重骨颗粒通过调控Nrf2通路改善膝骨关节炎肝肾亏虚证患者的软骨损伤

Chonggu Granules attenuate cartilage injury in knee osteoarthritis patients with liver-kidney deficiency syndrome by regulating the Nrf2 pathway

摘要

目的 基于网络药理学、分子对接与临床验证，探讨重骨颗粒通过调控软骨细胞铁死亡治疗膝骨关节炎（KOA）的潜在机制。 方法 通过TCMSP、GeneCards、OMIM及TTD数据库筛选重骨颗粒活性成分靶点及KOA、软骨细胞铁死亡相关靶点，取三者交集获取潜在作用靶点。利用Cytoscape 3.10.4构建“复方-成分-疾病-靶点”网络及蛋白质互作网络，筛选关键活性成分与核心靶点并进行分子对接验证。临床研究纳入62例KOA患者（随机分为观察组与对照组各31例）及20名健康受试者。对照组口服盐酸氨基葡萄糖片，观察组联合重骨颗粒治疗，疗程12周。采用ELISA检测各组血清中软骨损伤指标（MMP-13、CTX-II、COMP）及铁死亡相关指标（GPX4、ACSL4、4-HNE、Fe²⁺）水平，Real-time PCR检测Keap1、Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4 mRNA表达。 结果 筛选出重骨颗粒关键活性成分4种（槲皮素、圣草酚、山奈酚、黄芩素）及核心靶点5个（AKT1、TP53、IL-6、JUN、Nrf2）。富集分析提示其作用涉及癌症通路、AGE-RAGE及NFE2L2（Nrf2）等信号通路。分子对接显示活性成分与靶点结合良好，其中NFE2L2结合活性最佳。临床试验表明，重骨颗粒可显著上调Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4 mRNA表达（P<0.05），下调Keap1表达（P<0.05），并降低血清MMP-13、CTX-II、COMP、ACSL4、4-HNE、Fe²⁺水平（P<0.05），提高GPX4含量（P<0.05）。 结论 重骨颗粒通过槲皮素、圣草酚等关键活性成分作用于NFE2L2等靶点，激活Nrf2通路，调控铁死亡进程，从而减轻KOA软骨细胞损伤，体现多成分-多靶点-多通路的协同作用机制。

Abstract

Objective To explore the mechanism mediating the ameliorative effect of Chonggu Granules on cartilage injury in knee osteoarthritis (KOA). Methods Bioinformatics approaches were used for analyzing the active ingredients of Chonggu Granules, their potential targets, the KOA- and ferroptosis-related genes, and their intersection genes. A compound-ingredient-disease-target network and the protein-protein interaction (PPI) network were constructed to identify the key active ingredients and core targets, which were verified by molecular docking studies. In the clinical trial, 62 KOA patients were randomly assigned into the observation group and control group (n=31) for treatment with glucosamine hydrochloride tablets and additional Chonggu Granules for 12 weeks, respectively, with 20 healthy participants serving as the healthy control group. Serum levels of cartilage injury markers (MMP-13, CTX-II, and COMP) and ferroptosis-related indices (GPX4, ACSL4, 4-HNE, and Fe²⁺) were measured using ELISA, and expressions of Keap1, Nrf2, SLC7A11, HO-1, and GPX4 mRNAs were determined with real-time PCR. Results Four key active ingredients (quercetin, eupatilin, kaempferol, and wogonin) of Chonggu Granules and 5 core targets (AKT1, TP53, IL-6, JUN, and Nrf2) were identified, which were involved in cancer, AGE-RAGE signaling, and the NFE2L2 (Nrf2) signaling pathways. Molecular docking showed strong binding between the active compounds and their targets, with NFE2L2 exhibiting the highest binding affinity. Compared with the control patients, KOA patients treated with Chonggu Granules showed significantly upregulated Nrf2, SLC7A11, HO-1, and GPX4 mRNA expressions (P<0.05), downregulated Keap1 expression (P<0.05), reduced serum levels of MMP-13, CTX-II, COMP, ACSL4, 4-HNE, and Fe²⁺ (P<0.05), and increased GPX4 level (P<0.05). Conclusion Chonggu Granules alleviate KOA through its key active ingredients quercetin and eupatilin, which activate the Nrf2 signaling pathway to modulate ferroptosis by targeting NFE2L2 and other therapeutic targets, suggesting a multi-component, multi-target, and multi-pathway synergistic mechanism for ameliorating chondrocyte injury in KOA.

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 重骨颗粒 / 网络药理学 / 软骨细胞 / 铁死亡

Key words

knee osteoarthritis / Chonggu Granules / network pharmacology / chondrocytes / ferroptosis

骨关节炎（OA）是一种以关节软骨退行性改变的关节疾病。作为最常见的OA亚型，膝关节骨关节炎（KOA）的病理变化复杂，表现为软骨下骨病理变化、骨赘形成，并受滑膜炎症、软骨下骨重塑及铁过载等因素的影响^［1］。KOA易感性受基因遗传、年龄和性别的影响，其中年龄是最重要的危险因素，随着全球老龄化的到来，KOA的发病率正在迅速增加^［2］。有研究表明，中国≥45岁的成年人中，4年内症状性KOA的累积发生率为8.5%，这不仅大幅度降低了患者的生活质量，也对社会造成了极大的负担^［3］。研究发现铁死亡与OA的发病过程中发挥重要作用，其主要机制是脂质过氧化物的异常积累破坏细胞膜稳定性，诱发软骨细胞损伤和死亡，从而加重氧化应激与炎症反应，促进细胞外基质（ECM）降解，加速OA进程。在铁死亡的过程中，转录因子核因子E2相关因子2（Nrf2）发挥着核心调控作用，能够靶向调节包括血红素加氧酶-1（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）及铁稳态相关的大量关键基因^［4］。Nrf2/GPX4信号通路作为细胞内重要的抗氧化应激调节通路，在OA的发病机制、进展过程以及预防策略中展现出显著的治疗潜力^［5］。当前KOA的治疗策略主要提供暂时的疼痛缓解，不同的药物治疗KOA的作用靶点和机制各有不同，且不能随着KOA的进展有效阻止软骨退化，难以抓住KOA的病理变化和发病机制的关键^［6］。

KOA在中医上归属“骨痹”范畴，其病机关键在于肝肾亏虚为本、风寒湿邪阻滞为标的虚实夹杂状态。经研究发现中医药能通过多种途径及机制在延缓KOA疾病进展方面发挥重要作用^［7］。然而，目前关于中药复方通过活性成分作用于Nrf2通路调控铁死亡改善KOA软骨损伤的机制仍缺乏系统研究。重骨颗粒作为安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂，具有补益肝肾、壮骨强筋之效。前期研究显示经重骨颗粒干预后，在减轻患者的疾病活动，改善软骨损伤，延缓疾病进展方面发挥积极作用^［8，9］。本研究拟通过网络药理学、分子对接及临床验证相结合的方法，筛选重骨颗粒的活性成分及其潜在作用靶点，结合临床验证分析其对Nrf2信号通路的干预作用，以期为临床应用及KOA新型治疗策略的开发提供理论支持。

1 资料和方法

1.1 网络药理学及分子对接研究内容

1.1.1 建立“重骨颗粒-活性成分-靶点”机制网络

借助TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）并结合文献检索，以药物口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为标准，筛选重骨颗粒（牛膝、杜仲、桑寄生、骨碎补、海螵蛸、千年健、鹿衔草）的主要活性成分和对应靶点。利用UniProt数据库（https：//www. uniprot.org/）对靶点蛋白进行基因名标准化并去重获得重骨颗粒调控的基因集，利用Cytoscape3.10.4软件构建“复方-成分-靶点”的相关作用调控图。

1.1.2 软骨细胞铁死亡及膝骨关节炎相关靶点获取

分别以Chondrocyte、Chondrocyte Ferroptosis、knee osteoarthritis为关键词，在GeneCards （https：//www. genecards.org/），OMIM（https：//omim.org/）及Thera-peutic Target Database （http：//db.idrblab.net/ttd/）数据库进行检索，合并后去除重复靶点，得到KOA和软骨细胞铁死亡的相关靶点。将三者靶点通过在线VENN平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）获取交集靶点，绘韦恩图，作为重骨颗粒经软骨细胞铁死亡途径治疗膝骨关节炎的潜在靶点。

1.1.3 “重骨颗粒复方成分-疾病-靶点”网络的构建

借助CytoScape 3.10.4软件对复方活性成分、靶点和KOA及软骨细胞铁死亡靶点构建“复方-成分-靶点-疾病网络”。

1.1.4 蛋白互作网络（PPI）分析

将重骨颗粒与膝骨关节炎、软骨细胞铁死亡所交集靶点输入STRING数据库，设定种属为Homo sapiens”，构建PPI网络并导出TSV格式文件。通过Cytoscape3.10.4软件进行可视化并通过NetworkAnalyzer工具筛选Degree值为前10位作为核心靶点。

1.1.5 重骨颗粒方与KOA软骨细胞铁死亡靶功能及途径的富集分析

基于Metascape平台对共有靶点进行功能注释，设置物种为“Homo sapiens”，分别进行GO功能和KEGG通路富集分析，选取显著富集结果（P<0.01），获得富集且与KOA软骨细胞铁死亡密切相关的生物过程及信号通路。通过微生信平台（www.bioinformatics.com.cn）实现可视化呈现。

1.1.6 分子对接

针对筛选出的核心靶点和化合物进行分子对接，从TCMSP数据库中获取配体的MOL2格式，通过Pubchem数据库获取化合物的SDF 3D格式，核心靶点的PDB三维结构可从PDB数据库（https：//www.rcsb. org/）中获得。然后使用AutoDock4软件对活性成分和靶标蛋白进行去除水分子、加氢、优化电荷，并计算结合能，通过PyMOL软件可视化展示。

1.2 临床资料与方法

1.2.1 一般资料

纳入2023年1月~2024年6月就诊于安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科的62例KOA患者，采用随机数字表将其分为观察组和对照组。随访过程中对照组出现2例不良反应（头晕乏力、胃肠道不良反应各1例），经对症处理后缓解。观察组年龄为53.06±7.89岁，病程9.97±3.53年；对照组年龄为53.29±8.96岁，病程9.81±3.19年。两组基线资料具有可比性（P>0.05）。另选取20例健康体检者作为健康组。本研究经安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会审批（伦理批号：2022AH-34）。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2.2 诊断及纳排标准

诊断标准：西医诊断参照1986年美国风湿病学会（ACR）颁布的膝骨关节炎临床及影像学分类标准^［10］；中医辩证标准参照《膝骨关节炎中西医结合诊疗指南（2023年版）》中肝肾亏虚证相关标准。纳入标准：满足上述KOA中西医诊断标准；年龄在40~75（含）周岁；Kellgren-Lawrence分级符合I~Ⅲ级；近半年未使用相关治疗药物，未接受膝关节置换术或其他关节手术；排除标准：对本研究中药物过敏者以及不能满足前面诊断条件的；除OA引发软骨损伤的其他骨关节疾病；近6个月内有关节内注射史；有生育计划或处于妊娠期或哺乳期妇女；患有肝炎、结核患者；有肝肾、血液系统等严重损害者；依从性差的患者。

1.2.3 干预方案

对照组采用盐酸氨基葡萄糖片（规格：0.75 g，江苏正大清江制药有限公司，国准号：H20060647）。服用方法：2次/d，1粒/次，口服，疗程共计12周。

上联合应用重骨颗粒方，组方包括杜仲、牛膝、桑寄生、千年健、鹿衔草、海螵蛸各10 g、骨碎补9 g，（由本院制剂中心统一制备）。服用方法：1剂/d，早晚分服，疗程共计12周。

1.2.4 检测指标及方法

1.2.4.1 中医证候积分

参照《膝骨关节炎中西医结合诊疗指南（2023年版）》及2010年国家中医药管理局制定的骨痹治疗方案中“KOA中医症状量化评分标准和证候疗效判定标准”执行。对肝肾亏虚型临床症状（关节隐痛、屈伸不利、潮热盗汗、腰膝酸软、周身乏力）进行观察。按程度轻、 中、重度分别计2、4、6分，舌象不计分。

1.2.4.2 软骨损伤相关指标

收集健康体检人群及 KOA 患者治疗前后各5 mL的静脉血，用ELISA法检测基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、II型胶原C端肽（CTX-II）及软骨寡聚基质蛋白（COMP）水平，试剂盒由武汉基因美科技有限公司提供。

1.2.4.3 铁死亡相关标志物

采用ELISA法检测患者治疗前后血清GPX4、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）及铁离子水平。试剂盒由武汉基因美科技有限公司提供。

1.2.4.4 Nrf2通路关键分子及铁死亡相关基因的表达水平

嘱患者空腹并采其静脉血，置于EDTA抗凝管中，摇晃混匀后静置20 min，加入1 mL TRIzol裂解，离心10 min取上清，加入0.5 mL异丙醇混匀，-20 ℃孵育30 min，按照RNA Trizol Reagent试剂说明书提取总RNA，将RNA逆转录得到cDNA后进行Real-Time PCR测定外周血血清中Keap1、Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4 mRNA相对表达量（cDNA逆转录试剂盒及PCR扩增试剂盒由赛默飞世尔科技有限公司提供），反应条件为95 ℃预变性1min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，循环40次。以β-actin作为基因表达测定的内部对照，表达量以2^-ΔΔCT表示。引物序列由安徽中抗生物技术有限公司合成并提供（表1）。

1.2.5 统计学分析

使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 10软件进行统计学分析与可视化。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布数据以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析结果

2.1.1 复方-活性成分-靶点网络

经TCMSP数据库检索及数据清洗（剔除无对应靶基因及重复成分），最终从重骨颗粒7味中药中鉴定出48个活性成分及其对应的258个潜在靶基因。各中药、活性成分与靶点间的相互作用网络（图1）。

2.1.2 KOA、软骨细胞铁死亡相关靶点的获取

通过数据库检索筛选后共获得KOA相关靶点1737个，软骨细胞铁死亡相关靶点744个（表2）。经Venny分析取交集得到47个共同靶点（图2），该交集靶点集可作为重骨颗粒经软骨细胞铁死亡途径治疗KOA的潜在作用靶点。

2.1.3 复方-成分-靶点-疾病和PPI网络构建

基于活性成分与交集靶点的对应关系，利用Cytoscape 3.10.4构建“复方-成分-靶点-疾病”交互网络（图3）。进一步进行拓扑参数分析，根据Degree值筛选出连接度最高的前5个化合物作为核心活性成分，分别为MOL000098（槲皮素，degree=43）、MOL002914（圣草酚，degree=21）、MOL000422（山奈酚，degree=18）、MOL000173 （汉黄芩素，degree=14）和MOL002714（黄芩素，degree=10）。

2.1.4 PPI网络分析

通过STRING和Cytoscape3.10.4软件构建交集靶点的PPI网络（图4、5），共包含47个节点，785条边。并通过cytoHubba插件对Degree值进行排序，筛选出前十位的靶点分别为AKT1、IL1B、TP53、IL6、JUN、BCL2、TNF、TGFB1、EGFR、PTGS2。

2.1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

GO分析表明，靶基因显著参与细胞凋亡信号调控、细胞迁移与增殖等生物过程，并在分子功能上集中于泛素样蛋白连接酶结合、转录因子结合等条目（图6）。KEGG通路分析显示癌症通路、AGE-RAGE信号通路及NFE2L2（Nrf2）信号通路都处于参与软骨细胞铁死亡调节的前列（图7）。

2.2 分子对接结果

选取槲皮素、圣草酚、山奈酚及汉黄芩素作为配体，与AKT1、TP53、IL-6、JUN、Nrf2等靶点蛋白进行分子对接。AutoDock Vina计算结果提示，核心靶点与活性成分的结合能范围为-9.7~-5.7 kcal/mol（表3）。选取结合能较低的复合物进行三维相互作用可视化（图8）以揭示其结合模式。其中各配体与NFE2L2的结合能普遍最优，分别为-9.7 kcal/mol（圣草酚）、-9.7 kcal/mol（山奈酚）、-9.6 kcal/mol（槲皮素）和-8.8 kcal/mol（汉黄芩素），显著低于其他靶点的结合能值，提示NFE2L2可能是这些成分共同作用的关键靶点。

2.3 临床试验验证

2.3.1 中医症候积分比较

治疗后两组患者中医证候积分均较治疗前降低（P<0.05），且观察组变化相较于对照组更为明显（P<0.05，表4）。

2.3.2 两组患者软骨损伤指标比较

治疗前，两组患者的MMP-13、CTX-II、COMP水平差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后，观察组的MMP-13、CTX-II、COMP水平降低（P<0.05）；且变化较对照组明显（P<0.05，表5）。

2.3.3 两组患者铁死亡相关标志物指标比较

治疗前，两组患者的GPX4、ACSL4、4-HNE、铁离子水平差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后，观察组的GPX4水平上升、ACSL4、4-HNE、铁离子水平降低（P<0.05）；且变化较对照组明显（P<0.05，表6）。

2.3.4 各组mRNA表达量的比较

治疗前，两组患者的Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4、Keap1相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后，观察组的Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4相对表达量升高，Keap1相对表达量降低（P<0.05）；且变化较对照组更明显（P<0.05，表7）。

治疗前，对照组和观察组的Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4相对表达量低于正常组，Keap1相对表达量高于正常组（P<0.05），两组差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，观察组的Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4相对表达量升高，Keap1相对表达量降低（P<0.05）；对照组在治疗前后的差异无统计学意义（P>0.05）。观察组的Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4相对表达量高于同期对照组，Keap1相对表达量低于同期对照组（P<0.05，表7）。

3 讨论

本研究应用网络药理学构建并分析重骨颗粒方通过软骨细胞铁死亡途径治疗KOA的“成分-疾病-靶点”网络，并进行临床试验进行验证。研究筛选确定槲皮素、圣草酚、山奈酚、汉黄芩素是重骨颗粒治疗KOA的主要活性成分。Ruan等^［11］研究发现槲皮素可通过沉默信息调节因子2相关酶1/核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1信号通路抑制软骨细胞氧化损伤和铁死亡，发挥软骨保护作用，有效缓解大鼠OA进展。多项研究证实圣草酚、山奈酚均能通过减轻软骨细胞炎症反应、减少细胞外基质降解及细胞凋亡发挥骨关节炎保护作用^［12-14］。基于PPI网络筛选出核心靶点有AKT1、IL1B、IL6、BCL2、TNF、TGFB1等。且NFE2L2（Nrf2）在网络中发挥重要作用。通过分子对接实验发现核心活性成分和核心靶点均表现出一定的结合能力。其中各活性成分与Nrf2的结合能普遍最优。提示Nfr2可能是这些成分共同作用的关键靶点。

基于上述结果，我们进一步将Nfr2确定为核心靶点，并计划围绕其开展后续的信号通路富集分析与功能验证，以深入探讨这些活性成分在调控抗氧化应激及相关生理过程中的分子机制。本研究基于对KOA软骨细胞铁死亡靶点的深入探索，发现联合中药复方发挥多种活性成分和多靶点效应，可能是KOA治疗的新方向。为进一步明确重骨颗粒在KOA治疗过程中的作用机制，进行GO功能及KEGG通路分析，GO富集结果反映了重骨颗粒治疗KOA发挥主要作用机制与细胞凋亡信号调控、细胞迁移与增殖、转录调控复合体及膜信号结构域等生物过程有关，这与课题组前期研究结果相符^［15］。KEGG通路富集分析鉴定了155种相关细胞通路，主要包括癌症、细胞衰老、细胞周期、AGE-RAGE及NFE2L2（Nrf2）等信号通路，其中NFE2L2（Nrf2）信号通路在该网络中发挥较突出的作用。初步预测出重骨颗粒治疗KOA的网络调控机制。据报道，AGE-RAGE信号通路是调控铁死亡的重要通路^{［16，17］}。AGEs通过扰乱铁稳态、促进氧化应激和抑制抗氧化系统，诱导铁死亡。Chen等^［18］提出AGEs是氧化应激和铁死亡的起源，AGEs与RAGE结合后激活一系列信号通路，主要通过NOX4等氧化酶促进活性氧（ROS）的生成。这些ROS不仅破坏细胞的红氧平衡，还通过促进脂质过氧化反应，进一步诱导铁死亡。此外，AGEs与RAGE结合还会促使Nrf2的降解，从而减少抗氧化基因的表达，使得细胞抗氧化能力减弱，增加ROS积累，导致细胞损伤继而发生铁死亡。研究表明Nrf2相关信号通路在骨关节炎的疾病活动中发挥重要作用，NRF2作为一种转录因子可以影响OA软骨细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞和破骨细胞。并且NRF2通过抑制NF-κB信号通路抑制OA软骨细胞的炎症，促进HO-1和醌氧化还原酶1（NQO1）等多种抗氧化酶的表达，从而抑制氧化应激，保护软骨细胞外基质，减少软骨细胞的衰老和死亡（包括细胞死亡、铁死亡和细胞焦亡），缓解关节疼痛^［19］。Keap1是Nrf2的主要负调节因子。在氧化应激条件下，Nrf2 从Keap1中释放出来。然后易位到细胞核并与抗氧化反应元件结合，激活各种下游抗氧化途径以维持细胞内氧化还原稳态^［20］。SLC7A11在铁死亡中具有重要功能，可通过调节谷胱甘肽的合成，维持细胞的抗氧化能力，从而抑制铁死亡的发生。研究表明Nrf2通过促进GPX4和SLC7A11的表达来减轻铁死亡^［21］。近年来，多项体内外实验证据已证实Nrf2信号通路在铁死亡的发生发展中具有关键调节作用。例如，He等^［22］在铁过载诱导的软骨细胞损伤模型中发现，通过激活Nrf2/HO-1信号通路可显著抑制ROS累积、脂质过氧化和Fe²⁺增多，进而减轻铁死亡相关的软骨细胞损害。石等^［23］发现通过抑制Nrf2/HO-1通路的激活，能够显著减少软骨细胞铁死亡，缓解免疫炎症反应。加入Nrf2抑制剂后，可显著削弱甚至完全逆转其对软骨细胞存活率的保护作用、对抗铁离子蓄积以及抑制ROS/脂质ROS生成的能力^{［24， 25］}。上述结果表明，Nrf2信号通路的激活是拮抗软骨损伤、减少细胞铁死亡延缓KOA进展的一个内在保护机制，因而成为中医药防治KOA的重要靶点。

本研究通过富集分析佐证了上述研究，并观察了KOA肝肾亏虚型患者的软骨损伤指标（MMP-13、CTX-II、COMP）、铁死亡相关指标（GPX4、ACSL4、4-HNE、Fe²⁺）的变化。MMP-13主要分解软骨基质中的Ⅱ型胶原，是软骨基质的破坏过程标志物，直接反映软骨降解的活跃程度^［26］。CTX-II是II型胶原降解的标志性产物，直接反映软骨基质分解的程度，是软骨细胞损伤的核心标志物^［27］。COMP是软骨细胞外基质的结构蛋白，其浓度升高反映软骨细胞损伤和基质代谢异常^［28］。三者密切相关，共同作用于软骨的降解与损伤过程，反映软骨退变的不同阶段和生物学机制^［29］。铁死亡目前被证实参与了参与KOA的发病机制^［30］，主要通过铁蓄积、脂质过氧化和氧化应激等多方面共同作用，加速了软骨细胞的损伤和退变。其中Fe^2＋是铁死亡的核心启动因子，通过 Fenton反应诱导脂质过氧化和细胞死亡，其升高提示铁稳态失衡及铁代谢调控蛋白功能异常^［31］。4-HNE作为脂质过氧化的终产物在KOA疾病过程发挥重要作用^［32］。在mRNA水平上4-HNE抑制了Ⅱ型胶原的表达，诱导了MMP13的表达。并且4-HNE与Ⅱ型胶原的结合可能导致软骨细胞表型和功能的多种异常，提示其可能破坏ECM的稳态。GPX4是铁死亡的关键调节因子，其表达上调可减少脂质过氧化， 活性降低可导致铁死亡的发生。ACSL4是铁死亡的“开关”酶之一，通过促进多不饱和脂肪酸的脂质化与过氧化，放大氧化应激信号并推动铁死亡的发生。而ACSL4和Fe^2＋的减少则可能阻断铁死亡信号通路的激活^［33］。

本研究结果发现，KOA患者治疗前MMP-13、CTX-II、COMP、ACSL4、4-HNE、Fe²⁺水平偏高，GPX4水平偏低。与健康组相比较发现，KOA患者Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4相对表达水平明显偏低，Keap1相对表达水平偏高，这表明KOA患者抗氧化系统功能减弱、软骨细胞处于损伤状态，铁死亡机制可能被激活。经过重骨颗粒干预治疗后发现该趋势可在一定程度被扭转，提高Nrf2、SLC7A11、HO-1、GPX4相对表达量水平，降低Keap1相对表达量水平，提示重骨颗粒可能通过激活Nrf2相关信号通路调节铁死亡改善肝肾亏虚型患者改善软骨损伤，延缓病情进展。

本研究通过应用网络药理学探讨重骨颗粒经Nrf2信号通路调控软骨细胞铁死亡治疗KOA的潜在活性成分及作用靶点。并利用分子对接验证核心靶点及活性成分的结合验证重骨颗粒的药效物质基础。通过临床实验初步验证重骨颗粒能够改善肝肾亏虚型KOA患者中医证候评分、软骨损伤指标，延缓疾病进程，其治疗作用可能与上调Nrf2活性调控铁死亡改善软骨损伤有关。由于本研究未进行细胞或动物层面的深入机制验证，未来将进一步开展体内外实验从蛋白表达与细胞功能层面更直接地验证重骨颗粒经Nrf2信号通路调控铁死亡实现软骨保护的具体机制，为中医药开发靶向治疗药物提供更加科学的实验依据和理论支撑。

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基金资助

国家自然科学基金(82104782)

大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所专项资金资助(2023CXMMTCM004)

安徽省临床医学研究转化专项项目(202304295107020114)

安徽省临床医学研究转化专项项目(202304295107020115)

安徽省教育厅研究生创新创业实践项目(2023cxcysj111)

RIGHTS & PERMISSIONS

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