KLF10通过下调NF-κB/NLRP3通路改善大鼠焦虑性抑郁行为及神经炎症

KLF10 overexpression alleviates neuroinflammation and anxiety-depressive disorder in rats by downregulating the NF-κB/NLRP3 pathway

摘要

目的 解析昼夜节律基因KLF10作为焦虑性抑郁生物标志物的神经免疫调控机制。 方法 基于GEO数据库人源外周血基因芯片信息，纳入健康对照64例、抑郁组62例、焦虑性抑郁59例，结合MSigDB数据库筛选差异表达的昼夜节律基因。加权基因共表达网络分析和机器学习模型筛选核心基因，KEGG通路富集分析生物过程，采用ROC曲线评估诊断效能。将40只SPF级雄性SD大鼠按体质量均质化分为空白组、假手术组、模型组、KLF10过表达组，10只/组，通过脑立体定位-侧脑室注射腺相关病毒（AAV）构建KLF10过表达模型、慢性束缚联合皮质酮应激构建焦虑性抑郁大鼠模型。强迫游泳试验检测抑郁样行为，高架十字迷宫检测焦虑样行为；采用尼氏染色观察海马、杏仁核病理学改变，酶联免疫吸附法（ELISA）检测中枢及外周细胞因子白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）；免疫荧光染色观察KLF10与p-p65共定位表达；Western blotting及qRT-PCR检测NF-κB/NLRP3通路分子表达水平。 结果 抑郁患者较健康人群9个昼夜节律基因存在表达差异，焦虑性抑郁与单纯抑郁相比免疫浸润评分升高，KEGG涉及NOD样受体信号通路和NF-κB信号通路的上调。特异性生物标记物KLF10的诊断效能为0.885（P<0.001）。在体实验验证表明，焦虑性抑郁模型大鼠强迫游泳不动时间增加、高架十字迷宫开臂探索减少（P<0.05），中枢及外周促炎因子IL-1β、TNF-α含量升高，抗炎因子IL-10、TGF-β含量下降（P<0.05）；海马和杏仁核神经元排列紊乱、尼氏体减少。NF-κB/NLRP3通路各信号分子转录水平及关键蛋白表达升高（P<0.05）。过表达KLF10可显著改善大鼠抑郁样及焦虑样行为（P<0.05），恢复中枢和外周促炎/抗炎因子平衡，改善海马及杏仁核神经元排列，同时上调NF-κB/NLRP3通路抑制节点NFKBIA的转录（P<0.001），从而下调NLRP3、RELA的转录（P<0.05），降低p-IκB-α、p-p65、NLRP3蛋白的表达（P<0.05）。 结论 KLF10通过下调NF-κB/NLRP3通路抑制海马-杏仁核炎症，改善抑郁及焦虑行为，可作为焦虑性抑郁诊断标志物与治疗靶点。

Abstract

Objective To elucidate the neuroimmune regulatory mechanism of the circadian rhythm gene KLF10 as a biomarker for anxiety depressive disorder (ADD). Methods The differentially expressed circadian rhythm genes were screened using human peripheral blood gene chip data from the GEO database (including 64 healthy individuals, 62 patients with major depressive disorder [MDD], and 59 with ADD) in conjunction with the MSigDB database. Weighted gene co-expression network analysis and machine learning models were employed to identify the core genes, followed by KEGG pathway enrichment analysis and evaluation of their diagnostic efficacy using ROC curves. In a male SD rat model of ADD induced by chronic restraint and corticosterone stress, the changes in depressive-like behaviors, hippocampal and amygdala pathologies, levels of inflammatory and pro-inflammatory cytokines, co-localization of KLF10 and p-p65 expression, and expression levels of NF‑κB/NLRP3 pathway molecules were examined following stereotactic AAV virus injection into the lateral ventricle for KLF10 overexpression. Results Compared with healthy individuals, the depressive patients showed differential expressions of 9 circadian rhythm genes. Compared with the MDD patients, the patients with ADD had significantly higher immune infiltration scores with upregulated NOD-like receptor and NF‑κB signaling pathways. The specific biomarker KLF10 demonstrated a diagnostic efficacy of 0.885. In the rat models of AOD, KLF10 overexpression significantly ameliorated depression- and anxiety-like behaviors, restored the balance between the pro- and anti-inflammatory cytokines, and improved hippocampal and amygdala pathologies. KLF10 overexpression also markedly upregulated NFKBIA mRNA, downregulated NLRP3 and RELA mRNAs, and reduced protein expressions of p-IκB‑α, p-p65, and NLRP3 in the brain tissues of the rats. Conclusion KLF10 overexpression ameliorates ADD behaviors in rats by inhibiting hippocampal-amygdala inflammation via downregulating the NF‑κB/NLRP3 pathway, suggesting the potential of KLF10 as a diagnostic biomarker and therapeutic target for AOD.

Graphical abstract

焦虑性抑郁（ADD）是隶属于抑郁障碍（MDD）的常见亚型。在诊断标准体系中，DSM-5将其划分为“伴有焦虑症状的抑郁障碍”^［1］，约占临床抑郁障碍首诊患者的40%^［2］。与单纯抑郁相比，ADD患者疾病负担更重、病程更长、复发率更高，且对SSRIs类药物反应较差，存在更高的临床异质性和神经网络失调^［3］，亟需探索针对抑郁不同亚型的诊疗策略。

近年来，抑郁障碍与神经炎症的相关性受到广泛关注。与不伴有焦虑的MDD患者相比，ADD患者在病理机制上表现出独特的神经免疫失调特征，尤其是海马和杏仁核等情绪调节关键脑区的炎症通路激活^［4］。MDD患者更多表现为海马主导的神经炎症，而ADD则同时存在海马和杏仁核的炎症水平升高^［5］。慢性束缚联合皮质酮应激是当前公认度较高的ADD动物模型^［6］，该应激范式可导致动物海马和杏仁核单胺类神经递质5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）的含量下降。然而，当前研究多局限于对海马区域促炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-18（IL-18）等水平的检测^［7］，以及抗炎治疗对模型动物行为的影响^［8］，欠缺对上游调控机制的探索。

昼夜节律基因（CCGs）是维持睡眠-觉醒周期、认知功能^［9］及血压、激素的分子桥梁^［10］，涵盖核心时钟基因与时钟控制基因。已有研究证实昼夜节律基因功能异常与多种精神疾病相关^［11］且作用机制多样，如介导小胶质细胞时钟破坏可介导睡眠时相破坏与社交障碍^［12］；时钟基因PER3基因突变个体下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）更亢进，抑郁评分更高^［13］。有研究表明，昼夜节律基因通过影响HPA轴，改变神经胶质稳态和单胺类递质释放节律，构成抑郁-焦虑-失眠的共享遗传基础^［14］，例如CLOCK、CRY基因异常介导了睡眠时相延迟，使ADD发病风险增加^［15］。此外，与单纯抑郁比，ADD患者睡眠问题更突出，自杀风险更高^［16］，但昼夜节律基因与ADD间的复杂交互关系尚不明确。

尽管现有研究已初步阐明昼夜节律基因与MDD发病之间的关联^［17］，但昼夜节律基因在抑郁症不同临床亚型（焦虑性抑郁、难治性抑郁、双相抑郁等）中的调控机制仍存在知识缺口。当前各亚型研究多集中于表型描述^［18］，缺乏对上游调控基因及下游神经免疫通路的深入解析，无法阐明ADD是否由特定的昼夜节律基因失调诱发，阻碍了精准诊疗策略的开发。基于此，本研究旨在以昼夜节律基因KLF10为核心，系统解析其神经免疫调控作用，揭示其作为ADD特异性诊断标记物的分子基础。

1 材料和方法

1.1 数据集与测序样本来源

昼夜节律基因来源于MSigDB数据库，包括核心时钟基因及调控基因；基因位点数据来源于Genecards数据库。从GEO数据库获取GSE98793人源外周血基因芯片数据，资料来源于英国剑桥大学精神病学系^［19］。样本年龄18~60岁，无慢性基础疾病、无妊娠；未使用精神类药物；未合并器质性精神障碍、精神分裂症或双相情感障碍。外周血采集时间为上午8∶00，空腹，以消除昼夜因素干扰。

1.2 测序样本分组

根据DSM-5抑郁及焦虑汉密尔顿量表评分阳性划分界值^［1］，分为健康对照（Control）：HAMD-24<8且HAMA<7；抑郁组（MDD）：HAMD-24≥8且HAMA<7；ADD组：HAMD-24≥8且HAMA≥7。共纳入健康对照组64例、抑郁组62例（剔除2例数据不全）、焦虑性抑郁组59例（剔除5例数据不全）。

1.3 生物信息学分析

差异表达分析使用R语言limma包（阈值|log₂FC|>1，FDR<0.05，sigma<0.5）；加权基因共表达网络（WGCNA）构建加权邻接矩阵、拓扑重叠矩阵（TOM）降低干扰，设定软阈值尺度拓扑拟合指数＞0.9，基因-模块相关性|MM|>0.8，基因-表型相关性|GS|>0.5^［20］。机器学习采用随机森林RF（ntree=500，mtry=√P）联合SVM-RFE（γ=0.01，AUC降幅≤5%）并执行配对Wilcoxon验证^［21］。免疫微环境采用CIBERSORT_LM22 矩阵评估、免疫/基质评分采用ESTIMATE算法^［22］。通过KEGG明确枢纽基因的通路富集关系，GO明确诊断标记物调控的基因本体。

1.4 动物实验与分组

基于《实验动物管理条例》规定及3R原则^［23］，在南京中医药大学实验动物伦理委员会批准下进行（伦理批号：No.202302A001），动物经南京中医药大学实验动物中心采购自维通利华实验动物技术有限公司（SCXK_2021-0011）。样本量经功效分析计算（α=0.05，β=0.2，f=0.4，k=4），共40只SPF级雄性SD大鼠（6周龄，体质量200±20 g），按体质量均质化原则分为空白组（control）、假手术组（shamAAV）、模型组（model）、过表达组（AAV_KLF10），10只/组。饲养条件：SPF级屏障环境、食物和饮水，12 h∶12 h明暗循环，温度25±2 ℃，湿度（55±5）%。

1.5 药物与试剂

皮质酮、0.45%羟丙基-β-环糊精、2%戊巴比妥钠、TritonX-100、蔗糖（Sigma-Aldrich）；生理盐水（国药集团）；异氟烷（RWD）；无菌骨蜡（Ethicon）；PBS、TBST、通用型抗体稀释液、抗荧光淬灭封片剂、柠檬酸钠抗原修复液、尼氏染色试剂盒（索莱宝）；4%多聚甲醛（Biosharp）；PMSF蛋白酶抑制剂-磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液（碧云天）；凝胶制备试剂盒（8%、10%）、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR green PCR试剂盒（诺唯赞）；BCA试剂盒、Trizol（Thermo fisher）；IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β ELISA 试剂盒（NeoBioscience）。NLRP3、p-IκB-α、IκB-α、p-p65、p65、KLF10、β-actin抗体、鼠源及兔源二抗（Proteintech）；Alexa Fluor 488、594荧光二抗（Invitrogen）。

AAV9-Syn-mKLF10-3flag-WPRE及AAV9-Syn-3flag-WPRE病毒由和元生物技术股份有限公司构建。qRT-PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成（表1）。

1.6 主要仪器

气体麻醉机、显微注射泵、脑立体定位仪（RWD）；大鼠行为学分析系统（上海欣软）；组织研磨仪、恒温金属浴（Servicebio）；台式低温高速离心机（Eppendorf）；冰冻切片机、正置光学显微镜、倒置荧光显微镜（Leica）、酶标仪（Perkin Elmer）；垂直电泳系统、化学发光成像仪（BIO-RAD）；Nanodrop紫外微滴分光光度计、逆转录仪（Thermo fisher）；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（Applied Biosyste）。

1.7 KLF10过表达模型构建

采用腺相关病毒（AAV）血清型载体构建KLF10过表达病毒（AAV9-Syn-KLF10-3flag-WPRE）及空病毒对照（AAV9-Syn-3flag-WPRE），滴度1.08×10¹³ vg/mL，启动子Syn（突触蛋白I启动子）可确保KLF10在神经元中特异性表达。该病毒特性为神经元嗜性高、扩散范围广、免疫原性低，适用于中枢神经系统靶向基因调控。使用气麻机将大鼠用异氟烷诱导麻醉，佩戴维持麻醉面罩并安全放置在脑立体定位仪，调节耳杆固定颅骨。于无菌台手术暴露颅骨、确认前后囟。在靶向侧脑室的坐标处进行小骨窗开颅术（AP：-1.1 mm，ML：±1.5 mm，DV：-4.5 mm）^［24］。使用由显微注射泵控制的汉密尔顿微量注射器，注射速率100 nL/min，注射体积每侧脑室2 μL，注射完成后停留10 min确保病毒完全扩散并防止回流。无菌骨蜡封闭颅孔，缝合切口，利多卡因镇痛，电热毯保温直至苏醒。术后第21天通过标签抗体荧光染色检测阳性细胞占比确认病毒转染成功。

1.8 焦虑性抑郁大鼠模型构建

慢性束缚联合皮质酮应激模型被广泛用于模拟焦虑性抑郁的核心行为表型，根据标准操作流程^［7］，大鼠于每日上午8∶00接受皮下注射皮质酮（30 mg/kg，溶于0.45%羟丙基-β-环糊精）注射，在通风良好的大鼠束缚器中进行束缚应激6 h（9∶00~15∶00），共21 d。对照组于相同时间接受空白溶质注射，无束缚且不受干扰。造模完成后立即进行行为学测试，评估抑郁样行为-绝望不动状态及焦虑样行为-焦虑回避状态。

1.9 行为学测试观察抑郁-焦虑行为

1.9.1 强迫游泳试验（FST）评估抑郁样行为

FST中，大鼠不动状态反映其抑郁-绝望水平，不动时间占比越大，其抑郁样行为越严重。大鼠提前6 h进入测试室适应环境。根据标准方案^［25］，实验者将大鼠放在1个装有30 cm深，25±2 ℃水的圆柱形桶中（50 cm高、20 cm直径）。检测6 min，并记录其中后4 min内大鼠的行为。不动状态定义为大鼠漂浮在水面上，后肢静止，只有头部暴露在水面呼吸。实验结束后，取出大鼠擦干毛发后放回家笼。每次实验后，用75%乙醇擦拭桶，以避免影响下一只待测大鼠。不动时间的比例=不动时间/记录时间。

1.9.2 高架十字迷宫（EPM）评估焦虑样行为

EPM的目标是评估动物的焦虑水平，反映大鼠对开放环境的恐惧与对新环境的好奇心之间的心理矛盾。焦虑程度越高，大鼠在闭合臂中停留的时间越长。提前6 h将大鼠放在测试室中，以减少环境变化对动物的影响。根据标准流程^［26］，实验者将大鼠放在迷宫的中心区域，确保头部朝向开臂。记录5 min内开臂进入次数（OE）、开臂活动时间（OT）、闭臂进入次数（CE）、闭臂活动时间（CT）和进臂总次数（TNE）。每次实验后，用75%乙醇擦拭迷宫，以避免影响下一只待测试的大鼠。

1.10 脑组织取材

大鼠在戊巴比妥钠完全麻醉后进行4 ℃生理盐水心脏灌注后被安乐死，将海马和杏仁核在冰上快速显微分离后放入冻存管，在液氮中速冻，转移至-80 ℃下保存，用于分子生物学实验（n=6）。为了进行组织学分析，其余大鼠（n=4）用4 ℃生理盐水心脏灌注，随后灌注4%多聚甲醛（PFA）。将脑组织完整取出后浸泡于4 ℃、4%多聚甲醛中后固定24 h，于梯度蔗糖PBS溶液中脱水直至下沉。OCT包埋后，冷冻切片机-20 ℃下进行连续冠状切片（30 μm），并在-20 ℃下保存切片用于后续染色操作。

1.11 尼氏染色观察神经元分布与形态

取脑组织冰冻切片，复温30 min后于4%多聚甲醛后固定10 min，经PBS漂洗。根据试剂盒说明书，浸入0.1%甲苯胺蓝染色液（0.1 mol/L醋酸缓冲液配制）中染色8 min。流水快速冲洗后，于70%乙醇中进行醋酸分化，直至背景透亮而神经元尼氏体呈深蓝色。随后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，封片剂封片，光学显微镜观察海马和杏仁核神经元中的尼氏体并拍照^［27］。

1.12 ELISA检测中枢及外周促炎/抗炎细胞因子

根据试剂盒说明书使用预包被抗体的ELISA试剂盒（抗IL-1β、抗TNF-α、抗IL-10、抗TGF-β）检测脑组织和血清中的促炎/抗炎细胞因子含量。将样品加入96孔板中与检测抗体和链霉亲和素-HRP孵育后，用TMB底物展开反应，用终止溶液终止反应。使用酶标仪测量吸光度A_{450 nm}，根据标准曲线确定IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β的含量。

1.13 免疫荧光观察海马和杏仁核中KLF10和p-NF-κB p65的共定位表达

脑组织冰冻切片复温，进行热诱导抗原修复：将切片浸入预热的0.01 mol/L柠檬酸钠修复液（pH=6.0）中，水浴95 ℃加热15 min，自然冷却至室温。PBS漂洗，使用含0.3% Triton X-100的PBS进行透化，用5%山羊血清封闭1 h。加入鼠源KLF10一抗（1∶150）与兔源p-NF-κB p65一抗（1∶500）混合液4 ℃孵育20 h。PBST充分洗涤，加入Alexa Fluor 488、594荧光二抗（1∶500）室温避光孵育1 h，滴加含DAPI的封片剂封片^［28］。荧光显微镜下观察并拍摄海马与杏仁核区域图像。

1.14 qRT-PCR检测NF-κB/NLRP3通路基因表达水平

根据标准操作程序^［29］与试剂盒说明书方案，使用TRIzol试剂提取总RNA；使用逆转录试剂盒构建20 μL逆转录体系合成cDNA。配制20 μL反应体系，使用SYBR Green Master Mix在QuantStudio系统上进行qRT-PCR反应：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 40 s进行40个循环。获得靶基因的CT值、以β-actin作为内参，使用2^-ΔΔCt方法进行相对定量。

1.15 Western blotting检测NF-κB/NLRP3通路蛋白表达水平

根据标准操作程序^［30］，4 ℃下将组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液中研磨匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心15 min后吸取上清，BCA试剂盒测定蛋白质浓度并配平，95 ℃金属浴使蛋白变性。上样30 μg/泳道，进行SDS-PAGE电泳，无水乙醇激活PVDF膜后转膜。PVDF膜用无蛋白快速封闭液室温下封闭20 min，TBST清洗，摇床4 ℃过夜进行一抗孵育：抗NLRP3（1∶800）、抗IκB-α（1∶2000）、抗p-IκB-α（1∶800）、抗p-NF-κB p65（1∶1000）、抗NF-κB p65（1∶2500）和抗β-actin（1∶5000）。TBST洗膜，与HRP偶联二抗（1∶5000）在室温下孵育1 h，TBST洗膜。避光滴加化学发光显影液，化学发光成像系统拍照。使用ImageJ软件进行光密度分析。

1.16 统计学分析

使用R4.2.1软件进行生物信息学分析，SPSS 25.0处理实验数据，GraphPad Prism9.0绘制图表。基因数据经 log₂（exp） 转换及Z-score标准化，P值经FDR矫正。Pearson分析基因-表型相关性、Spearman分析免疫细胞相关性；机器学习及诊断效能采用10折交叉验证及 Bootstrap验证。人口学数据经协方差分析（ANCOVA）质控、行为学数据采用双因素方差分析（组别×时间）。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。方差不齐时采用Brown-Forsythe检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本分布情况及差异基因

与Control组比，MDD组、ADD组女性占比均升高，且高发于18~30岁人群（P<0.05）。MDD组较ADD组病程更长（P<0.05）。协方差分析结果显示，各组回归斜率同质，年龄和性别不属于KLF10表达的混杂因素（P>0.05，表2）。在FDR<0.05条件下，MDD和ADD组共有1641个基因上调、982个基因下调（图1A）。DEGs与CCGs取交集得32个昼夜节律基因，其中KLF10等9个基因的差异有统计学意义（P<0.001）。KLF10定位于8号染色体，其表达量与核心生物钟基因CRY1、PER3呈正相关（图1B~E）。

2.2 WGCNA及功能注释

经树状聚类分析，蓝色与青绿色模块和焦虑性抑郁高度相关；蓝色模块Pearson系数0.80（P=1e-24），高于青绿色模块Pearson系数-0.64（P=2e-13）（图1F~G）。与细胞周期及程序性死亡相关的蓝色模块中，19个核心节点基因满足强相关条件（图1H），该模块基因与个体焦虑程度呈正相关（P<0.05），与细胞毒性的CD8+T细胞呈强负相关（P<0.001），并与肥大细胞稳态呈强正相关（P<0.001，图1I）。

2.3 焦虑性抑郁与单纯抑郁的免疫差异

免疫浸润分析显示ADD组静息态免疫细胞占比减少，比MDD组具有更高的炎症水平（P<0.05，图2A、B）。不同抑郁亚型外周血免疫细胞占比不同，ADD组炎症相关的CD8⁺T细胞、单核细胞占比升高（P<0.05）；维持稳态的M2型巨噬细胞占比下降（P<0.05），且KLF10与CD8⁺T细胞、单核细胞呈负相关（图2C、D）。KEGG富集分析显示ADD涉及多条炎症通路上调，其中NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路上调程度最高（P<0.01，图2E）；维持细胞稳定的细胞周期通路、长时程增强信号通路（P<0.001）显著下调（图2F）。

2.4 焦虑性抑郁诊断标志物预测

RF模型中，共13个昼夜节律基因抑制了ADD的发生（图3A）。SVM-RFE模型中，ADD组比MDD组具有更低的KLF10和CRY1水平（P<0.01，图3B），这2个基因在不同机器学习模型中具备稳定性（图3C）。ROC曲线验证显示，KLF10单独作为诊断预测模型的效能最高，AUC为0.885（P<0.001），CRY1的预测效能不足（P>0.05），两基因表达呈弱正相关（r=0.65），联合预测效能为0.798（P<0.01，图3D、E）。KLF10在NF-κB/NLRP3通路中发挥维稳作用：上调核转位抑制基因NFKBIA、下调转录激活基因RELA的表达，继而降低下游炎症小体通路基因NLRP3和IL1B的水平（P<0.001，图3F）。

2.5 大鼠抑郁样行为及焦虑样行为

行为学测试时点（图4A）。FST检测大鼠绝望-不动的抑郁样行为，空白组和假手术组的不动时间占比差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组比，模型组大鼠不动时间增加（P<0.01）；过表达KLF10逆转了大鼠的绝望-不动状态（P<0.05，图4B）。

EPM检测大鼠焦虑样行为，开臂活动积极性与大鼠焦虑程度成反比。经Tukey HSD多重比较，空白组与假手术组焦虑水平差异无统计学意义（P>0.05）；模型组大鼠焦虑程度高、开臂探索时间减少（P<0.01）。过表达KLF10改善了大鼠焦虑状态，提升其开臂探索的积极性（P<0.05，图4C~F）。

2.6 各组大鼠中枢及外周炎症情况

尼氏染色显示，空白、假手术、过表达组海马及杏仁核神经元内尼氏小体丰富，无神经损害特征。模型组表现为神经元排列紊乱、尼氏体大量脱失，神经损害程度高（图4G）。ELISA检测显示，与空白组比，假手术组血清和脑内IL-10存在代偿性升高（P<0.05），其他细胞因子水平差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组比，模型组中枢和外周促炎细胞因子IL-1β、TNF-α均增多（P<0.05），抗炎细胞因子IL-10、TGF-β均减少（P<0.05）。KLF10过表达减少脑内IL-1β和外周血TNF-α的堆积（P<0.05），提升IL-10和TGFβ水平（P<0.01，图4H~I）。

2.7 过表达KLF10对海马及杏仁核p-NF-κB p65的影响

免疫荧光共定位显示KLF10、p-p65（ser536）主要表达于细胞核中（图5A）。与空白组比，假手术未导致KLF10、p-p65表达水平改变。与假手术组比，慢性应激造成海马和杏仁核KLF10平均荧光强度降低（P<0.05）。同时，p-p65阳性细胞占比升高（P<0.01）。过表达组病毒转染效果稳定，KLF10阳性细胞占比提升（P<0.001），抑制了p65的核转位和磷酸化激活，减少了海马和杏仁核中p-p65的激活（P<0.05，图5B）。

2.8 过表达KLF10对NF-κB/NLRP3通路分子表达水平的影响

NFKBIA、RELA、NLRP3、IL1B、CASP1是NF-κB/NLRP3通路的关键基因，共同构成了炎症小体启动-激活-效应的核心轴。qRT-PCR显示，假手术对上述基因转录水平无影响（P>0.05）；与假手术组比，模型组保护性的NFKBIA转录水平下降（P<0.01）。同时，炎症小体激活关键基因NLRP3、IL1B、CASP1转录水平升高（P<0.01）。KLF10过表达逆转了这一过程，使NFKBIA水平回升（P<0.001）并下调NLRP3、RELA的转录（P<0.05，图5C）。

Western blotting结果显示，p-IκB-α/IκB-α、p-p65/p65反映了NF-κB/NLRP3通路激活水平，焦虑性抑郁使IκB-α本体消耗（P<0.01）、NLRP3水平升高（P<0.001），磷酸化蛋白p-IκB-α、p-p65激增（P<0.01）。KLF10过表达使促炎活性的p-IκB-α和NLRP3水平下降（P<0.05），降低p-IκB-α/IκB-α、p-p65/p65的激活比例（P<0.05，图5D、F）。

3 讨论

当前精神病学领域对抑郁不同亚型间生物标记物的差异尚不明确。基于此，本研究通过生物信息学联合动物模型验证，揭示了ADD与MDD在昼夜节律基因和神经免疫方面的差异。与既往研究关注昼夜节律基因调控MDD患者睡眠节律和HPA轴功能不同^［31］，本研究聚焦于抑郁障碍中的ADD亚型，发现该亚型患者外周血共32个昼夜节律基因存在不同程度的表达异常，尤其KLF10和CRY1的表达显著降低。这些基因对神经免疫的影响尤为复杂^［32］，涉及小胶质细胞表型转换、HPA轴激素节律性分泌、血脑屏障通透性、中枢-外周炎症交互等生物过程^［33］。其中，KLF10对ADD亚型发病的预测效能显著高于其他昼夜节律基因，其表达量下降不仅特异性介导了ADD的发生，还介导了中枢神经系统和外周免疫的促炎/抗炎失衡。

即便KLF10在其他疾病中已经表现出抗炎、调节脂质代谢、抗肿瘤增殖的强大潜力^［34］，如：敲除KLF10可导致小鼠肝脏脂质积累、细胞死亡、炎症和纤维化^［35］，因此KLF10被认为是良性的免疫调节角色。然而，KLF10的功能及上下游调控关系在抑郁症研究中尚无报道。本研究通过侧脑室注射进行了KLF10的过表达操控，首次揭示其显著逆转了ADD大鼠焦虑及抑郁样行为，改善了慢性应激诱发的神经炎性损伤，拓展了KLF10改善精神疾病的证据。进一步看，KLF10参与调控HPA轴功能及BMAL1/CLOCK复合物水平，间接影响了神经胶质表型变化^［36］，对维持正常的神经可塑性和神经-免疫-内分泌稳态具有良性作用^［37］。所以KLF10在ADD的基因诊断和神经免疫治疗中均展现出较高的临床转化价值。

为了弥补KLF10在中枢-外周免疫调控关系中的空白，本研究关注了KLF10对中枢和外周血中促炎/抗炎细胞因子的影响，发现ADD组与MDD组具有不同的免疫浸润特征。ADD组外周血CD8+T细胞和单核细胞浸润增加，KLF10表达量与这一过程呈强负相关，进一步强调了KLF10对细胞免疫稳态的重要性，印证了ADD存在中枢-外周炎症交互的观点^［38］。此外，本研究进一步发现慢性应激激活了MyD88依赖性NF-κB信号，启动下游NLRP3炎性小体激活^［39］；这一过程介导了IL-18和IL-1β的成熟和释放，这些促炎细胞因子在海马、杏仁核等情绪相关脑区急剧积累，引发抑郁和焦虑样行为^［40］。

由于KLF10对上述关键脑区的保护作用尚不明确，本研究采用侧脑室过表达KLF10的方法，实现了仅在中枢神经系统进行基因操纵，而不改变大鼠外周KLF10的表达。此前研究主要关注外周免疫向中枢的单向输入^［8］，并未强调中枢调控分子可反向塑造外周免疫稳态。然而，本研究发现KLF10是NF-κB信号的上游负性调控分子，其过表达不仅可逆转海马-杏仁核损伤，还能间接促进外周免疫稳态恢复：减少促炎因子IL-1β和TNF-α的生成，增加保护性的IL-10和TGF-β释放。这为理解ADD“脑-外周免疫轴”交互机制提供了新证据。

近年来，精准医疗的发展需求提高^［41］，部分研究已揭示抑郁障碍不同亚型对一线抗抑郁药物敏感性不同^［42］，但缺乏针对ADD亚型的靶向干预策略。与既往研究寻找诊断标记物的思路不同^［43］，本研究发现KLF10不仅具有基因诊断的特异性和稳定性，同时还表现出强大的治疗潜力。它可以通过双重途径抑制NF-κB/NLRP3通路信号来实现ADD的治疗：一方面，使IκBα和p65磷酸化水平降低，抑制了NF-κB的核转位；另一方面，增加IκBα本体合成并下调NLRP3炎性小体组装，阻断了IL-1β等促炎因子的释放。这些结果强有力地表明，KLF10能够通过抑制炎症级联反应改善海马-杏仁核的免疫微环境，为抑郁症分亚型治疗提供新的线索。

尽管本研究揭示了KLF10在神经免疫调控中的重要作用，但仍需更深入的机制探索。下一步研究需着眼于KLF10更深入的神经网络机制，结合脑区间示踪、单细胞测序等技术解析脑网络关系及神经免疫细胞的时空动态变化，进行节律相关的多时点验证。

综上所述，本研究创新性地发现了KLF10在精神疾病中的关键作用。它不仅可作为ADD的特异性诊断标志物，还具备治疗意义：抑制海马-杏仁核环路的NF-κB/NLRP3信号通路，改善脑-外周免疫轴功能，发挥抗焦虑抑郁效应。这为抑郁亚型的精准医疗提供了新的理论依据和治疗靶点。

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