薤白超细粉通过抑制铁死亡并调控NF-κB/STAT3信号轴缓解脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

Ultrafine Xiebai powder alleviates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice by suppressing ferroptosis and modulating the NF-κB/STAT3 signaling axis

摘要

目的 探讨薤白超细粉（UXP）对脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤的保护作用及其机制。 方法 选取54只雄性C57BL/6小鼠，随机分为对照组、模型组、UXP低剂量组、UXP中剂量组、UXP高剂量组、薤白普通研磨粉（GXP）低剂量组、GXP中剂量组、GXP高剂量组和地塞米松组（LPS+DEX），6只/组。模型组及各干预组小鼠经气管滴注LPS（4 mg/kg）建立急性肺损伤模型。UXP及GXP处理组自造模当日起连续6 d灌胃UXP悬液和薤白普通研磨粉［100、250、500 mg/（kg·d）］；地塞米松组灌胃地塞米松溶液［1 mg/（kg·d）］；对照组和模型组同期灌胃等体积生理盐水。实验结束后，测定肺组织湿/干重比（W/D）评估肺水肿；采用ELISA检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中α肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）及白细胞介素-8（IL-8）水平；流式细胞术分析BALF中炎症细胞数量；HE染色观察肺组织病理学变化；使用试剂盒测定肺组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛及谷胱甘肽（GSH）含量；RT-qPCR检测肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8及MCP-1 mRNA表达；Western blotting检测p-NF-κB/NF-κB及p-STAT3/STAT3蛋白水平；透射电子显微镜观察线粒体超微结构。细胞实验采用LPS（10 μg/mL）诱导人支气管上皮细胞（Beas-2b）损伤模型，设对照组、模型组、UXP组（LPS+UXP，5 mg/mL）和地塞米松组（LPS+DEX，5 μmol/L）。通过CCK-8法测定细胞活性，Annexin V/PI流式检测细胞凋亡，DCFDA探针检测活性氧水平，并利用Mitotracker、Lipofluo和FerroOrange荧光探针评估线粒体膜电位、脂质过氧化及亚铁离子水平。 结果 与对照组相比，模型组小鼠W/D比升高（P<0.001），BALF中炎症因子水平上调（P<0.001），炎症细胞数量明显增加，肺组织出现广泛炎症浸润和结构破坏。与此同时，SOD及GSH含量下降（P<0.001），丙二醛水平升高（P<0.001），炎症因子mRNA表达及p-NF-κB/NF-κB、p-STAT3/STAT3蛋白水平增加（P<0.001），线粒体出现体积缩小、嵴减少及膜结构破坏等超微结构损伤。与模型组相比，UXP改善上述指标（P<0.001），部分效果接近地塞米松组。细胞实验结果显示，UXP提高细胞活性（P<0.001），降低凋亡比例（P<0.001），减少活性氧生成，维持线粒体功能，并有效抑制脂质过氧化和铁死亡（P<0.001）。 结论 UXP对LPS诱导的急性肺损伤具有显著保护作用，其机制可能与抑制炎症因子释放、缓解氧化应激、抑制铁死亡及细胞凋亡、调控NF-κB/STAT3信号通路，以及维持线粒体结构和功能完整性密切相关。

Abstract

Objective To investigate the protective effects of ultrafine Xiebai powder (UXP) against lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) in mice and the underlying mechanism. Methods Fifty-four male C57BL/6 mice were randomized into 9 groups, including a control group and 8 intratracheal LPS instillation-induced ALI model groups gavaged with saline, dexamethasone (DEX, 1 mg/kg), or 100, 250, or 500 mg/kg UXP or granule Xiebai powder (n=6) for 6 consecutive days, starting on the day of modeling. After the treatment, the lung wet-to-dry (W/D) ratios were determined, inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA, and inflammatory cell infiltration was assessed by flow cytometry. Histopathological injury of the lungs was observed using HE staining, and pulmonary SOD, MDA, and GSH levels were determined. Pulmonary mRNA expressions of inflammatory mediators were quantified by RT-qPCR, and NF‑κB and STAT3 activation was analyzed using Western blotting; mitochondrial ultrastructure was examined with transmission electron microscopy. In a LPS-stimulated BEAS-2B cell model, the effects of UXP and DEX were assessed on cell viability, apoptosis, reactive oxygen species (ROS), mitochondrial function, lipid peroxidation, and ferrous iron levels. Results The LPS-challenged mice exhibited a higher lung W/D ratio and increased BALF cytokine levels and inflammatory cell counts with pronounced lung inflammation and tissue damage, lowered SOD and GSH levels, elevated MDA levels, increased mRNA expressions of inflammatory mediators and the p-NF‑κB/NF‑κB and p-STAT3/STAT3 ratios, and obvious mitochondrial damages. UXP markedly alleviated these changes with an efficacy comparable to DEX. In LPS-stimulated BEAS-2B cells, UXP significantly improved cell viability, redcued cell apoptosis and ROS accumulation, preserved mitochondrial integrity, and reduced lipid peroxidation and ferroptosis-associated changes. Conclusion UXP has strong protective effects against LPS-induced ALI in mice possibly by suppressing inflammation, oxidative stress, ferroptosis, and apoptosis, modulating the NF‑κB/STAT3 signaling axis, and maintaining mitochondrial integrity.

Graphical abstract

关键词

薤白超细粉 / 急性肺损伤 / 炎症 / 氧化应激 / 铁死亡

Key words

ultrafine Xiebai powder / acute lung injury / inflammation / oxidative stress / ferroptosis

急性肺损伤（ALI）是一种严重的临床综合征，其特征表现为进行性低氧血症、呼吸困难及肺水肿^［1］。在ALI的发病机制中，失控的炎症反应和氧化应激是核心环节。若未能及时有效改善氧合状态，病情可进一步恶化并发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），对患者生命构成严重威胁^［2］。ICU中ARDS患者的病死率高达约40%^［3］，研究该疾病的有效干预策略尤为迫切。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分，可诱导产生大量促炎因子，激活免疫炎症反应并导致肺组织损伤，因此被广泛用于ALI动物模型的建立^［4］。

在持续炎症反应和氧化应激失衡下，异常激活的细胞死亡程序被认为是引发肺组织损伤加剧的关键环节。近年来研究揭示，铁死亡在急性肺损伤病理进程中发挥着核心作用^［5］。作为一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的新型细胞程序性死亡方式，铁死亡的核心机制涉及抗氧化防御系统（特别是谷胱甘肽过氧化物酶4）的功能失调，导致脂质过氧化物大量累积，从而引发强烈的氧化应激与细胞膜损伤^［6］。在LPS诱导的肺损伤中，肺泡上皮细胞和气道支气管上皮细胞均表现出典型的铁死亡特征^{［7， 8］}，包括线粒体膜电位崩溃、脂质过氧化产物增加及抗氧化系统失衡，提示靶向铁死亡可能成为ALI治疗的新策略。

值得注意的是，炎症反应、氧化应激与铁死亡在ALI的发生发展过程中密切相关。在炎症刺激条件下，促炎细胞因子可激活NF-κB、STAT3等经典炎症信号通路，继而上调NADPH氧化酶（NOX）等氧化酶系统的表达，显著增强活性氧（ROS）的生成^［9-11］，导致氧化应激水平持续升高^{［12， 13］}。与此同时，炎症反应和过度的氧化应激可通过干扰谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗氧化防御体系，使脂质过氧化物难以被有效清除，从而降低细胞的抗氧化能力^［14］。GSH缺乏或 GPX4 抑制是铁死亡发生的核心病理过程，导致细胞膜上富含多不饱和脂肪酸的磷脂更易发生氧化，形成脂质过氧化物^［15］。因此，在ALI的病理进程中，铁死亡更可能发生于炎症反应和氧化应激失衡的背景之下，作为下游参与肺组织损伤的重要病理事件。

目前，临床上针对ALI的主要治疗手段仍以抗炎药物为主，尤其是糖皮质激素类药物，如地塞米松（DEX）。然而，长期或大剂量应用此类药物可能引发免疫抑制、感染风险增加等不良反应，限制了其临床应用。因此，开发安全性高、毒副作用小的天然药物干预措施，成为ALI防治研究的重要方向之一。薤白（Xiebai）作为传统中药，具有显著的抗炎、抗氧化等多种药理活性^［16］。近年来，超细粉技术作为一种先进的中药加工工艺，能够显著提高药物的生物利用度，从而增强其药效^［17］。已有研究发现，薤白粗提物对哮喘模型小鼠具有减轻气道炎症、调节气道重塑的作用^［18］，但其超细粉形式在ALI防治中的作用及相关机制尚缺乏系统研究。

基于此，本研究以炎症反应失控及其伴随的氧化应激失衡这一ALI的核心病理基础为切入点，通过体内外实验探究薤白超细粉（UXP）对LPS诱导ALI的保护效应及其作用机制，重点阐明UXP减轻炎症反应的干预作用，并探讨其通过抑制炎症相关信号通路、降低炎症诱导的氧化应激负荷，对铁死亡等下游细胞损伤执行过程的继发性调控作用。动物实验层面，本研究构建LPS滴注致ALI小鼠模型，评估UXP对肺水肿、炎症因子表达、氧化应激水平及肺组织病理变化的影响，并初步分析NF-κB与STAT3信号通路在其中的调控作用。细胞实验层面，以人支气管上皮细胞（Beas-2b）为研究对象，进一步探讨UXP在LPS刺激下对细胞活性、凋亡、活性氧积累、线粒体功能及铁死亡相关指标的影响，旨在从整体到细胞水平探讨UXP缓解急性肺损伤的作用机制，为ALI的防治提供一定的实验依据和干预思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物与细胞

54只8周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量约20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006］。所有小鼠饲养在易生源基因科技（天津）有限公司，使用许可证号：SYXK（津）2021-0003。小鼠饲养环境温度20~25 ℃、湿度40%~60%、12 h/12 h明暗交替，自由饮食喂养1周后进行实验。动物实验经天津大学实验动物中心动物伦理委员会批准（伦理批号：TJUE2025-A-S-022）。人支气管上皮细胞（Beas-2b）由中科院上海细胞库提供。

1.2 主要试剂与仪器

UXP（海南万代兰生物医药科技有限公司），其制备方法和质控指标参照已发表文献［19］；GXP（VEpiaopiao）；DEX、LPS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；戊巴比妥（Sigma）；Annexin V FITC和PI细胞凋亡检测试剂盒、RNAeasyTM动物RNA抽提试剂盒（离心柱式）、BeyoRTTM III cDNA合成预混液（5×）（with gDNA EZeraser）、BeyoFastTM SYBR Green qPCR Mix（2×）（上海碧云天生物科技股份有限公司）；α肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）及白细胞介素-8（IL-8）、ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；抗体STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、GAPDH、抗兔HRP标记的二抗（Anti-rabbit IgG）（Cell Signaling Technology公司）；ECL化学发光底物试剂盒（白鲨生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白磷酸酶抑制剂混合物、GSH含量测定试剂盒、MDH含量检测试剂盒、SOD含量测定试剂盒、CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Liperfluo染料、FerroOrange染料（Dojindo）。显微镜（尼康）；透射电子显微镜（TEM）（Thermo Fisher）；实时荧光定量PCR仪（Bio-rad）；Western blotting蛋白电泳仪（Bio-rad）、Western blotting半干转仪（Bio-rad）；化学发光成像仪（北京德泉兴业商贸有限公司）；Ti2-U倒置荧光显微镜（上海尼康精机有限公司）；GL2415R型离心机（苏州莫纳生物科技有限公司）；RM2016组织切片机（上海徕卡仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 ALI小鼠模型制备、分组及给药

将8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、LPS模型组、UXP低剂量组（LPS+UXP-L，100 mg/kg）、UXP中剂量组（LPS+UXP-M，250 mg/kg）、UXP高剂量组（LPS+UXP-H， 500 mg/kg）、GXP低剂量组（LPS+GXP-L，100 mg/kg）、GXP中剂量组（LPS+GXP-M，250 mg/kg）、GXP高剂量组（LPS+GXP-H，500 mg/kg）和地塞米松治疗组［LPS+DEX，1 mg/（kg·d）］，6只/组。模型组及各治疗组小鼠气管滴注LPS（4 mg/kg）建立ALI模型^［20］，UXP组和GXP组小鼠于建模同时分别灌胃薤白超细粉悬液和薤白普通研磨粉^［17］，连续6 d；DEX组每日灌胃地塞米松溶液^［21-23］；对照组和模型组同期灌胃等体积生理盐水。

1.3.2 小鼠肺组织样本采集及切片

在给药结束后第7天，使用1%戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，将小鼠固定于仰卧位，沿颈部正中切开皮肤并暴露气管，于气管处剪开小口并插入钝头导管固定。随后使用预冷无菌PBS分3次进行灌洗（约0.5 mL/次），配合轻柔胸腔按压后缓慢回抽灌洗液，最终将3次回收液合并并置于冰上备用。第2组小鼠用于获取肺组织。麻醉后直接摘取完整肺组织，将左肺置于4%多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋和切片后，进行HE染色以观察肺组织病理变化。其余肺组织则迅速转移至-80 ℃条件下冷冻保存，供后续分子生物学分析使用。

1.3.3 肺指数及肺湿/干比（W/D）

取右肺的前叶，经生理盐水洗涤和滤纸吸水后立刻称重，烘箱60 ℃干燥48 h后再次称重，计算肺湿/干比（W/D）。通过总肺质量比全身质量来计算肺指数。

1.3.4 ELISA检测

4 ℃下离心BALF 15 min，根据试剂盒说明检测BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8浓度，用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}。

1.3.5 流式细胞术检测BALF中炎症细胞数量

将BALF以3000 r/min 离心15 min收集细胞及上清液。将红细胞裂解液加入沉淀细胞，用PBS洗涤细胞2次，用1 mL PBS 重悬，并用台盼蓝染色测定细胞总数。取适量细胞，加入荧光标记抗体（如CD45、CD3、CD19、CD14、Ly6G等标记不同炎症细胞），避光孵育30 min。PBS洗涤去除未结合抗体后，用流式细胞仪采集数据。

1.3.6 试剂盒检测肺组织中SOD、MDA、GSH水平

取适量肺组织，加入裂解液，研磨后冰上裂解30 min。离心（4 ℃， 5000 r/min， 20 min）后取上清（蛋白原液），BCA法测蛋白浓度。根据试剂盒说明检测SOD、MDA、GSH水平。

1.3.7 RT-qPCR法

取20 mg左右的小鼠肺中叶，利用动物RNA抽提试剂盒（离心柱式）从肺组织中提取总RNA并测定浓度。将RNA逆转录成cDNA后使用SYBR荧光探针进行RT-qPCR实验。反应总体系为20 µL，包括10 µL的SYBR，各2 µL的上、下游引物和cDNA模版，4 µL的DEPC水。反应条件根据SYBR说明书设置为40个循环的三步法。引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

1.3.8 Western blotting检测

取20 mg左右小鼠右肺后叶，加入RIPA裂解液，采用BCA法对裂解后的蛋白质样品进行定量检测。样品在95 ℃下煮沸10 min变性。随后将蛋白质样品通过SDS-PAGE分离（上层胶80 V 30 min，下层胶120 V 120 min），并转移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白或5%脱脂奶粉在室温下对封闭2 h，分别加入p-NF-κB、NF-κB、p-STAT3、STAT3（稀释比例均为1∶1000）和GAPDH（稀释比例1∶10 000）特异性一抗，在4 ℃下过夜孵育过夜。使用含1%吐温20的TBST洗涤10 min 3次。将膜与抗兔HRP标记的二抗（稀释比例1∶2000）在室温下孵育2 h并洗涤10 min 3次，然后使用ECL化学发光试剂检测目标蛋白条带。

1.3.9 TEM观察肺组织线粒体结构变化

快速取肺组织立即投入 4 ℃预冷中固定液中，然后放4 ℃冰箱固定过夜保存。倒掉固定液，漂洗3次，15 min/次，再用1% 锇酸（OsO₄）进行后固定。对样品进行梯度脱水和渗透，再修块、切片和染色，最后在透射电镜（80~120 kV）下定位线粒体，观察拍摄。

1.3.10 细胞培养与分组

Beas-2b细胞在含10%热灭活FBS和1%青霉素/链霉素双抗的DMEM完全培养基中培养，培养条件为37 ℃、95%湿度和5% CO₂。每2 d更换一次培养基。当细胞密度达到80%~90%时，以1∶3至1∶5的比例进行传代，或用于后续铺板、冻存等实验操作。将Beas-2b细胞随机分为对照组、LPS模型组（10 μg/mL）、LPS+UXP组（5 μg/mL）和LPS+DEX组（5 μmol/L）。药物刺激干预24 h后进行实验。

1.3.11 CCK-8试验检测细胞活力

将各组细胞以5×10³/孔接种于96孔板中，置于培养箱培养24 h至细胞贴壁，药物刺激24 h后，弃去上清，加入100 μL/孔按1∶9比例用基础培养基稀释的CCK-8溶液（包括调零孔）。将96孔板于培养箱中避光孵育2 h，随后使用酶标仪检测各孔的吸光度A_{450 nm}，并计算细胞存活率。

1.3.12 流式细胞分析

为评估细胞凋亡、脂质过氧化及细胞内铁积累情况，使用 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡；采用 Liperfluo 荧光探针评估脂质过氧化水平；利用 FerroOrange 探针测定细胞内 Fe²⁺浓度。按试剂盒说明书染色后的细胞使用贝克曼流式细胞仪进行检测，每样本采集10 000 个有效细胞事件。后续数据分析在 CytExpert软件中完成，流程如下：首先，在 FSC-A/SSC-A散点图中设门，圈定目标细胞群并排除碎片；其次，通过 FSC-H vs FSC-A分析，排除双联体以确保单个细胞的准确性；最后，根据阴性对照样本的荧光信号，将荧光阳性与阴性群体的判别阈值统一设定在10⁴。

1.3.13 细胞内ROS水平检测

使用DCFDA荧光探针测定细胞内总ROS水平。将细胞以1×10⁵/孔接种于24孔板中，经药物处理后，用PBS洗涤细胞，加入含10 μmol/L DCFDA探针的无血清培养基，于37 ℃细胞培养箱中避光孵育30 min。孵育结束后，按说明书要求用稀释缓冲液冲洗。随后，使用荧光显微镜观察并采集细胞绿色荧光图像。

1.3.14 线粒体膜电位检测

采用MitoTracker^TM Red CMXRos荧光探针评估线粒体膜电位的变化。将细胞以1×10⁵/孔接种于24孔板，药物刺激干预24 h后，用PBS洗涤细胞，随后加入200 nmol/L的Mitotracker染色液，于37 ℃细胞培养箱中避光孵育30 min，按说明书要求用稀释缓冲液冲洗。随后，使用荧光显微镜观察并采集细胞图像。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.5软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义，实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 UXP对ALI小鼠肺病理变化及损伤的影响

HE染色结果显示（图1），对照组小鼠肺泡结构完整，肺泡腔内未见渗出物和炎性细胞浸润，未观察到明显病理改变。LPS组小鼠肺组织损伤显著，表现为肺泡破裂、肺泡壁明显增厚，肺泡腔内可见大量粉红色渗出物及炎性细胞浸润。与LPS组相比，UXP低、中、高剂量组和GXP低、中、高剂量组在不同程度上缓解了上述病理变化。随着给药剂量的增加，肺组织损伤呈现逐步改善的趋势，其中UXP高剂量组在维持肺泡结构完整性和抑制炎性细胞浸润方面表现出更为稳定和显著的改善效果。基于其在多组比较中的组织学保护优势，高剂量UXP被选为代表剂量，用于后续与阳性对照DEX的比较分析。与LPS组相比，UXP高剂量组和DEX组均改善了LPS诱导的肺组织病理损伤，表现为肺泡结构相对完整，且炎性细胞浸润减少（图2）。

2.2 UXP对ALI小鼠肺指数及肺湿/干比（W/D）的影响

与对照组相比，LPS组小鼠的肺/体质量比和W/D比均升高（P<0.001）。与LPS组相比，LPS+UXP组、LPS+DEX组肺/体质量比和W/D比均降低（P<0.001，P<0.05），两种干预均可有效减轻肺组织水肿及器官损伤（图3）。

2.3 UXP对ALI小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的影响

ELISA检测结果显示，与对照组相比，LPS组小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量均升高（P<0.001），炎症反应明显增强。与LPS组相比，LPS+UXP组和LPS+DEX组小鼠上述炎症因子水平均降低（P<0.001，图4）。

2.4 UXP对ALI小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞数量的影响

流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，LPS诱导的ALI模型小鼠支气管肺泡灌洗液中炎性细胞总数量及各类炎性细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞等）数量均增加，尤其中性粒细胞比例显著升高（P<0.001）；与LPS组相比，UXP组和DEX组均降低炎性细胞总数量、各类炎性细胞数量及中性粒细胞所占比例（P<0.001，图5）。

2.5 UXP对ALI小鼠肺组织中SOD、MDA、GSH水平的影响

与对照组相比，LPS组小鼠肺组织中SOD活性降低（P<0.001），MDA含量明显升高（P<0.001），GSH水平下降（P<0.001）。与LPS组相比，LPS+UXP组、LPS+DEX组均提高了SOD活性（P<0.001），降低MDA含量（P<0.001），并恢复GSH水平（P<0.001，图6）。

2.6 UXP对ALI小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1 mRNA表达的影响

RT-qPCR检测结果显示，与对照组相比，LPS模型组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8及MCP-1的mRNA表达水平均升高（P<0.001），炎症反应显著激活。与LPS组相比，LPS+UXP组和LPS+DEX组均降低上述炎症因子mRNA表达水平（P<0.001，图7）。

2.7 UXP对ALI小鼠肺组织中p-NF-κB/NF-κB、p-STAT3/STAT3蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，与对照组相比，LPS模型组小鼠肺组织中p-NF-κB/NF-κB及p-STAT3/STAT3的表达水平均升高（P<0.001），NF-κB和STAT3信号通路显著激活。与LPS组相比，LPS+UXP组和LPS+DEX组显著下调p-NF-κB、p-STAT3的表达水平（P<0.001，图8）。

2.8 UXP对ALI小鼠肺组织线粒体结构变化的影响

TEM结果显示，LPS组小鼠肺组织中线粒体较对照组明显肿胀，嵴结构出现断裂或消失，基质密度明显降低，线粒体结构严重受损。与LPS组相比，UXP和DEX干预能够显著减轻线粒体损伤，改善线粒体形态结构（图9）。

2.9 UXP对LPS诱导的Beas-2b细胞活力、凋亡的影响

CCK-8法检测结果显示，与对照组相比，5 μg/mL LPS处理24 h可降低细胞存活率（P<0.001），表明ALI细胞模型成功建立。与LPS模型组相比，LPS+UXP组和LPS+DEX组的细胞存活率升高（P<0.001，图10A）。AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术结果显示，LPS刺激增加了Beas-2b细胞的凋亡率（早期与晚期凋亡细胞总和）（P<0.001），而UXP和DEX干预后，细胞总凋亡率较LPS模型组降低（P<0.001，图10B、C）。

2.10 UXP对LPS诱导的Beas-2b细胞氧化应激、粒体膜电位的影响

DCFDA荧光探针检测结果显示，LPS刺激后，ROS荧光强度明显增强，细胞内ROS水平较对照组升高。经UXP和DEX药物干预后，ROS荧光强度明显减弱，提示UXP和DEX都能够有效清除LPS诱导产生的过量ROS，缓解细胞的氧化应激状态。在ROS水平升高的同时，伴随有细胞内谷胱甘肽（GSH）的耗竭与线粒体膜电位的显著降低，且这些指标的变化幅度与细胞损伤程度相关（图11A）。

MitoTracker荧光染色结果显示，对照组细胞线粒体网络清晰，红色荧光强度高；而LPS模型组细胞线粒体呈碎片化，荧光强度减弱，表明线粒体膜电位下降。经UXP和DEX药物干预后，线粒体形态得到改善，荧光强度明显恢复，说明UXP和DEX都具有稳定线粒体膜电位、保护线粒体功能的作用（图11B）。

2.11 UXP对LPS诱导的Beas-2b细胞脂质过氧化和铁死亡的影响

LipoFluo流式检测结果显示，LPS刺激提高了细胞的脂质过氧化水平（P<0.001），而UXP和DEX药物处理可有效降低此水平（P<0.001）。FerroOrange探针检测结果显示，LPS模型组细胞内Fe²⁺水平升高，UXP和DEX药物干预后Fe²⁺水平下降（P<0.001，图12）。

3 讨论

ALI主要发病机制是失控的局部或全身炎症反应，在此过程中，活化的巨噬细胞可大量释放TNF-α、IL-1、IL-8等促炎细胞因子，诱发炎症级联反应^［24］。在ALI/ARDS的炎症发生发展中，NF-κB、JAK/STAT等信号通路发挥关键调控作用，此外，细胞凋亡与自噬等机制也是重要致病因素^{［25， 26］}。已有研究显示，苍术素、姜黄素等中药成分在动物实验中具有一定的缓解肺组织损伤与炎症的作用^{［27， 28］}，但此类研究多局限于单一模型，且缺乏规范的阳性对照。本研究采用体内外双重实验体系（C57BL/6小鼠ALI模型及LPS诱导的Beas-2b细胞损伤模型），并设置DEX作为阳性对照，验证了UXP的抗炎效果与优势。体内实验结果表明，UXP和DEX均可减轻LPS诱导的ALI病理改变。其潜在作用机制可能与抑制炎症反应、缓解氧化应激、抑制NF-κB/STAT3信号通路活化以及保护线粒体功能密切相关。在体外实验中，UXP可提高LPS诱导的Beas-2b细胞存活率，并抑制细胞凋亡，进一步从细胞层面验证了其抑制损伤能力。

肺泡是肺部的基本功能单元，是实现气体交换的重要场所。肺泡功能障碍会导致肺气血屏障破坏及免疫细胞的过度激活，引发蛋白性水肿和炎症细胞在肺泡腔内聚集，最终导致严重的肺炎症和组织损伤^［29］。本研究通过对UXP、GXP进行等效剂量HE染色病理学观察，对不同制剂形式和剂量范围进行初步筛选。基于HE染色反映的整体病理改善情况，选择UXP高剂量组作为后续机制研究的干预条件，以保证干预效应的稳定性和可重复性。本研究中，LPS模型组小鼠出现典型的急性肺损伤表现，包括肺泡破裂、炎性细胞大量浸润和肺水肿加重（肺指数及W/D比升高）。而UXP干预后，上述病理变化得到缓解，肺组织损伤程度减轻，提示UXP对ALI具有明显的保护作用。在ALI动物模型中，支气管肺泡灌洗液（BALF）及肺组织中趋化因子和细胞因子水平的升高是炎症反应的重要特征，包括IL-8或其小鼠同源物MCP-1，以及IL-6、TNF-α、IL-1β等^［30］。本研究显示，LPS组BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平及肺组织中上述因子mRNA表达均升高，进一步从分子层面证实其显著的抗炎作用。有研究主要从炎症因子水平变化的角度阐述了ALI的病理过程^［31］，而本研究不仅验证了相关因子表达，还进一步揭示了UXP在抑制炎症因子释放方面的显著效果，突出了UXP在抗炎机制中的潜在优势。现有研究表明，肺泡巨噬细胞和中性粒细胞在ALI的炎症调控及感染防御中起核心作用，但其过度活化会诱发微血管功能障碍、血栓炎症反应以及直接的肺组织损伤^{［32， 33］}。本研究流式细胞术结果显示，UXP能显著减少中性粒细胞和巨噬细胞在肺部的浸润，进一步减轻组织损伤。尽管已有研究强调了免疫细胞过度活化在ALI发病机制中的关键地位^［34］，但本研究通过流式细胞术明确了UXP对中性粒细胞和巨噬细胞浸润的具体抑制作用，为该药物的免疫调节机制提供了更直接的实验证据。

NF-κB信号通路是ALI及ARDS发生发展的关键分子机制之一^［35］。既往研究发现，薤白中的活性成分可有效抑制炎症介质产生，通过下调p-NF-κB表达发挥抗炎活性^［36］。研究发现大蒜油补充剂通过抑制 NF-κB信号通路能预防LPS诱导的急性肺损伤^［37］。除NF-κB通路外，其他信号轴亦参与肺损伤调控，已有报道提示，调控IL-10/STAT3/NLRP3轴可减轻LPS诱导的ALI，为ALI治疗提供了新策略^［38］。有研究报道过薤白散能调控ERK/STAT3通路来缓解ALI^［39］，而本研究结果进一步拓展了其机制，证实UXP能同步抑制NF-κB与STAT3活化，表现为p-NF-κB/NF-κB及p-STAT3/STAT3比值下降，提示其可能通过阻断炎症信号通路发挥保护作用。相较于多数研究仅聚焦单一通路（NF-κB或STAT3），UXP的“双通路协同抑制”体现了中药复方的多靶点优势。

氧化应激是ALI病理过程中不可忽视的重要机制，过量的ROS可导致脂质过氧化，进一步破坏细胞结构和功能^{［40， 41］}。本研究发现，LPS模型组肺组织中抗氧化物SOD和GSH水平降低，MDA含量明显升高，提示氧化应激负荷增加。而UXP干预后恢复SOD和GSH水平，降低MDA积累，显示较强的抗氧化作用。在细胞层面，UXP同样表现出显著的保护效应：能够有效抑制LPS诱导的细胞内ROS水平升高，从而缓解氧化应激状态。值得注意的是，持续的氧化应激不仅是炎症反应的结果，也是触发脂质过氧化和铁稳态紊乱的重要上游事件。与大多数中药研究仅停留于抗氧化或抗炎维度^［25］不同，本研究进一步关注了铁死亡在ALI 中的潜在参与作用。本研究数据表明，UXP可降低脂质过氧化水平并减少细胞内游离 Fe²⁺的累积，提示其可能在缓解炎症和氧化应激的基础上，对铁死亡过程具有一定的干预作用。这可能与UXP富含有机硫化合物等多种活性成分有关，有待进一步分离纯化并探究具体机制。此外，线粒体功能障碍在ALI发生发展中同样发挥重要作用，既影响细胞能量代谢，也参与调节氧化应激和细胞死亡^［42］。本研究通过TEM观察发现，LPS模型组肺组织线粒体明显受损，表现为肿胀、嵴断裂及膜结构破坏，而UXP干预后线粒体超微结构显著改善，提示其具有潜在的线粒体保护作用。细胞实验中，MitoTracker荧光染色结果进一步证实，UXP能有效逆转LPS导致的线粒体膜电位崩溃。线粒体作为细胞的能量和凋亡调控中心，其功能稳定是抑制凋亡、维持氧化还原平衡的基础。因此，UXP对线粒体功能的保护，可能为其缓解氧化应激并间接抑制铁死亡等细胞损伤过程提供重要基础。尽管已有研究探讨铁死亡在ALI/ARDS中的作用，如YAP1通过抑制铁蛋白自噬介导的铁死亡来缓解急性肺损伤^［43］，但尚少见中药制剂系统研究“铁死亡机制与线粒体膜电位崩溃”在ALI中的整合作用。本研究结果表明，UXP在“抗炎-抗氧化-调控铁死亡-保护线粒体功能”这一连续调控链上发挥协同作用，为阐释中药多靶点、整合性作用特点提供了新的实验依据。

综上所述，本研究通过体内外实验相结合的方式，证实了UXP在小鼠ALI模型中有显著的抗炎、抗氧化和组织保护作用。其作用机制可能与抑制NF-κB/STAT3信号通路活化、缓解炎症诱导的氧化应激失衡及维持线粒体功能有关，细胞实验进一步揭示，UXP可能在炎症-氧化应激轴的下游，对铁死亡等细胞损伤执行过程产生继发性调控作用。值得注意的是，与DEX相比，UXP在多数指标上展现出相似或更优的效果，提示其可能具备类激素的抗炎效应，但不具备糖皮质激素相关的不良反应，具有良好的安全性和临床应用潜力，尤其适合慢性疾病的长期辅助治疗。未来可进一步对其活性成分进行深入研究，并在更高动物层面和临床试验中验证其疗效和安全性，为ALI的防治提供新的理论依据和干预策略。本研究仍存在一定局限性，未在体内水平直接采用铁死亡特异性抑制剂或遗传学手段验证UXP对铁死亡通路的调控作用、尚未探讨其他可能参与的信号通路如MAPK、NLRP3等的作用机制，相关问题有待后续深入研究。

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