miR-143-3p通过靶向KRAS/RalA通路抑制星形胶质细胞活化并缓解坐骨神经分支选择性损伤小鼠神经病理性疼痛

miR-143-3p alleviates neuropathic pain in mice with spared nerve injury by targeting the KRAS/RalA pathway and inhibiting astrocyte activation

摘要

目的 探讨微小RNA（miR-143-3p）在神经病理性疼痛中的治疗作用，阐明其靶基因及相关分子机制。 方法 对8周龄雄性C57BL/6J小鼠建立坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型，假手术组作为对照，治疗组于SNI后第7天单次鞘内注射miR-143-3p agomir，KRAS激动剂组在miR-143-3p agomir的基础上，SNI后第8天单次鞘内注射KRA-533，6只/组。采用vonFrey纤维丝检测术侧足底机械痛阈。miRNA靶基因预测和生物信息学分析用于筛选潜在靶点及相关信号通路。建立脂多糖诱导的C8-D1A星形胶质细胞炎症模型，用或不用miR-143-3p mimic和KRA-533进行干预。qRT-PCR、Western blotting检测基因和蛋白表达。免疫荧光用于脊髓形态学及细胞增殖活性观察。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测促炎因子水平。 结果 单次鞘内注射miR-143-3p agomir可显著提高SNI小鼠术侧后足的机械痛阈，效果持续近3周（P=0.048）。生物信息学确定KRAS是miR-143-3p的直接下游靶点。体内过表达miR-143-3p可显著抑制KRAS表达（P<0.0001），并抑制下游RalA/TBK1/NF-κB信号通路的激活，进而抑制星形胶质细胞活化和炎症因子白细胞介素-6（P<0.0001）、白细胞介素-1β（P<0.0001）、α肿瘤坏死因子上调（P=0.007）。KRAS激动剂KRA-533可显著逆转miR-143-3p的镇痛作用（P=0.01），以及对下游通路激活、细胞活化和神经炎症的抑制效应。体外过表达miR-143-3p可显著抑制LPS诱导的非经典Ras信号通路激活、细胞增殖活性及炎症水平，这些均可被KRA-533逆转。 结论 miR-143-3p通过靶向KRAS调控非经典Ras信号通路，抑制星形胶质细胞活化及神经炎症，从而缓解神经病理性疼痛，为该疾病的治疗提供了新的理论依据。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effect of microRNA (miR-143-3p) on neuropathic pain in mice and clarify its target gene and molecular mechanism. Methods Spared nerve injury (SNI) models were established in 8-week-old male C57BL/6J mice, with sham-operated mice as the control group (n=6). The treatment group received a single intrathecal injection of miR-143-3p agomir on day 7 after SNI modeling, and in KRAS agonist group, KRA-533 was intrathecally injected on day 8 following miR-143-3p agomir injection. Mechanical withdrawal thresholds of the ipsilateral paw of the mice were measured using von Frey filaments. Bioinformatics analyses were used to explore the potential targets and signaling pathways. In a C8-D1A astrocyte model of lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, the effect of miR-143-3p mimic and KRA-533 on the expressions of the identified targets were detected using qRT-PCR and Western blotting. Spinal morphology in the mouse models and proliferative activity of C8-D1A cells were observed with immunofluorescence staining, and the levels of pro-inflammatory factors were determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results miR-143-3p agomir significantly increased mechanical withdrawal thresholds of SNI mice, and the effect lasted nearly 3 weeks. KRAS was identified as a direct target of miR-143-3p. In SNI mouse models, miR-143-3p significantly inhibited KRAS expression, RalA/TBK1/NF-κB signaling pathway activation, and astrocyte activation, and upregulated the levels of IL-6, IL-1β, and TNF-α. The KRAS agonist KRA-533 significantly reversed the analgesic effect of miR-143-3p and its inhibitory effects on downstream pathway activation, astrocyte activation, and neuroinflammation. In C8-D1A cells, overexpression of miR-143-3p effectively suppressed LPS-induced noncanonical Ras pathway activation and inhibited cell proliferation and inflammatory response, which were reversed by treatment with KRA-533. Conclusion miR-143-3p overexpression alleviates neuropathic pain in mice by targeting KRAS to regulate the noncanonical Ras pathway and inhibiting astrocyte activation and neuroinflammation, suggesting a new strategy for clinical treatment of SNI.

Graphical abstract

神经病理性疼痛是由于外周到中枢的神经系统损伤所致的躯体功能障碍性疾病，主要表现为异常性疼痛和痛觉过敏^{［1， 2］}。据报道，其全球发病率为7%~10%，且受人口老龄化、癌症及代谢性疾病高发的影响，发病率逐年上升，已成为世界范围内的重大公共卫生问题^［3］。目前的临床治疗以全身药物（三环类抗抑郁药、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、阿片类等）、局部干预（5%利多卡因贴剂等）及神经调控技术（重复经颅磁刺激等）为主^［4］。这些手段虽能部分缓解疼痛，但易出现头晕、嗜睡、药物依赖等不良反应，整体疗效欠佳^［5］。因此，开发针对神经病理性疼痛的新型靶向药物意义重大。

微小RNA（miRNA）是长度约19~22个核苷酸的非编码RNA，通过抑制靶mRNA翻译或促进靶mRNA降解来调控基因表达^［6］，在神经病理性疼痛的发生、慢性化中具有重要意义^［7］。本课题组前期发现，人胎盘间充质干细胞外泌体对神经损伤性疼痛有显著镇痛效果，miRNA测序筛选出高富集的miR-143-3p^［8］。星形胶质细胞是脊髓中最丰富的胶质细胞，其活化及反应性增生可通过促炎因子调控突触微环境，驱动神经炎症与中枢敏化^［9］。已有研究显示，miR-143-3p可调控星形胶质细胞功能参与缺血性脑损伤^［10］，并在骨癌痛^［11］、骨关节炎^［12］中发挥抗炎的关键作用。然而，miR-143-3p在神经病理性疼痛中的作用机制尚未明确，仅一项研究报道坐骨神经分支选择性损伤（SNI）后3 d鞘内注射慢病毒介导的miR-143-3p可预防疼痛慢性化^［13］。基于此，本研究利用SNI小鼠模型，结合生物信息学与分子实验，创新性地发现并探讨了miR-143-3p的镇痛效应。机制上，miR-143-3p靶向抑制鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）及非经典Ras信号通路，从而抑制星形胶质细胞活化及神经炎症，为神经病理性疼痛的机制研究及精准药物开发提供了新的方向。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量20±2 g，购自广州市研成生物科技有限公司。所有小鼠均饲养在南方医科大学南方医院动物实验中心SPF级别动物房，拥有12 h标准光照和12 h黑暗周期，温度25 ℃，有充足水源和食物。本研究通过南方医院实验动物伦理委员会审批（伦理批号：IACUC-LAC-20250122-001）。

在第1阶段，18只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为3组：假手术组（Sham）、造模组（SNI/NC组）、治疗组（SNI/miR组），6只/组。在第2阶段，24只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：假手术组（Sham）、造模组（SNI/NC组）、治疗组（SNI/miR组）、KRAS激动剂组（SNI/miR/KRA-533组），6只/组。治疗组中miR-143-3p agomir鞘内注射剂量为2 nmol/只，根据课题组前期实验获得的最佳剂量^［8］。KRAS激动剂组给予1 mg/kg KRA-533进行鞘内注射。假手术组与造模组给予等量的agomir NC和药物溶剂。为满足行为学实验需求，每个阶段另需6只/组用于测定后足机械痛阈。

1.2 疼痛模型建立

采用SNI建立小鼠神经病理性疼痛模型，如前述^［14］。实验开始前先让动物适应环境3 d，之后用2%~5%七氟醚吸入麻醉，逐步分离左侧大腿区域的坐骨神经及其分支，将腓总神经和胫神经用5-0手术缝线结扎，远端剪断，同时去除远端1~2 mm神经组织。手术过程需保留完整的腓肠神经，术毕用4-0手术缝线间断缝合皮肤。对照组小鼠仅暴露坐骨神经及其分支，但不结扎和剪断。

1.3 细胞培养和处理

C8-D1A小鼠小脑星形胶质细胞购自北纳生物（细胞编号：BNCC339774），在37 ℃、含5%二氧化碳和95%空气的恒温箱中培养，培养体系为含有10%胎牛血清（Sigma-Aldrich）和1%青霉素/链霉素（Solarbio）的DMEM培养基（Gibco），培养基需每日更换。待细胞汇合至80%~90%，用0.25%胰蛋白酶（Solarbio）在37 ℃恒温箱中消化30 s，进行细胞传代和铺板，传代比例为1∶2。使用Lipofectamine 3000（ThermoFisher）转染miR-143-3p mimic或mimic NC（阴性对照序列），6 h后更换培养基，再用或不用脂多糖（LPS）（1 μg/mL）、KRAS激动剂KRA-533（5 μmol/L）和药物溶剂处理细胞12 h，收样进行后续操作。

1.4 实验药品

hsa-miR-143-3p agomir和agomir NC（苏州吉玛基因股份有限公司）使用DEPC水溶解，浓度为200 nmol/mL，现配现用，小鼠鞘内注射药物体积为10 μL；miR-143-3p mimic和mimic NC（苏州吉玛基因股份有限公司）使用无菌DEPC水溶解，转染终浓度为60 nmol/L。相应的序列为：hsa-miR-143-3p agomir与mimic（5'-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3'），agomir NC与mimic NC（5'-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3'）。LPS（Sigma-Aldrich）使用PBS缓冲液（博士德生物）溶解，以5 mg/mL储存；KRA-533（MCE）使用二甲基亚砜（Sigma-Aldrich）溶解，以1 mg/mL储存和细胞实验，小鼠鞘内注射给药剂量1 mg/kg。

1.5 小鼠鞘内注射

使用先前研究中的方法进行鞘内注射^［15］。将小鼠用2%~5%七氟醚吸入麻醉，剔除腰背部毛发，左手食指抵在腰椎棘突最高处（L6）的上方，第五腰椎间隙（L5~L6）即为注射点。用胰岛素针抽取药物溶液10 μL，将针头刺入脊椎间隙，待发现小鼠尾巴突然颤动或向两侧移动，固定针头位置，缓慢注射药物溶液，静止10 s后缓慢拔出针头，防止药物溢出。

1.6 后足机械疼痛阈值测定

使用von Frey纤维丝通过up-down法进行行为学检测^［16］。正式实验前3 d连续每天将小鼠放入底部为铁丝网架（9 cm×25 cm×25 cm）的玻璃盒中，使其充分适应实验环境和操作者，1 h/次。测试当天，先使小鼠适应30 min，然后使用一系列校准后的von Frey纤维丝（0.07~2.0 g）在术侧后足的跖侧表面施加作用力，保持纤维丝弯曲3~5 s，观察小鼠行为表现。测量完成后，根据up-down法计算公式记录小鼠术侧足底50%回撤阈值。测试人员对分组和处理不知情。

1.7 miRNA靶基因预测和生物信息学分析

miR-143-3p的靶基因预测由以下3个数据库完成：TargetScan、miRanda、microT。使用韦恩图（Venny 2.1.0）对3个数据库中的基因进行交集分析。使用David数据库（https：//davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp）对≥2个交集的共同靶基因进行基因本体论和KEGG途径富集分析。使用STRING 12.0和Cytoscape 3.10.0建立蛋白质相互作用网络。统计分析和可视化使用微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）。

1.8 RNA提取和qRT-PCR验证基因表达水平

使用TRIzol试剂（TaKaRa）从C8-D1A细胞系、小鼠L4-L5节段脊髓组织中提取总RNA，按照逆转录试剂盒（Vazyme）配好体系并上机进行逆转录。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen）进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR在ABI QuantStudio six flex仪器中进行。引物由睿博兴科生物技术有限公司合成，18S作为内参（表1）。

1.9 Western blotting试验

将C8-D1A细胞系、小鼠L4-L5节段脊髓组织在含有1×PMSF（碧云天）、1×磷酸酶抑制剂（碧云天）、1×蛋白酶抑制剂（碧云天）的RIPA裂解液（碧云天）中充分消化并提取蛋白。蛋白样品通过12.5% SDS-PAGE凝胶分离，并在电转移槽系统中转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上。使用快速封闭液（李记生物）对膜上非特异性靶标进行封闭10 min，之后在4 ℃下与一抗孵育过夜。一抗包括GAPDH鼠抗（1∶10000，Proteintech）、β-actin兔抗（1∶5000，Proteintech）、KRAS兔抗（1∶5000，Proteintech）、RalA兔抗（1∶1000，CST）、TBK1兔抗（1∶5000，Abmart）、p-TBK1兔抗（1∶1000，Abmart）、NF-κB兔抗（1∶5000，Abmart）、p-NF‑κB兔抗（1∶1000，Abmart），用一抗稀释液（碧云天）稀释抗体。TBST洗涤3次。使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（1∶10 000，Proteintech）和山羊抗鼠（1∶10 000，Proteintech）室温孵育1 h。TBST洗涤3次后，通过辣根过氧化物酶化学发光液（Millipore）检测免疫反应条带。获得的条带图像导入ImageJ 1.45p软件进行定量分析。

1.10 免疫荧光染色

小鼠L4-L5节段脊髓组织从体内取出并以20 μm的厚度进行冰冻切片。组织切片在室温下用4%多聚甲醛（Solarbio）固定10 min，随后在室温下用0.5% Triton-X100（Sigma-Aldrich）和3%牛血清白蛋白（Solarbio）进行破膜和封闭。C8-D1A细胞接种在共聚焦皿中进行上述固定、破膜和封闭操作。之后，脊髓切片、C8-D1A细胞与稀释的一抗共同孵育，4 ℃静置过夜。一抗包括KRAS兔抗（1∶200，Proteintech）、GFAP鼠抗（1∶1000，华安生物）、GFAP兔抗（1∶800，abcam）、NeuN鼠抗（1∶1000，华安生物）、Ki67兔抗（1∶500，Abmart），用封闭液进行稀释。次日将组织切片和细胞与对应种属的二抗在室温下共同孵育1 h，包括Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（1∶500，Abcam）和Alexa Fluor 594标记的山羊抗鼠 IgG（1∶500，Abcam）。最后，用含DAPI的抗荧光淬灭封片液（碧云天）封片。使用共聚焦LSM980显微镜（ZEISS）采集图像，并使用ZEISS ZEN 3.12软件处理。使用ImageJ 1.45p软件进行平均灰度值分析和阳性细胞计数。

1.11 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞因子水平

收集C8-D1A细胞上清，3000 r/min离心10 min去除颗粒和聚合物。小鼠L4-L5节段脊髓组织采用含1×蛋白酶抑制剂（碧云天）的PBS和3 mm氧化锆研磨珠（PYTHONBIO）进行研磨，收集蛋白上清液。根据制造商的说明书（艾方生物），通过ELISA测定白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、α肿瘤坏死因子（TNF-α）的浓度。使用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}。

1.12 统计学分析

样本量通过G*Power 3.1.9.7软件进行估算。参考相关文献的每组动物效应量，折算得效应量f=0.85。设定检验水准α=0.05（双侧检验）、检验效能1-β=0.80，经软件计算，每组最低需6只小鼠即可达到检验效能。统计分析使用GraphPad Prism 10.6.0软件，所有数值采用均数±标准差表示。采用单因素方差分析评估多组间差异，包括行为学结果以及Western boltting、qRT-PCR、免疫荧光、ELISA数据。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-143-3p减轻神经损伤诱导的机械性痛觉超敏，KRAS为潜在靶点

采用SNI构建神经病理性疼痛小鼠模型，第7天单次鞘内注射miR-143-3p agomir或agomir NC，并在接下来的4周进行机械痛阈值测定（图1A）。该结果显示，与Sham组相比，SNI/NC组小鼠左后足的50%回撤阈值在第7天显著降低（P<0.0001），而SNI/miR组在干预后第2天，该阈值相比SNI/NC组出现明显回升并持续3周（P=0.048，图1B）。接着，使用TargetScan、miRanda和microT数据库预测了miR-143-3p的靶基因，通过韦恩图筛选出342个≥2个交集的共同靶点（图1C）。利用David生物信息学资源进行基因本体论与KEGG通路富集分析，发现“自噬”和“Ras信号通路”被高度富集（图1D、E）。在SNI后第8天取L4-L5节段脊髓组织进行qRT-PCR验证，发现SNI/NC组中自噬分子DAPK1、ATG2B、GABARAPL1的表达较Sham组无明显改变（图1F）。相比Sham组，SNI/NC组中Ras信号通路分子MAPK1、NRAS、KRAS均明显上调（P<0.0001），且KRAS表达被miR-143-3p agomir显著抑制（P=0.004，图1G）。

2.2 外源性补充miR-143-3p能够明显逆转KRAS的上调

在SNI后第3、7天，脊髓中KRAS mRNA水平明显高于Sham组，尤其是第7天（P<0.001，图2A）。此外，KRAS蛋白表达也在第7天达到高峰（P=0.005，图2B、C）。TargetScan数据库证实了miR-143-3p序列与KRAS 3'UTR特异性结合位点在脊椎动物的高度保守性（图2D）。Western blotting也显示，相比于SNI/NC组，SNI后急性上调的KRAS能够被miR-143-3p agomir靶向抑制（P<0.0001，图2E、F）。

2.3 miR-143-3p调控KRAS/RalA/TBK1/NFκB信号通路

利用STRING网站与Cytoscape软件构建了Ras信号通路（图A）与高“Degree”值蛋白（图B）的蛋白质相互作用网络，找到KRAS的下游蛋白RalA。Western blotting显示，相比Sham组，SNI后第7天小鼠的L4~L5脊髓节段中RalA显著上调（P=0.01），TBK1（P=0.005）和NF-κB（P<0.0001）磷酸化水平也明显升高（图3C、D）。此外，与SNI/NC组相比，miR-143-3p agomir显著抑制了RalA表达（P<0.001）及TBK1（P<0.001）、NF-κB（P=0.01）磷酸化（图3E、F）。

2.4 miR-143-3p抑制脊髓星形胶质细胞KRAS表达、活化及神经炎症

小鼠脊髓L4-L5节段免疫荧光染色显示，与Sham组相比，SNI/NC组KRAS荧光强度在脊髓中显著上调（P=0.008），尤其术侧脊髓背角，SNI/miR组的荧光强度相比SNI/NC组显著降低（P=0.006，图4A）。40倍共聚焦图像中可以清晰看到，KRAS与星形胶质细胞（GFAP+）存在多处共定位，主要位于胞浆，而神经元（NeuN+）中没有观察到共定位情况（图4B）。进一步的GFAP染色发现，SNI/NC组星形胶质细胞明显活化，表现为胞体增大，突起长度增加，分支数增多，并向痛觉信号处理核心区（脊髓背角Ⅰ~Ⅱ层）迁移浸润，SNI/miR组中该表型受到抑制（图4C）。ELISA检测发现，与SNI/NC组相比，miR-143-3p agomir显著降低了脊髓促炎因子IL-6（P<0.0001）、IL-1β（P<0.0001）、TNF-α（P=0.007）的水平（图4D）。

Fig.4 miR-143-3p inhibits KRAS expression, astrocyte activation and neuroinflammation in spinal dorsal horn of SNI mice. A: Immunofluorescence staining and relative fluorescence intensity of KRAS (green) in L4-L5 spinal cord segments (Scale bar=200 μm). Ipsi: Ipsilateral; Contra: Contralateral. B: Immunofluorescent analysis revealed KRAS (green) localized mostly within GFAP astrocytes (red) and few within NeuN neurons (red) in L4-L5 spinal dorsal horn of SNI/NC group (Scale bar=20 μm). C: Immunofluorescence staining of GFAP (green) in L4‐L5 spinal dorsal horn (Scale bar= 50 μm). D: Levels of IL-6, IL-1β and TNF-α in L4‐L5 spinal cord tested by ELISA. The cell nuclei are stained blue with DAPI. **P<0.01 vs Sham group; ^##P<0.01, ^####P<0.0001 vs SNI/NC group (n=6).

2.5 miR-143-3p调控LPS刺激下C8-D1A细胞系中非经典Ras信号通路与炎症

采用LPS诱导C8-D1A细胞系构建炎症模型。与LPS/NC组相比，LPS/miR组的KRAS mRNA（P=0.004）及蛋白表达（P<0.001）被显著抑制（图5A~C）。与LPS/NC组比较，miR-143-3p mimic也明显抑制下游非经典Ras信号通路的激活（RalA：P=0.001，p-TBK1/TBK1：P<0.0001，p-NF-κB/NF-κB：P=0.009，图5D、E）；与LPS/miR组比较，这被KRAS激动剂KRA-533成功逆转（RalA：P=0.005，p-TBK1/TBK1：P<0.0001，p-NF-κB/NF-κB：P=0.01，图5D、E）。免疫荧光结果显示，与LPS/NC组相比，LPS/miR组中Ki67（细胞增殖特异性标志物）阳性细胞占比明显减小（P=0.001）；与LPS/miR组相比，KRA-533能够再次上升Ki67阳性细胞占比（P<0.001，图5F、G）。ELISA发现，与LPS/NC组相比，miR-143-3p mimic显著抑制LPS诱导的炎症因子IL-6（P<0.0001，图5H）、IL-1β（P<0.0001，图5I）、TNF-α（P=0.006，图5J）水平的升高，而KRA-533能够再次逆转miR-143-3p mimic的抗炎作用（IL-6：P=0.003，IL-1β：P=0.002，TNF-α：P=0.002，图5H~J）。

Fig.5 miR-143-3p suppresses lipopolysaccharide (LPS)‑induced proliferation and inflammation in C8-D1A cells through noncanonical Ras signaling. A-C: mRNA and protein levels of KRAS in each group. D, E: Western blotting of RalA, p-TBK1/TBK1, and p-NF-κB/NF-κB in each group. F, G: Immunofluorescence staining and analysis of Ki67-positive cell (green) rate in each group (Scale bar= 50 μm). H-J: Levels of IL-6, IL-1β and TNF-α in C8-D1A cells tested by ELISA. **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 vs SNI/NC group; ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001, ^####P<0.0001 vs SNI/miR group (n=6).

2.6 miR-143-3p对神经病理性疼痛的镇痛效应依赖非经典Ras通路

在小鼠鞘内注射miR-143-3p agomir的第2天给予KRA-533进行回复实验，并在接下来4周内进行机械痛阈值测定（图6A）。行为学结果显示，与SNI/miR组相比，鞘内注射KRA-533后小鼠术侧足底50%回撤阈值显著下降并持续近3周（P=0.01，图6B）。对小鼠L4~L5节段脊髓进行Western blotting检测，与SNI/miR组相比，KRA-533可显著逆转miR-143-3p agomir对RalA表达（P=0.02）、TBK1（P=0.02）及NF-κB（P<0.001）磷酸化的抑制效应（图6C、D）。免疫荧光检测揭示，KRA-533可逆转miR-143-3p agomir对星形胶质细胞激活和增殖的抑制作用（图6E）。ELISA进一步发现，相比于SNI/miR组，KRA-533干预后炎症因子水平再次升高（IL-6：P<0.0001，IL-1β：P=0.03，TNF-α：P=0.04，图6F）。

3 讨论

本研究通过单次鞘内注射和机械疼痛阈值测定，创新性地发现miR-143-3p在神经病理性疼痛中具有起效迅速、持续时间长达3周的显著镇痛效应，同时可有效抑制脊髓背角的星形胶质细胞活化与神经炎症。miR-143-3p在多种炎性疾病和慢性疼痛中发挥作用 ，Ni等^［11］证实脊髓过表达miR-143-3p可逆转骨癌痛相关痛觉行为，其在颞下颌关节骨关节炎^［12］、过敏性鼻炎^［17］中的抗炎效应也已被报道。然而，miR-143-3p在神经病理性疼痛中的具体作用及机制仍不明确。本研究的行为学结果为此提供了关键实验依据。

为明确miR-143-3p在神经病理性疼痛中的作用机制，我们运用多数据库靶基因预测及生物信息学分析，发现靶基因高度富集在Ras信号通路。进一步筛选显示，SNI后第7天脊髓中KRAS显著上调，miR-143-3p可有效抑制其mRNA及蛋白表达。该靶向关系在胰腺导管腺癌^［18］、结直肠癌^［19］、喉鳞状细胞癌^［20］中也被证实，故将KRAS确定为核心靶基因。KRAS是非经典Ras信号通路的关键上游分子，其参与神经病理性疼痛的病理过程。Cronin等^［21］在神经损伤模型中证实，KRAS在背根神经节及受损坐骨神经中激活，通过上调GTP环化水合酶1转录与四氢生物蝶呤合成诱发痛觉超敏，但脊髓中其未通过该代谢通路介导疼痛。为探究KRAS下游机制，本研究通过蛋白互作网络筛选出Ras样原癌基因A（RalA）。RalA作为响应非经典Ras信号的多功能GTP酶，对疼痛调控至关重要^［22］，其异常高表达参与下腰痛，抑制剂BQU57可通过NF-κB通路发挥抗伤害感受作用^［23］。本研究发现，SNI后第7天RalA显著上调，与疼痛表型及KRAS时序表达特征一致。此外，Ral蛋白可招募并激活TBK1，介导NF-κB激活与核转位^{［24， 25］}，而miR-143-3p可通过抑制KRAS、RalA蛋白表达，降低TBK1与NF-κB磷酸化水平。综上，miR-143-3p通过调控脊髓KRAS/RalA/TBK1/NF-κB非经典Ras通路在神经病理性疼痛中发挥关键作用。

神经病理性疼痛与脊髓神经炎症密切相关^［26］。脊髓星形胶质细胞增生活化可放大神经炎症，促进疼痛发生与维持^［27］。为明确miR-143-3p是否通过靶向星形胶质细胞活化缓解疼痛，我们通过免疫荧光及ELISA进一步验证。结果显示，SNI小鼠脊髓中上调的KRAS与星形胶质细胞显著共定位，且伴随星形胶质细胞增殖、浸润以及脊髓炎症水平升高，而miR-143-3p可有效抑制上述病理表型。为证实miR-143-3p通过星形胶质细胞中KRAS/RalA信号发挥作用，我们使用了KRAS激动剂KRA-533进行干预。该激动剂可持续激活KRAS下游信号并促进炎症反应^{［28， 29］}。体外实验中，利用LPS诱导小鼠星形胶质细胞系C8-D1A构建炎症模型，该细胞系可响应多种炎症信号^［30］。miR-143-3p能显著抑制LPS诱导的非经典Ras信号通路上调及细胞增殖，此效应被KRA-533显著逆转。同样地，我们对SNI小鼠进行KRA-533干预，成功逆转了miR-143-3p对脊髓中非经典Ras信号通路及星形胶质细胞增殖的抑制作用。以上结果表明，miR-143-3p通过靶向星形胶质细胞中KRAS及非经典Ras信号通路，发挥炎症消退作用。

星形胶质细胞与神经元间的双向互作是介导疼痛发生发展的关键环节^［31］。Xu等^［32］发现，星形胶质细胞中G蛋白偶联受体37样1缺失或功能下调会启动增生程序，导致谷氨酸转运体功能障碍、突触过度兴奋及中枢敏化。活化星形胶质细胞可过度释放γ-氨基丁酸，通过增强葡萄糖代谢诱发机械性痛觉过敏^［33］。本研究虽明确了miR-143-3p靶向星形胶质细胞相关信号的镇痛机制，但尚未阐明miR-143-3p对脊髓细胞交互的调控作用。未来的研究需从星形胶质细胞-神经元代谢通讯视角，系统揭示miR-143-3p在神经病理性疼痛中的完整调控网络。

综上所述，本研究首次明确miR-143-3p在神经病理性疼痛中的生物学功能及分子机制。神经损伤后，KRAS在脊髓后角中高表达，主要位于星形胶质细胞，miR-143-3p可靶向抑制KRAS及星形胶质细胞活化与增殖。机制上，miR-143-3p通过调控非经典Ras信号通路，抑制下游的RalA表达及TBK1、NF-κB磷酸化，从而下调促炎因子水平与脊髓神经炎症。本研究为开发miR-143-3p相关神经病理性疼痛药物提供了潜在靶点与依据。

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