显聚类模式：Immunity_H亚组中免疫激活标志物表达上调，而Immunity_L亚组中则富集了免疫抑制相关基因。t-SNE降维分析（图2B）进一步证实了两个亚组在空间分布上的分离现象。图2C的相关矩阵图中，高免疫与低免疫亚组分别以红色和蓝色标注，展现出明显的亚型特异性聚类趋势，同时标注了肿瘤纯度和免疫评分。如图2D所示，Immunity_H亚组的基质评分、免疫评分及ESTIMATE评分均显著高于Immunity_L亚组（P<0.001）。Immunity_H亚组中包括HLA-A、HLA-C、HLA-E、HLA-DRB1在内的24个HLA基因表达全面上调（P<0.05，图2E）。Immunity_H亚组以细胞毒性T细胞（CD8⁺ T细胞）和促炎性群体（如活化的NK细胞、M1型巨噬细胞）为主，而Immunity_L亚组则富集了免疫抑制性群体（如M0型巨噬细胞、静息NK细胞）（P<0.05，图2F）。

2.2 结直肠癌免疫景观与预后调控网络解析

差异表达分析结果显示免疫高/低浸润亚型间的1315个DEGs，其中856个基因显著上调（红色），459个基因显著下调（绿色）（图3A）。基于这些DEGs的表达模式，568例样本被明确划分为免疫高浸润（红色）和低浸润（蓝色）两个亚组（图3B）。差异表达基因与ImmPort免疫基因库的交集包含356个免疫相关基因（图3D）。这些基因在免疫高浸润组中主要富集于免疫激活相关通路，而在低浸润组中则表现为免疫抑制特征（图3C）。通过单因素Cox回归分析，筛选出14个与预后显著相关的基因（图3E），其中CCL22（HR=0.694）和NOS2（HR=0.855）为保护性基因，而ANGPTL4（HR=1.311）、FABP4（HR=1.173）和RBP7（HR=1.372）等为高风险基因。

基于Cistrome数据库构建了转录因子-基因调控网络，图3F呈现出该网络中预后相关基因与对应转录因子之间的调控关联；通过STRING数据库进行蛋白质互作网络分析，图3G展示了核心基因之间形成的相互作用关系。

通过LASSO回归分析（图3H~I），最终确定了12个最具预测价值的预后基因，并建立风险评分模型：风险评分=（-0.5818×CCL22）+（-0.0882×NOS2）+（0.0379×TGFB3）+（0.0866×APOD）+（0.3229×ANGPTL4）+（0.1953×CHGB）+（0.1294×CX3CL1）+（0.0135×FABP4）+（0.2739×APOBEC3F）+（0.2540×LCN12）+（0.0814×BST2）+（0.0202×RBP7）。

2.3 结直肠癌风险分层模型的双队列生存验证分析

生存分析显示，基于TCGA队列的Kaplan-Meier曲线清晰显示，低风险组（蓝色曲线）患者的总生存时间显著优于高风险组（红色曲线），两组间差异具有统计学意义（P<0.001，图4A）。这一发现在GEO验证队列中得到了进一步证实，低风险组同样表现出显著的生存优势（图4B）。

风险评分的分布特征分析显示，TCGA队列中高风险评分主要集中于2~12，而低风险评分则分布于0~2内（图4C）。GEO队列的评分分布趋势与TCGA队列高度一致（图4D）。通过绘制患者生存状态散点图可以直观观察到，TCGA队列中死亡事件（红色圆点）明显集中于高风险亚组（图4E）。GEO队列的生存状态分布呈现出相同趋势，死亡信号在高风险区域显著聚集（图4F）。Spearman秩相关分析显示TCGA队列数据显示，风险评分与患者总生存时间呈负相关，（P=0.00064，R=-0.15图4G）。在GEO验证队列中同样观察到负相关趋势，（P=0.082，R=-0.11图4H）。

2.4 结直肠癌临床变量与生存结局的预后价值分析

单因素与多因素Cox回归分析结果显示（图5A、B），年龄（单因素Cox回归P<0.001，HR=1.037，95% CI=1.018~1.056）、肿瘤分期（P<0.001，HR=2.052，95% CI=1.645~2.561）以及本研究构建的风险评分（P<0.001，HR=3.074，95% CI=2.277~4.150）均为总生存期、无病生存期和无进展生存期的独立预后因素，而性别与预后未呈现显著相关性（P=0.795）。

在基因层面，针对12个候选基因的生存分析进一步识别出ANGPTL4、FABP4和RBP7作为在多项临床终点中均表现一致的稳健预测指标。具体而言，图5C显示ANGPTL4高表达与较差的总生存期（P<0.001）、无病生存期（P=0.002）及无进展生存期（P=0.008）显著相关；图5D表明FABP4表达升高与总生存期（P<0.001）、无病生存期（P=0.003）和无进展生存期（P=0.006）缩短有关；图5E则提示RBP7水平上升预示着更差的总生存期（P<0.001）、无病生存期（P=0.004）与无进展生存期（P=0.005）。

2.5 结直肠癌免疫基因网络与预后分层研究

ANGPTL4、FABP4和RBP7三个核心基因与特定免疫细胞亚群的浸润水平呈现显著相关性（图6A）。ANGPTL4表达水平与细胞毒性T细胞（CD8⁺ T细胞，P<0.001）和记忆性CD4⁺ T细胞（P<0.001）呈正相关，而与M1型巨噬细胞浸润呈负相关（P<0.05）；FABP4主要与中性粒细胞浸润（P<0.001）及调节性T细胞的抑制状态（P<0.05）相关；RBP7则与活化NK细胞（P<0.001）和记忆性B细胞（P<0.01）的浸润水平显著相关。

在基因组稳定性方面，基于TMB水平的生存分析显示（图6B），高TMB组患者的总生存期显著差于低TMB组（P=0.025）。进一步将TMB与风险评分模型进行整合分析发现（图6C），不同风险组合患者的生存结局存在显著差异（P<0.001）。其中，高TMB/低风险组患者表现出最佳的生存预后，而高TMB/高风险组患者预后最差，5年总生存率仅为25%。

2.6 结直肠癌预后相关基因的单细胞表达谱特征分析

通过t-SNE可视化分析，图7左图展示细胞谱系分布，图7中图以颜色梯度显示基因表达水平（红色表示高表达，蓝色表示低表达），图7右图以柱状图定量展示各细胞类型中的表达量。ANGPTL4（图7A）主要在肠上皮细胞（TPM=3.2）和上皮细胞（TPM=2.8）中高表达，而在成纤维细胞中几乎不表达（TPM=0.5）。FABP4（图7B）特异性高表达于肌成纤维细胞（TPM=3.0）和内皮细胞（TPM=2.5），在T细胞中未见表达。RBP7（图7C）在恶性上皮细胞（TPM=2.7）和单核来源的巨噬细胞（TPM=1.8）中显著高表达，而在浆细胞中表达水平极低。

2.7 结直肠癌靶向药物筛选及结合稳定性分析

基于转录组分析鉴定的3个核心基因（ANGPTL4、FABP4、RBP7），本研究通过COREmine医学数据库预测靶向上述基因的潜在药物。结合文献筛选，确定维甲酸（视黄醛类似物）和罗格列酮（PPAR-γ激动剂）作为候选抗肿瘤药物。分子对接结果（图8A）显示，上述药物与靶蛋白均具有显著结合活性，其结合能分别为：ANGPTL4-罗格列酮（-6.4 kcal/mol）、ANGPTL4-维甲酸（-8.1 kcal/mol）、FABP4-罗格列酮（-8.2 kcal/mol）、FABP4-维甲酸（-7.2 kcal/mol）、RBP7-罗格列酮（-8.1 kcal/mol）及RBP7-维甲酸（-8.3 kcal/mol）。在动力学稳定性方面，RMSD轨迹（图8B）表明，所有复合物体系在5~80 ns内达到平衡状态，波动幅度始终低于3Å，提示复合物结构具有优良的稳定性。回转半径（Rg）分析（图8C）显示其数值稳定在16~18Å范围内，波动极小，表明复合物结构紧凑性得以保持。溶剂可及表面积（SASA）变化曲线（图8D）显示其数值维持在4000~8000 Ų区间，反映溶剂可及性状态稳定。氢键动态分析（图8E）显示在100 ns模拟过程中，复合物间保持稳定的氢键相互作用（0~6个）。结合口袋区域的RMSF分析显示，该区域柔性较低（<3Å）（图8F）。

2.8 结直肠癌基因表达指导的药物敏感性分析

药物敏感性分析结果显示，ANGPTL4、FABP4和RBP7表达水平与特定化疗药物的疗效存在显著相关性。在ANGPTL4低表达肿瘤中，患者对顺铂（P=3.6e-08，图9A）、表柔比星（P=3.4e-08，图9B）、米托蒽醌（P=5.2e-09，图9C）、尼拉帕利（P=4.0e-10，图9D）和奥拉帕利（P=6.4e-12，图9E）的敏感性显著增强。FABP4表达水平与药物敏感性的关联分析表明，低表达肿瘤对达沙替尼的反应更佳（P=1e-10，图9F），而高表达肿瘤则对拉帕替尼的敏感性更高（P=1.6e-08，图9G）。对于RBP7基因，低表达与达沙替尼疗效正相关（P=4.2e-09，图9H），而高表达增强了对司美替尼（P=4.4e-12，图9I）和曲美替尼（P=4.5e-09，图9J）的敏感性。

2.9 多模态预后分层与分子特征分析在结直肠癌中的综合研究

风险评分分布（图10A）显示，女性患者的风险评分显著高于男性（均值分别为75 vs 65，P=0.002），且IV期肿瘤患者的评分明显高于I期患者（85 vs 50，P=1.2×10⁻⁵）。在模型预测性能方面，ROC曲线分析（图10B）显示该模型具有良好的预测准确性，其中3年生存率的曲线下面积为0.765，5年生存率的AUC为0.718（均大于0.7）。校准曲线（图10C）显示模型预测1年、3年和5年生存率与实际观察值高度一致，各时间点的校准曲线均接近理想参考线。

免疫组化染色结果（图10D~F）显示，与正常组织相比，ANGPTL4、FABP4和RBP7在肿瘤组织中的蛋白表达均显著上调。此外，mRNA表达分析（图10G~I）进一步证实，与正常肠上皮细胞EIHC比较，ANGPTL4和FABP4在结直肠癌细胞系（DLD1、HCT116、SW480）中均呈现显著高表达（P<0.001），RBP7在DLD1、HCT116和SW480细胞系中也表现出明显上调（P<0.001）。

3 讨论

本研究基于多中心结直肠癌样本，采用基因集富集分析及降维技术对肿瘤免疫异质性进行了系统分析。免疫高浸润亚型表现出显著的免疫细胞浸润特征，包括CD8⁺ T细胞、活化NK细胞的富集以及HLA基因的上调，且该亚型与患者较长的生存期相关。相反，免疫低浸润亚型则呈现免疫抑制性微环境特点，以M0型巨噬细胞增多及基质活化标志物表达为特征。基于机器学习构建的预后模型，整合了核心基因表达信息，在独立验证队列中显示出中等预测性能（TCGA队列AUC=0.76；GEO队列AUC=0.70），其判别能力略优于共识分子分型（CMS，AUC=0.68），为CRC预后分层提供了更具潜力的替代工具^［12］。该模型为CRC患者的精准分层提供了新思路。

核心基因（ANGPTL4、FABP4和RBP7）在肿瘤微环境中的多维调控机制，为理解不同免疫亚型的特征及预后模型的效能提供了生物学基础。将ANGPTL4、FABP4和RBP7确定为核心基因主要依据以下3点：特征重要性分析显示，三者累计预测贡献度达68%，显著高于单个非核心基因（<12%）；生存分析证实它们对总生存期、无病生存期和无进展生存期均具有预测价值，而非核心基因仅与OS相关；单细胞测序分析提示它们参与CRC的核心病理过程，如上皮-巨噬细胞相互作用、基质代谢重编程、免疫逃逸，而非核心基因主要参与辅助性过程（如脂质转运）。既往研究强调ANGPTL4可通过促进上皮-间质转化（EMT）和癌细胞侵袭性来驱动肿瘤血管生成与转移^［13］。本研究的新的发现在于，提示ANGPTL4可能通过上皮细胞来源的外泌体miRNA调控巨噬细胞向M2表型极化，从而诱导抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的产生，拓展了其在免疫微环境调节中的已知功能^［14］。当然，这一调控轴尚需通过外泌体分离实验或共培养体系中的miR-21敲低实验进一步验证。

FABP4是脂质代谢的关键调节因子，以往研究多关注其在内皮细胞和脂肪细胞中促进血管通透性和脂肪酸转运的作用^［15］。本研究指出，癌症相关成纤维细胞中的FABP4可能通过激活PPARγ/CPT1A轴促进脂肪酸氧化，导致乳酸和酮体积累，进而抑制CD8⁺ T细胞功能，从而在代谢重编程与免疫抑制之间建立了联系^［16］。

值得注意的是，视黄醇结合蛋白7作为视黄酸信号的关键载体^［17］，传统上认为其通过RA受体介导细胞分化^［18］。本研究首次提出假设：RBP7可能通过促进RA-RARα复合物与PD-L1启动子结合，从而上调PD-L1转录。该假设目前主要基于分子对接预测，尚缺乏染色质免疫共沉淀或启动子报告基因实验等直接证据支持；而敲低RBP7可逆转PD-L1介导的免疫检查点活性这一结论引自文献^［19］，非本研究原始数据。这些发现不仅揭示了代谢-免疫交互作用的新层面，也为克服免疫治疗耐药提供了新的潜在策略。

12基因预后模型中的非核心基因并非冗余，它们共同刻画了CRC免疫-代谢微环境的复杂性：CCL22（HR=0.694）可招募调节性T细胞，抑制CD8⁺ T细胞活性，参与维持免疫抑制状态^［20］；NOS2（HR=0.855）通过产生一氧化氮抑制T细胞增殖，与RBP7可能介导的PD-L1免疫逃逸机制形成互补^［21］；APOD促进脂质转运以支持肿瘤能量代谢，与FABP4调控的脂肪酸氧化过程协同^［22］；TGFB3、CHGB、CX3CL1、APOBEC3F、LCN12和BST2则分别参与基质活化、神经内分泌信号及抗病毒反应等过程，填补了核心基因调控网络的空白^［23-27］。剔除任一非核心基因均导致模型预测效能下降，TCGA队列AUC降低5%~8%，GEO队列降低4%~7%，证实它们对全面预后预测的必要性。

功能分析进一步揭示了核心基因在肿瘤微环境中的多维调控机制。单细胞测序显示，上皮细胞中的ANGPTL4可能通过外泌体途径调节巨噬细胞功能，促进抗炎因子分泌^［18］；CAFs中的FABP4驱动代谢重编程，从而促进肿瘤进展；而RBP7则可能经视黄酸信号通路调节PD-L1表达，表明其在免疫逃逸中的关键作用。分子对接与动力学模拟筛选出潜在治疗候选化合物，并在临床前研究中显示联合疗法可增强抗肿瘤效果及免疫浸润^［28］。通过人类蛋白质图谱和qPCR验证，进一步确认了核心基因的表达一致性及临床相关性，为转化研究奠定了基础。

在现有免疫分型框架上，本研究创新性地整合HLA表达数据与单细胞分析，提出——抗原呈递-基质共抑制假说^［29］。与传统方法仅关注细胞数量不同，我们通过解码基因调控网络，揭示了HLA缺陷与基质活化之间的协同作用。在Immunity_Low亚型中，HLA下调与M0巨噬细胞浸润共存，可能通过特定信号通路导致T细胞耗竭，这一机制此前未被充分重视。

相较于以免疫细胞为中心的评分模型，本研究通过整合免疫代谢基因，显著提升了预后模型的临床实用性。尽管既往研究部分揭示了ANGPTL4与FABP4的功能，但二者在CRC中介导的免疫-代谢交叉对话仍属新发现。例如，ANGPTL4通过外泌体miRNA调控巨噬细胞极化的作用尚未见报道，FABP4在成纤维细胞中介导的脂代谢相关免疫抑制也是一个创新发现。尤为重要的是，我们首次提出RBP7可能通过视黄酸信号上调PD-L1，为微卫星稳定型CRC的免疫治疗耐药提供了新解释^［30］，拓展了视黄酸信号在免疫调节中的双重角色。

在药物发现方面，本研究通过分子动力学模拟克服了静态对接的局限^［31］，首次预测维甲酸与RBP7的稳定结合及其逆转PD-L1上调的潜力。联合用药策略（如维甲酸与PD-1抑制剂联用）在临床前模型中显示出显著的肿瘤抑制效果，为克服免疫检查点抑制剂耐药提供了新思路。与单靶点治疗相比，本研究提出的多维度干预策略有望更有效应对肿瘤异质性挑战。

本研究存在若干局限性。公共数据集中治疗信息记录不完整，核心基因的作用机制尚缺乏实验验证，缺乏外泌体分离/miR-21敲低实验验证ANGPTL4→外泌体miR-21→巨噬细胞极化轴，缺乏ChIP-seq/启动子报告基因实验验证RBP7对PD-L1的调控。此外，对相关药物维甲酸在肿瘤微环境中的长期药代动力学影响研究不足。目前对ANGPTL4、FABP4和RBP7的实验验证仅局限于mRNA/蛋白表达水平（组织与细胞系的IHC/qPCR），证实了它们在CRC中的差异表达，但尚未验证其是否参与免疫调节或代谢重编程等功能。本研究药物敏感性分析存在两方面不足：一是预测结果尚未在患者来源类器官/原代细胞中得到验证；二是GDSC2预测的IC₅₀与CRC细胞系中实测IC₅₀之间的相关性未经验证。今后需通过相关实验进一步完善上述内容，以提升结论的可靠性^{［32， 33］}。后续工作将纳入前瞻性多中心队列以提高数据代表性，结合基因编辑模型与空间组学技术解析基因的时空动态功能，并利用类器官平台与代谢组学优化治疗策略。

未来研究将重点围绕以下几方面展开，首先深入阐释RBP7介导的PD-L1甲基化与肿瘤突变负荷的交互作用，以及ANGPTL4外泌体与肿瘤相关巨噬细胞的相互作用；其次研发RBP7抑制剂与FABP4中和抗体，开展基于ANGPTL4分层的II期临床试验，评估维甲酸、FABP4抑制剂与PD-1抑制剂联合疗法的疗效；利用空间代谢组学技术解析肿瘤侵袭前沿的代谢-免疫交叉调控网络^［34］。针对RBP7（免疫逃逸）、FABP4（代谢抑制）和ANGPTL4（基质重编程）的多基因联合策略，将推动CRC个体化免疫治疗的发展。

参考文献

[1] Morgan E, Arnold M, Gini A, et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN[J]. Gut, 2023, 72(2): 338-44. doi：10.1136/gutjnl-2022-327736

[2] Wang C, Zeng Q, Gül ZM, et al. Circadian tumor infiltration and function of CD8⁺ T cells dictate immunotherapy efficacy[J]. Cell, 2024, 187(11): 2690-702. doi：10.1016/j.cell.2024.04.015

[3] Williams HL, Frei AL, Koessler T, et al. The current landscape of spatial biomarkers for prediction of response to immune checkpoint inhibition[J]. NPJ Precis Oncol, 2024, 8(1): 178. doi：10.1038/s41698-024-00671-1

[4] Ma Y, Li J, Zhao X, et al. Multi-omics cluster defines the subtypes of CRC with distinct prognosis and tumor microenvironment[J]. Eur J Med Res, 2024, 29: 207. doi：10.1186/s40001-024-01805-8

[5] Chowell D, Morris LGT, Grigg CM, et al. Patient HLA class I genotype influences cancer response to checkpoint blockade immunotherapy[J]. Science, 2018, 359(6375): 582-7. doi：10.1126/science.aao4572

[6] Hutter C, Zenklusen JC. The cancer genome atlas: creating lasting value beyond its data[J]. Cell, 2018, 173(2): 283-5. doi：10.1016/j.cell.2018.03.042

[7] Clough E, Barrett T, Wilhite SE, et al. NCBI GEO archive for gene expression and epigenomics data sets: 23-year update[J]. Nucleic Acids Res, 2024, 52(D1): D138-44. doi：10.1093/nar/gkad965

[8] Bhattacharya S, Dunn P, Thomas CG, et al. ImmPort, toward repurposing of open access immunological assay data for translational and clinical research[J]. Sci Data, 2018, 5: 180015. doi：10.1038/sdata.2018.15

[9] Petrella BL, Armstrong DA, Vincenti MP. Interleukin-1 beta and transforming growth factor-beta 3 cooperate to activate matrix metalloproteinase expression and invasiveness in A549 lung adenocarcinoma cells[J]. Cancer Lett, 2012, 325(2): 220-6. doi：10.1016/j.canlet.2012.07.009

[10] Taing L, Dandawate A, L' Yi S, et al. Cistrome Data Browser: integrated search, analysis and visualization of chromatin data[J]. Nucleic Acids Res, 2024, 52(D1): D61-6. doi：10.1093/nar/gkad1069

[11] Szklarczyk D, Nastou K, Koutrouli M, et al. The STRING database in 2025: protein networks with directionality of regulation[J]. Nucleic Acids Res, 2025, 53(D1): D730-7. doi：10.1093/nar/gkae1113

[12] Liu XH, Zhang WY, Zhang Q, et al. Development and validation of a machine learning-augmented algorithm for diabetes screening in community and primary care settings: a population-based study[J]. Front Endocrinol, 2022, 13: 1043919. doi：10.3389/fendo.2022.1043919

[13] Wu XH, Lin K, Gao C, et al. miR-627-5p inhibits malignant progression of cervical cancer by targeting ANGPTL4[J]. Eur J Histochem, 2025, 69(2): 4161. doi：10.4081/ejh.2025.4161

[14] Zuo YY, He Z, Chen Y, et al. Dual role of ANGPTL4 in inflammation[J]. Inflamm Res, 2023, 72(6): 1303-13. doi：10.1007/s00011-023-01753-9

[15] Harjes U, Bridges E, Gharpure KM, et al. Antiangiogenic and tumour inhibitory effects of downregulating tumour endothelial FABP4[J]. Oncogene, 2017, 36(7): 912-21. doi：10.1038/onc.2016.256

[16] Yang J, Liu XJ, Shao YQ, et al. Diagnostic, prognostic, and immunological roles of FABP4 in pancancer: a bioinformatics analysis[J]. Comput Math Methods Med, 2022, 2022: 3764914. doi：10.1155/2022/3764914

[17] Parmar MB, Shams R, Wright JM. Genomic organization and transcription of the medaka and zebrafish cellular retinol-binding protein (rbp) genes[J]. Mar Genomics, 2013, 11: 1-10. doi：10.1016/j.margen.2013.04.001

[18] Kim DH, Ahn J, Suh Y, et al. Retinol binding protein 7 promotes adipogenesis in vitro and regulates expression of genes involved in retinol metabolism[J]. Front Cell Dev Biol, 2022, 10: 876031. doi：10.3389/fcell.2022.876031

[19] Chen YB, Zhou XY, Xie YW, et al. Establishment of a seven-gene signature associated with CD8⁺ T cells through the utilization of both single-cell and bulk RNA-sequencing techniques in clear cell renal cell carcinoma[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(18): 13729. doi：10.3390/ijms241813729

[20] Curiel TJ, Coukos G, Zou LH, et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival[J]. Nat Med, 2004, 10(9): 942-9. doi：10.1016/S0960-8524(03)00033-6

[21] Gogoi M, Chandra K, Sarikhani M, et al. Salmonella escapes adaptive immune response via SIRT2 mediated modulation of innate immune response in dendritic cells[J]. PLoS Pathog, 2018, 14(11): e1007437. doi：10.1371/journal.ppat.1007437

[22] Rassart E, Desmarais F, Najyb O, et al. Apolipoprotein D[J]. Gene, 2020, 756: 144874. doi：10.1016/j.gene.2020.144874

[23] Zhou ZJ, Xie X, Wang X, et al. Correlations between tumor mutation burden and immunocyte infiltration and their prognostic value in colon cancer[J]. Front Genet, 2021, 12: 623424. doi：10.3389/fgene.2021.623424

[24] Morimura S, Sugaya M, Sato S. Interaction between CX3CL1 and CX3CR1 regulates vasculitis induced by immune complex deposition[J]. Am J Pathol, 2013, 182(5): 1640-7. doi：10.1016/j.ajpath.2013.01.023

[25] Olson ME, Harris RS, Harki DA. APOBEC enzymes as targets for virus and cancer therapy[J]. Cell Chem Biol, 2018, 25(1): 36-49. doi：10.1016/j.chembiol.2017.10.007

[26] Xu X, Lu YD, Wu YL, et al. A signature of seven immune-related genes predicts overall survival in male gastric cancer patients[J]. Cancer Cell Int, 2021, 21(1): 117. doi：10.1186/s12935-021-01823-0

[27] He XF, Chen HJ, Zhong XY, et al. BST2 induced macrophage M2 polarization to promote the progression of colorectal cancer[J]. Int J Biol Sci, 2023, 19(1): 331-45. doi：10.7150/ijbs.72538

[28] Rwandamuriye FX, Wang T, Zhang HF, et al. Local therapy with combination TLR agonists stimulates systemic anti-tumor immunity and sensitizes tumors to immune checkpoint blockade[J]. Oncoimmunology, 2024, 13(1): 2395067. doi：10.1080/2162402X.2024.2395067

[29] Sugiura D, Maruhashi T, Okazaki IM, et al. Restriction of PD-1 function by cis-PD-L1/CD80 interactions is required for optimal T cell responses[J]. Science, 2019, 364(6440): 558-66. doi：10.1126/science.aav7062

[30] Gorría T, Sierra-Boada M, Rojas M, et al. Metabolic singularities in microsatellite-stable colorectal cancer: identifying key players in immunosuppression to improve the immunotherapy response[J]. Cancers, 2025, 17(3): 498. doi：10.3390/cancers17030498

[31] Niu TM, Zhu XJ, Zhao DS, et al. Unveiling interaction mechanisms between myricitrin and human serum albumin: Insights from multi-spectroscopic, molecular docking and molecular dynamic simulation analyses[J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2023, 285: 121871. doi：10.1016/j.saa.2022.121871

[32] Guccione C, Patel L, Tomofuji Y, et al. Incomplete human reference genomes can drive false sex biases and expose patient-identifying information in metagenomic data[J]. Res Sq, 2024: rs.3.rs-rs.4721159. doi：10.1038/s41467-025-56077-5

[33] Xu HX, Jiao Y, Qin S, et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine[J]. Exp Hematol Oncol, 2018, 7: 30. doi：10.1186/s40164-018-0122-9

[34] Bao YC, Qiao J, Gong WJ, et al. Spatial metabolomics highlights metabolic reprogramming in acute myeloid leukemia mice through creatine pathway[J]. Acta Pharm Sin B, 2024, 14(10): 4461-77. doi：10.1016/j.apsb.2024.07.004

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