杨梅酮通过阻遏HSP90AA1介导的AKT磷酸化抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移

Myricetin inhibits proliferation and migration of bladder cancer cells by inhibiting HSP90AA1-mediated AKT phosphorylation

摘要

目的 基于网络药理学、计算生物学及体外实验，系统筛选并验证杨梅酮抑制膀胱癌的潜在作用靶点及其分子机制。 方法 通过Swiss Target Prediction与SEA Search Server平台预测杨梅酮作用靶点，基于TCGA转录组数据与FinnGen血浆蛋白质组数据筛选膀胱癌相关靶点，取交集获得杨梅酮抗膀胱癌潜在靶点，构建蛋白质相互作用网络，进行GO与KEGG富集分析。采用Discovery Studio 2019进行分子对接与分子动力学模拟验证杨梅酮与核心靶点的结合能力与稳定性。通过氨基酸残基虚拟突变验证杨梅酮特异性结合HSP90AA1。通过公开单细胞转录组数据及CRISPR筛选数据，分析核心靶点HSP90AA1在膀胱癌中的细胞特异性与功能必要性。采用CCK-8、克隆形成、划痕实验、qRT-PCR及Western blotting等方法，在UM-UC-3细胞中验证杨梅酮对细胞增殖、迁移能力的影响，并检测其对HSP90AA1及PI3K-AKT信号通路关键蛋白表达的调控作用。 结果 共筛选出30个杨梅酮抗膀胱癌潜在靶点，其中HSP90AA1被确定为最核心的靶点。KEGG富集分析提示这些基因显著富集于PI3K-AKT信号通路。分子对接与动力学模拟表明，杨梅酮与HSP90AA1蛋白具有较高的结合亲和力与稳定的结合构象。生物信息学分析显示，HSP90AA1在膀胱癌尿路上皮细胞中特异性高表达，是膀胱癌细胞的潜在治疗靶点，且其高表达与不良无进展生存期（PFS）显著相关。体外实验显示，杨梅酮可浓度依赖性地抑制UM-UC-3细胞的增殖与迁移（P<0.05），并下调HSP90AA1 mRNA及HSP90AA1、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平（P<0.05）。 结论 杨梅酮可能通过特异性靶向HSP90AA1，调控PI3K-AKT信号通路，从而抑制膀胱癌UM-UC-3细胞的增殖与迁移能力。

Abstract

Objective To explore the targets and molecular mechanisms mediating the inhibitory effect of myricetin against bladder cancer. Methods The potential targets of myricetin were predicted using SwissTargetPrediction and SEA Search Server, bladder cancer-related targets were screened from TCGA transcriptome and FinnGen plasma proteome data, and the intersecting genes were obtained to identify the potential targets. A protein-protein interaction network was constructed, followed by GO and KEGG enrichment analyses. Molecular docking and dynamics simulations were performed to validate the binding between myricetin and the core targets. Amino acid residue virtual mutation was conducted to confirm the binding specificity of myricetin to HSP90AA1. Public single-cell transcriptomic and CRISPR screening data were analyzed to evaluate the cell-type specificity and functional essentiality of HSP90AA1. UM-UC-3 cells were used to examine the effects of myricetin on cell proliferation and migration and expressions of HSP90AA1 and PI3K-AKT pathway proteins. Results Thirty potential targets of myricetin against bladder cancer were obtained, and HSP90AA1 was identified as the central target. KEGG analysis indicated significant enrichment of the target genes in the PI3K-AKT signaling pathway. Molecular docking and dynamics simulations demonstrated high binding affinity and stable conformation between myricetin and HSP90AA1. Bioinformatics analysis suggested that HSP90AA1 was highly and specifically expressed in bladder cancer urothelial cells, and its high expression was correlated with poor progression-free survival of the patients. In UM-UC-3 cells, myricetin concentration-dependently inhibited cell proliferation and migration, and downregulated mRNA level of HSP90AA1 and protein expressions of HSP90AA1, p-PI3K, and p-AKT. Conclusion Myricetin inhibits bladder cancer cell proliferation and migration possibly by targeting HSP90AA1 and regulating the PI3K-AKT signaling pathway, suggesting its potential as a therapeutic agent for bladder cancer.

Graphical abstract

膀胱癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，具有高发病率和高死亡率，占2025年估计新发癌症病例的6%和癌症相关死亡病例的4%^{［1， 2］}。在初次确诊膀胱癌时，70%~75%的膀胱癌患者被诊断为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），20%~25%被诊断为肌层浸润性膀胱癌（MIBC），5%为侵袭性膀胱癌，这往往预示患者的预后不良^［3］。

NMIBC常采用经尿道膀胱肿瘤切除术，同时联合膀胱内辅助治疗（卡介苗、化疗）或免疫治疗^{［4， 5］}，但治疗后有部分患者复发或进展为MIBC，MIBC常采用新辅助化疗联合根治性膀胱切除术，无法进行手术的患者常采用放疗、化疗联合免疫治疗^［6］，尽管以上方案有一定程度的治疗效果，但疗效并不是很理想^{［7， 8］}。膀胱癌患者术后也易出现感染、出血、尿道狭窄及尿失禁等并发症，加之放化疗的不良反应，常影响患者的生活质量^{［9， 10］}。因此，有必要探索一种安全有效、治疗效果更好且具有更低不良反应的膀胱癌潜在治疗药物。

膀胱癌在中医属于“尿血”、“淋证”、“癃闭”范畴，关于膀胱癌的病因和病机，中医古籍《金匮要略·五脏风寒积聚病脉证并治》曰：“热在下焦者，则尿血，亦令淋秘不通”^［11］。膀胱癌以脾肾亏虚为本，痰湿淤毒凝于下焦为标，日久积聚成块，导致肿瘤的发生^［12］。中药具有不良反应少、疗效好等特点，在肿瘤治疗与并发症的治疗中受到越来越多的关注，近年来中西医结合治疗在膀胱癌治疗中也发挥了举足轻重的作用^{［13， 14］}。然而，膀胱癌的作用靶点与分子机制常常难以明确。

杨梅酮是一种天然黄酮类化合物，在杨梅、茶叶及浆果中广泛存在^［15］，具有抗炎、抗氧化和抗病毒等多方面的作用^［16］。研究发现杨梅酮可以通过多种途径诱导细胞自噬、促进细胞凋亡，在乳腺癌、胃癌和卵巢癌等多种肿瘤中表现出抗肿瘤效果^［17］。然而，杨梅酮在膀胱癌中的作用及其分子机制尚不清晰。

近年来，系统生物学与计算模拟技术的融合推动了中药活性成分的机制研究的进展^［18］。网络药理学、分子对接与动力学模拟可用于系统性预测和初步验证药物-靶点相互作用，而基于公共数据库的功能基因组学与单细胞转录组学分析，则能从细胞群体与单细胞层面为靶点的生物学功能和临床相关性提供强有力的外部证据^{［19， 20］}。基于此，本研究旨在构建一个从计算预测到生物信息学验证再到体外实验确认的整合性研究框架，以系统阐明杨梅酮抑制膀胱癌的潜在靶点与作用机制。

1 材料和方法

1.1 基于贝叶斯模型探讨杨梅酮的可药性与生物毒性

采用计算毒理学方法对杨梅酮的成药性与生物毒性进行系统评估。基于利平斯基五规则与贝叶斯分类器模型，将杨梅酮的三维结构导入Discovery Studio 2019软件中的Toxic Calculate模块，对其毒理学特性进行预测分析。评估指标包括潜在发育毒性、致突变性、大鼠长期口服最低可见不良作用水平、啮齿动物致癌性、皮肤致敏性、豚鼠最大值实验、皮肤刺激性、大鼠口服半数致死量以及好氧生物降解性能。同时，利用SwissADME在线平台（http：//www.swissadme.ch）对杨梅酮在人体内的水溶性、吸收、分布、代谢、排泄及毒性特性进行系统分析。所有结果均通过R语言进行可视化处理。

1.2 药物和疾病靶点筛选

通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取杨梅酮的SMILE化学结构式、二维化学结构及其三维结构模式图，将SMILES结构式提交至SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetpredic tion.ch/）与SEA Search Server（http：//sea.bkslab.org/）在线平台，以物种Homo sapiens为条件预测其潜在作用靶点。将2个数据库的预测结果合并去重后，利用UniProt知识库（http：//www.uniprot.org）对靶点基因名称进行标准化校正，统一为官方基因符号，作为杨梅酮的最终作用靶点集。

基于TCGA数据库中108例癌旁组织与642例膀胱癌组织的转录组数据，采用BATCH算法校正批次效应，筛选膀胱癌组织与癌旁组织间的差异表达基因，筛选标准设定为|logFC|>1且P<0.05。基于研究发布的大规模血浆蛋白质组数量性状位点（pQTL）数据，从一个包含2923种血浆蛋白的独立pQTL队列中，提取与膀胱癌发病风险显著相关的血浆蛋白，筛选标准为F统计量>1000^{［21， 22］}。

1.3 蛋白质相互作用网络的构建

取杨梅酮作用靶点、膀胱癌组织与癌旁组织差异表达基因及血浆易感基因三者的交集，获得共同靶点集。将该靶点集提交至STRING在线数据库，设定相互作用置信度得分>0.9，构建蛋白质相互作用网络。将所得网络数据导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化。进一步利用其插件CytoNCA，基于拓扑属性（包括度值、介数中心性、紧密度中心性等）对网络节点进行3次迭代筛选，最终确定PPI网络中的核心基因。

1.4 GO和KEGG富集分析

使用R语言程序包“clusterProfiler”对杨梅酮作用靶点相关基因进行GO和KEGG富集分析，最后将GO和KEGG富集通路图处理为圈图。

1.5 分子对接验证杨梅酮对PI3K-AKT信号通路的作用

为验证杨梅酮与核心靶点的结合模式与亲和力，进行分子对接模拟。从PDB蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）下载HSP90AA1的三维晶体结构（PDB ID： 1BYQ），利用Discovery Studio 2019软件进行预处理，包括去除水分子、加氢及能量最小化。从PubChem数据库获取杨梅酮的三维结构，并导入Discovery Studio 2019软件进行能量最小化以优化其几何构象。采用LibDock模块和 AutoDock Vina 1.2.4程序分别进行半柔性分子对接，将配体构象与受体活性位点进行匹配与打分。对接结果导入PyMOL 2.5进行三维相互作用可视化。

结合能打分用于评价结合稳定性，分值越高表明结合亲和力越强，Vina score代表小分子配体-受体蛋白复合物结合能，用于评估结合稳定性，由此评估杨梅酮靶向HSP90AA1并调控PI3K-AKT信号通路的潜力。

1.6 分子动力学模拟

分子动力学模拟（MD）采用Gromacs 2019.6程序，在恒温恒压以及周期性边界条件下进行。应用Amber14SB蛋白力场，TIP3P水模型。在MD模拟过程中，所有涉及采用LINCS算法进行约束，积分步长为2 fs。静电相互作用采用Particle-mesh Ewald方法计算。非键相互作用截断值设为10 A，每10步更新1次。采用Berendsen温度耦合方法控制模拟温度为300 K，采用Parrinello-Rahman方法控制压力为1 bar。采用最陡下降法对体系进行能量最小化，以消除不利的原子空间冲突。在100 ps内将体系所有原子加热到300 K。分别对2个体系进行50 ns的MD模拟，每20 ps保存1次构象，模拟结果可视化采用Gromacs内嵌程序和Pymol完成。

1.7 MM-PBSA结合自由能计算

为定量评估杨梅酮与HSP90AA1复合物的结合亲和力，采用MM-PBSA计算进行评估。从50 ns分子动力学模拟的平衡阶段（后40 ns）中，均匀抽取200帧复合物、受体和配体的构象。利用gmx_MMPBSA工具，在AMBER力场下计算各帧的结合自由能。最终结合自由能（ΔGbind）及其组分为200帧计算结果的均数±标准差。

1.8 HSP90AA1作为膀胱癌新型生物标志物、肿瘤微环境重塑及功能必要性分析

基于TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）膀胱癌患者的数据，利用R语言进行肿瘤表达差异分析、配对差异分析以及KM生存分析用于探讨HSP90AA1作为膀胱癌潜在新型生物标志物和治疗靶点的可能性。为深入探究HSP90AA1的具体分子机制、表达定位及其对肿瘤微环境的影响，进行免疫细胞浸润分析、免疫检查点相关性分析、药物敏感性分析和GSEA富集分析。

使用Cancer Dependency Map 门户网站（https：//depmap.org/portal/）下载了最新版本的CRISPR-Cas9基因敲除筛选数据集，评估HSP90AA1基因在膀胱癌细胞中的功能必要性^［23］。该数据使用Chronos算法计算基因效应值，负值表示基因敲除抑制细胞生长，数值越负表明该基因对细胞存活越关键。从数据集中提取所有膀胱癌细胞系中HSP90AA1的CERES依赖度分数。计算其在不同膀胱癌细胞系中的均数与标准差，并与已知的膀胱癌必需基因进行对比分析。

利用来自HPA数据库（https：//www.proteinatlas.org/）的PC-3（前列腺癌）、MCF-7（乳腺癌）、U-251MG（胶质母细胞瘤）细胞系，通过流式细胞术进一步分析 HSP90AA1 的表达情况。使用R语言脚本通过HPA数据库的官方API接口批量下载上述3种细胞系针对HSP90AA1抗体（CAB号：CAB002058）的共聚焦免疫荧光显微图像（包括绿色荧光通道、细胞核DAPI通道及微管蛋白通道图像）及免疫组化（IHC）图谱。

1.9 实验验证

1.9.1 主要材料

膀胱癌细胞株UM-UC-3（中国科学院上海细胞库）；DMEM 培养基、胰酶细胞消化液（Gibco）；胎牛血清、化学发光液（Zeta life）；杨梅酮干粉（纯度：96%，上海源叶生物科技有限公司）；DMSO、CCK-8试剂盒、4%多聚甲醛固定液、结晶紫染色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒、Western blotting一抗稀释液（上海碧云天生物技术有限公司）；GAPDH抗体、PI3K抗体、p-PI3K抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；AKT抗体、p-AKT抗体（Proteintech）；HSP90AA1抗体（Cell Signaling Technology）；RNA 提取辅助试剂（广州亿涛生物科技有限公司）；引物合成（生工生物工程上海股份有限公司）；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）。Multiscan MK3型号酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；电泳仪、转膜仪（Biorad）；Tanon5200型号全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG H&L、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG H&L（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.9.2 细胞培养

膀胱癌细胞UM-UC-3培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并放置在37 ℃含5%CO₂的细胞培养箱中培养。

1.9.3 CCK-8实验

将膀胱癌细胞UM-UC-3接种在6孔板中，放于培养箱中培养，待细胞贴壁后用不同浓度的杨梅酮（0、40、80、120、160、200 μmol/L）处理。继续培养24 h后，用胰酶消化液消化细胞，待细胞消化好后加入胰酶消化液2倍体积的培养基终止消化，离心弃上清，用培养基重悬细胞，计数后取2000个均匀铺在96孔板中。放置在培养箱中待细胞贴壁后加入10 μL/孔CCK-8试剂，继续放在培养箱中培养3 h。然后使用酶标仪测量细胞的吸光度A_{450 nm}。

1.9.4 克隆形成实验

将膀胱癌细胞UM-UC-3按500/孔接种在6孔板中，放于培养箱中培养，待细胞贴壁且形成细胞集落后用不同浓度的杨梅酮（0、150、200 μmol/L）处理24 h。放于培养箱继续培养，定期观察并更换培养基，待细胞集落形成一定数量时用PBS洗涤细胞2次，用4%多聚甲醛和结晶紫染色液分别固定和染色细胞30 min，自然放置晾干后拍照并分析。

1.9.5 划痕实验

将细胞均匀铺在6孔板中，待细胞长满整个培养皿时，用200 μL/孔移液器枪头划3条直线，用PBS洗去漂浮的细胞，加入无血清培养基继续培养。在划痕后0 h和24 h对划痕同一位置进行显微镜拍照并分析。

1.9.6 实时荧光定量PCR

将膀胱癌细胞UM-UC-3接种在6孔板中，放于培养箱中培养，待细胞贴壁后用不同浓度的杨梅酮（0、150、200 μmol/L）处理。继续培养24 h后提取细胞总RNA。引物序列：HSP90AA1正向引物5'-CATAACGATGATGAGCAGTACGC-3'；反向引物5'-GACCCATAGGTTCACCTGTGT-3'。GAPDH正向引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.9.7 Western blotting实验

用不同浓度的杨梅酮（0、150、200 μmol/L）处理贴壁的UM-UC-3细胞。继续培养24 h后加入100 μL/孔RIPA裂解液和1 μL PMSF，置于冰上裂解30 min后刮取细胞用于提取蛋白质。用BCA试剂盒测蛋白浓度，配平后煮沸使蛋白变性。配制合适浓度的SDS-PAGE凝胶，用恒定80 V电压电泳2 h分离蛋白，将分离后的蛋白条带用恒定200 mA电流转膜2 h转移到PVDF膜上，再将PVDF膜浸泡在5%新鲜配制的牛奶中封闭2 h。然后放在4 ℃冰箱摇床孵育一抗AKT（1∶2000）、p-AKT（1∶2000）、PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、HSP90AA1（1∶1000）和GAPDH（1∶20 000）过夜。用TBST溶液洗涤PVDF膜，彻底洗去未结合的一抗，室温孵育二抗2 h，再用TBST溶液洗去未结合的二抗。加入化学发光液进行免疫印记检测与条带分析。

1.9.8 统计学分析

采用GraphPad Prism10.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

1.10 基于单细胞转录组数据的细胞特异性表达分析

从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载已发表的膀胱癌单细胞RNA测序数据集（GSE210347、GSE145281、GSE149652）。使用Seurat（v4.0）R软件包进行标准流程分析，包括数据质控、归一化、主成分分析、细胞聚类与注释。通过可视化与统计分析，比较HSP90AA1在恶性上皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞等不同细胞亚群中的表达水平，以确定其特异性表达的细胞类型。

1.11 氨基酸残基虚拟突变

为从结构层面验证杨梅酮与HSP90AA1结合的特异性，采用Discovery Studio 2019软件对C2口袋的关键相互作用残基进行虚拟突变分析。基于前期分子对接结果，选择与杨梅酮形成直接相互作用的VAL-136与TYR-139作为突变位点。利用软件的“Build Mutants”模块分别构建V136A（疏水残基突变）、Y139F（芳香族保守突变）和Y139A（芳香族非保守突变）3种点突变体。每个突变体结构均经过能量最小化处理以优化构象。最后，将杨梅酮分子分别与野生型及各突变体蛋白进行再对接（LibDock模块），并采用MM-PBSA方法计算并比较各体系的结合自由能变化（ΔΔG），以评估关键残基对结合稳定性的贡献。

2 结果

2.1 杨梅酮具有良好的可药性、生物利用度和较低的生物学毒性

ADMET预测结果显示，杨梅酮具有较差的水溶性，但脂溶性良好，提示其具有较好的膜渗透性；同时预测显示其不易透过血脑屏障，降低了中枢神经毒性的潜在风险（图1）。

毒理学模拟分析结果进一步证实了杨梅酮的安全性（表1）：其在好氧环境下易于生物降解，Ames试验结果显示无致突变性，发育毒性预测为阴性。长期致癌性评估显示，在小鼠和大鼠的多项模型中均未表现出致癌性。此外，杨梅酮的皮肤致敏性和刺激性风险较低。药代动力学参数显示，大鼠长期口服最低可见不良作用水平为298 mg/kg，大鼠口服半数致死量大于2000 mg/kg，其具有较宽的安全窗口。杨梅酮在保持良好成药性的同时，未表现出严重的毒副反应，具备进一步开发为抗膀胱癌药物的潜力。

2.2 杨梅酮治疗膀胱癌的潜在靶点

共检索到杨梅酮靶点基因135个，膀胱癌与癌旁组织差异表达基因287个，膀胱癌血浆蛋白易感基因2186个，Venn分析结果显示杨梅酮与膀胱癌之间有3个交集靶点基因，即杨梅酮治疗膀胱癌的潜在基因靶点（HSP90AA1、TOP2A和CYP1B1）（图2）。

2.3 PPI网络构建及核心靶点筛选

将潜在基因靶点导入 STRING 在线网站分析即可得到膀胱癌-杨梅酮潜在靶点蛋白相互作用图，通过CytoNCA程序设定条件进行两次过滤筛选得到核心靶点，其中HSP90AA1、TOP2A和CYP1B1是杨梅酮和膀胱癌治疗潜在靶点中最核心的靶点（图3）。

2.4 杨梅酮治疗膀胱癌的潜在靶点GO和KEGG信号通路富集分析

GO富集分析提示潜在靶点主要富集在response to drug（GO：0042493）、response to inorganic substance（GO：0010035）和response to lipid（GO：0033993）等生物体代谢相关的通路（图4A）。KEGG 富集分析提示，杨梅酮治疗膀胱癌的潜在靶点可能与ErbB、PI3K-AKT、MAPK和Rap等信号通路的调控有关，依据差异基因表达得出潜在靶点在PI3K-AKT （ko04151）信号通路富集最多（图4B）。

2.5 分子对接

分子对接结果显示（表2），杨梅酮与核心靶点HSP90AA1、TOP2A及CYP1B1均能结合，其中与HSP90AA1的结合亲和力最高（Vina score：-10.9 kcal/mol，结合能打分：100.18）。可视化分析显示，杨梅酮主要位于HSP90AA1的C2口袋（图5），通过与VAL-136、TYR-139等关键残基形成氢键与疏水相互作用而稳定结合。

2.6 分子动力学模拟

杨梅酮配体在50 ns持续时间内都表现出稳定的构象RMSD波动。杨梅酮-HSP90AA1复合物的RMSD值在整个MD过程中保持稳定的上升趋势，但没有出现明显的波动。到50 ns时，复合物的最终RMSD值稳定，复合物体系在短时间内达到稳态（图6）。

2.7 MM-PBSA定量验证结合亲和力

分子动力学模拟结果表明，杨梅酮-HSP90AA1复合物结构稳定。MM-PBSA分析计算结果显示，杨梅酮与HSP90AA1的平均结合自由能（ΔGbind）为-12.35±1.82 kcal/mol。对ΔGbind的分解显示，范德华相互作用（ΔEvdw=-25.17±2.01 kcal/mol）和静电相互作用（ΔEele=-15.43±3.52 kcal/mol）是驱动结合的主要有利贡献项，而极性溶剂化能（ΔGpolar=30.11±4.20 kcal/mol）则是对结合不利的主要去溶剂化惩罚项。

2.8 HSP90AA1作为膀胱癌新型生物标志物的识别

热图结果显示，HSP90AA1在高T分期以及高病理分级患者中的表达水平普遍更高（图7A）。HSP90AA1在MIBC中的表达量高于NMIBC（P<0.01），其过表达提示其可能与肿瘤的侵袭和转移相关。

配对差异分析和肿瘤差异分析结果显示，HSP90AA1在膀胱癌组织的表达明显高于正常组织，差异具有统计学意义（P<0.01，图7B），KM生存分析结果显示，HSP90AA1高低表达组的膀胱癌患者总生存期（OS）无差异（图7C），HSP90AA1高表达组患者具有更差的无进展生存期（PFS），差异具有统计学意义（P=0.014，图7D）。

2.9 CRISPR筛选验证HSP90AA1功能必要性

CRISPR-Cas9筛选数据显示，在全部1186个受检细胞系中，有9.97%对HSP90AA1基因敲除表现出显著依赖性（图8A）。结果显示，在数据库收录的 34个膀胱/泌尿系统肿瘤（Bladder/Urinary Tract）细胞系中，HSP90AA1表现出显著的基因依赖性（图8B）。其基因效应值分布显示，绝大多数膀胱癌细胞系对该基因敏感（基因效应值<0）。HSP90AA1在膀胱癌谱系中被标记为强选择性。

HSP90AA1在膀胱癌细胞系中的平均基因效应值约为-0.70（图8C）。DepMap中的基因表达数据（log₂（TPM+1））显示，HSP90AA1在多个膀胱癌细胞系中呈现高表达状态，与其高功能必要性的发现相吻合。IHC图谱显示，HSP90AA1蛋白在低级别膀胱尿路上皮癌中表达较弱，在高级别膀胱尿路上皮癌中呈现强阳性染色，主要表达于细胞质和核质（图8D）。

2.10 HSP90AA1介导的肿瘤免疫微环境重塑及流式细胞技术荧光共定位

单因素和多因素回归分析结果显示，年龄和分级影响HSP90AA1在膀胱癌中的表达，年龄大于65岁以及高级别膀胱尿路上皮癌的患者HSP90AA1表达量更高（P<0.001，图9A）。免疫检查点相关性分析显示，HSP90AA1表达的调节与免疫检查点调节呈负相关关系（图9B）。HSP90AA1表达升高参与中间丝细胞骨架、表皮细胞分化等生物学过程，HSP90AA1表达降低参与外包囊结构组织等生物学过程（图9C）。

Elesclomol、Nutlin-3a、CI-1040为逆转HSP90AA1高表达患者预后不良的潜在药物（图9D）。肥大细胞、B细胞数量与HSP90AA1表达量呈负相关关系，树突状细胞数量与HSP90AA1表达量呈正相关关系（图9E）。免疫荧光技术显示，HSP90AA1主要表达在细胞质中，但在细胞间桥中也有表达（图9F）。

2.11 杨梅酮抑制UM-UC-3细胞的增殖和迁移能力

CCK-8结果显示，与对照组相比，经40~200 μmol/L杨梅酮处理后，测得24 h的IC₅₀值为153.6 μmol/L，细胞存活率下降（P<0.05，图10A）。克隆形成实验（图10B）与划痕愈合实验（图10C）也分别证实，杨梅酮能显著抑制细胞的增殖能力与迁移能力（P<0.01）。

2.12 杨梅酮调控PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达

qRT-PCR结果显示，经过不同浓度杨梅酮处理后UM-UC-3细胞内HSP90AA1表达水平降低，该作用呈现浓度依赖性（P<0.05，图10D）。Western blotting结果显示，经不同浓度杨梅酮处理后膀胱癌UM-UC-3细胞中PI3K和AKT蛋白表达水平未见明显变化。与对照组相比，实验组HSP90AA1、p-PI3K和p-AKT表达水平随杨梅酮浓度增加而逐渐降低（P<0.05，图10E）。

2.13 单细胞水平细胞特异性HSP90AA1表达分析

Seurat流程进行细胞聚类与注释，共鉴定出包括恶性上皮细胞、免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞等）、成纤维细胞、内皮细胞和正常上皮细胞在内的18个细胞亚群。表达分析显示，HSP90AA1在膀胱癌恶性上皮细胞中表达最为显著，其表达水平高于其他细胞类型（P<0.01）。此外，在部分免疫细胞亚群中也检测到中等程度的HSP90AA1表达，而在成纤维细胞、内皮细胞和大多数淋巴细胞中表达较低（图11）。

2.14 氨基酸残基虚拟突变验证杨梅酮与HSP90AA1结合特异性

虚拟突变分析结果证实，VAL-136与TYR-139是维持杨梅酮与HSP90AA1高亲和力结合的关键残基。分子对接与结合自由能计算显示，突变这些残基导致杨梅酮的结合亲和力下降（表3）。其中，破坏氢键相互作用的Y139A突变影响最为显著，使结合自由能上升了约+3.4 kcal/mol，而主要参与疏水作用的V136A突变也使结合自由能上升了+2.7 kcal/mol。相对保守的Y139F突变影响较小（ΔΔG=+1.1 kcal/mol），TYR-139的酚羟基是与杨梅酮形成特异性氢键的关键基团。

3 讨论

膀胱癌因其高肿瘤异质性成为我国居民健康主要负担之一，当NMIBC进展为MIBC且伴淋巴结转移时，患者往往需要接受膀胱全切联合放化疗或免疫综合治疗，然而患者远期生存获益仍难尽人意^{［2， 8］}。近年来中药在肿瘤治疗中的作用逐渐受到关注^［24］。目前有越来越多的研究表明中药辅助治疗膀胱癌能改善患者预后、减少不良反应、提高总体疗效^{［25， 26］}。中西医结合可以减毒增效，中医药在提高患者生活质量，改善预后方面有独特的优势^［27］。本研究通过生物信息学和网络药理学的方法，结合体外细胞实验，探讨杨梅酮治疗膀胱癌的潜在靶点和作用机制。本研究首次结合CRISPR筛选数据与单细胞转录组分析，从功能必要性与细胞特异性两个维度强化了HSP90AA1作为膀胱癌治疗靶点的可信度。CRISPR-Cas9筛选显示HSP90AA1在膀胱癌细胞中具有显著的基因依赖性，且其高表达与不良PFS相关，提示其不仅是一个功能性靶点，更是一个具备临床预后指示潜力的生物标志物。网络药理学在中医药研究领域已成为一种广泛运用的筛选方法，它为中医药的实验研究和临床应用提供了坚实的理论支撑^{［28， 29］}。分子动力学近年来被广泛应用在多种疾病的研究中，作为探究化合物与靶点相互作用的关键手段，帮助提高实验效率^［30］。

在结构生物学层面，本研究不仅通过分子对接与动力学模拟证实了杨梅酮与HSP90AA1的稳定结合，进一步通过氨基酸残基虚拟突变技术鉴定了其结合口袋中的关键残基VAL-136与TYR-139。突变实验显示，破坏这些残基显著降低结合亲和力，尤其是TYR-139的酚羟基在形成氢键网络中起关键作用。这一发现不仅从原子层面解释了杨梅酮与HSP90AA1结合的特异性，也为后续基于结构的药物优化提供了明确的作用位点参考。

网络药理学分析结果显示，HSP90AA1、TOP2A和CYP1B1是杨梅酮和膀胱癌潜在治疗靶点中的最核心靶点。有研究表明，HSP90AA1在伴有淋巴转移和未伴有淋巴转移的下咽部鳞状细胞癌组织中表达具有差异，降低HSP90AA1的表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭^{［31， 32］}。HSP90AA1通过调控AKT通路促进上皮-间充质转化进而促进肿瘤淋巴转移^［33］。本研究在膀胱癌中进一步验证了HSP90AA1的高表达与肿瘤侵袭性正相关，且杨梅酮可下调其表达并抑制下游PI3K-AKT通路活化，这与既往在其他癌种中的研究结论一致^{［34， 35］}，提示HSP90AA1可能是一个跨癌种的功能保守靶点。有研究表明，TOP2A在肝癌组织的表达量明显高于癌旁组织，降低TOP2A的表达可以抑制肝癌细胞的增殖迁移能力，促进细胞的凋亡^［36］。CYP1B1在子宫内膜癌、乳腺癌组织中的表达明显增加，在肿瘤的发生发展中有着至关重要的作用^{［37， 38］}。

KEGG通路富集分析显示PI3K-AKT信号通路是杨梅酮与膀胱癌交叉靶点富集最丰富的通路。一项基于网络药理学和分子对接对膀胱癌的研究阐明HSP90AA1是中药泽泻抗膀胱癌的核心靶点之一，GO和KEGG分析表明，杨梅酮治疗膀胱癌的相关生物过程主要富集在PI3K-AKT信号通路中。在肿瘤发生发展过程中，PI3K-AKT信号通路是促进癌细胞增殖、迁移和侵袭的经典通路，PI3K-AKT通路的激活与肿瘤的发生密不可分^［39］。研究显示，抑制PI3K-AKT信号通路可以提高膀胱癌对化疗和免疫治疗药物的敏感性，通路抑制剂联合化疗药物使用对膀胱癌细胞的抑制率远高于仅使用化疗药物^{［27， 40］}。本研究中，杨梅酮处理显著降低了p-PI3K与p-AKT的蛋白水平，而不影响总PI3K与AKT的表达，说明其作用机制是通过抑制该通路的磷酸化激活而非影响蛋白合成。

此外，单细胞转录组分析揭示HSP90AA1在膀胱癌恶性上皮细胞中特异性高表达，而在肿瘤微环境中的免疫细胞与间质细胞中表达较低，这为其作为肿瘤特异性靶点提供了细胞分辨率层面的证据，也可能部分解释了杨梅酮在体外实验中表现出的较强抗肿瘤活性与潜在的安全性优势。

综上所述，本研究通过多维度技术体系验证了杨梅酮通过靶向HSP90AA1、抑制PI3K-AKT信号通路从而抑制膀胱癌细胞增殖与迁移的作用机制。本研究首次将CRISPR功能筛选、单细胞转录组分析与计算结构生物学整合应用于杨梅酮抗膀胱癌机制研究，增强了靶点验证的系统性与说服力。 然而，本研究存在以下不足：未开展体内实验进一步验证杨梅酮抗肿瘤的效果，且未探讨杨梅酮是否影响HSP90AA1的蛋白稳定性或分子伴侣功能，其具体下游效应机制仍有待深入探讨。未来研究将在动物模型中验证其疗效，并进一步探索杨梅酮是否与现有膀胱癌治疗药物具有协同作用。

参考文献

[1] Jubber I, Ong S, Bukavina L, et al. Epidemiology of bladder cancer in 2023: a systematic review of risk factors[J]. Eur Urol, 2023, 84(2): 176-90. doi：10.1016/j.eururo.2023.03.029

[2] Dyrskjøt L, Hansel DE, Efstathiou JA, et al. Bladder cancer[J]. Nat Rev Dis Primers, 2023, 9: 58. doi：10.1038/s41572-023-00468-9

[3] Sylvester RJ, Rodríguez O, Hernández V, et al. European Association of Urology (EAU) Prognostic Factor Risk Groups for Non-muscle-invasive Bladder Cancer (NMIBC) Incorporating the WHO 2004/2016 and WHO 1973 Classification Systems for Grade: An Update from the EAU NMIBC Guidelines Panel [J]. Eur Urol, 2021, 79(4): 480-8. doi：10.1016/j.eururo.2020.12.033

[4] Holzbeierlein JM, Bixler BR, Buckley DI, et al. Diagnosis and treatment of non-muscle invasive bladder cancer: AUA/SUO guideline: 2024 amendment[J]. J Urol, 2024, 211(4): 533-8. doi：10.1097/ju.0000000000003846

[5] Ghodoussipour S, Bivalacqua T, Bryan RT, et al. A systematic review of novel intravesical approaches for the treatment of patients with non-muscle-invasive bladder cancer[J]. Eur Urol, 2025, 88(1): 33-55. doi：10.1016/j.eururo.2025.02.010

[6] Patel VG, Oh WK, Galsky MD. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020[J]. CA Cancer J Clin, 2020, 70(5): 404-23. doi：10.3322/caac.21631

[7] Compérat E, Amin MB, Cathomas R, et al. Current best practice for bladder cancer: a narrative review of diagnostics and treatments[J]. Lancet, 2022, 400(10364): 1712-21. doi：10.1016/s0140-6736(22)01188-6

[8] Tran L, Xiao JF, Agarwal N, et al. Advances in bladder cancer biology and therapy[J]. Nat Rev Cancer, 2021, 21(2): 104-21. doi：10.1038/s41568-020-00313-1

[9] Froehner M, Brausi MA, Herr HW, et al. Complications following radical cystectomy for bladder cancer in the elderly[J]. Eur Urol, 2009, 56(3): 443-54. doi：10.1016/j.eururo.2009.05.008

[10] Laukhtina E, von Deimling M, Pradere B, et al. Urinary function in female patients after traditional, organ-sparing and nerve-sparing radical cystectomy for bladder cancer: a systematic review and pooled analysis[J]. BJU Int, 2024, 133(3): 246-58. doi：10.1111/bju.16152

[11] 侯桐欣, 高 宇, 王晞星, 等. 膀胱癌患者329例中医症状与证候要素分布规律[J]. 中华中医药杂志, 2025, 40(04): 1992-7.

[12] 谢逸轩, 王 赛, 朱飞鹏, 等. 基于中西医临床病证特点的膀胱癌动物模型分析[J]. 中药药理与临床, 2023, 39(10): 83-6, 128.

[13] Liu ML, Zhang JY, Zhang TY, et al. Nordihydroguaiaretic acid inhibits bladder cancer metastasis through suppression of α1, 3-mannosyltransferase expression and LRFN4 N-glycosylation[J]. J Transl Med, 2025, 23(1): 733. doi：10.1186/s12967-025-06571-7

[14] Li J, Fan SP, Li HX, et al. Evaluation of efficacy, safety and underlying mechanism on Traditional Chinese medicine as synergistic agents for cancer immunotherapy: a preclinical systematic review and meta-analysis[J]. J Ethnopharmacol, 2025, 338: 119035. doi：10.1016/j.jep.2024.119035

[15] Song X, Tan L, Wang M, et al. Myricetin: a review of the most recent research[J]. Biomed Pharmacother, 2021, 134: 111017. doi：10.1016/j.biopha.2020.111017

[16] Shao GX, Liu Y, Lu L, et al. Therapeutic potential of traditional Chinese medicine in the prevention and treatment of digestive inflammatory cancer transformation: Portulaca oleracea L. as a promising drug[J]. J Ethnopharmacol, 2024, 327: 117999. doi：10.1016/j.jep.2024.117999

[17] Wendlocha D, Kubina R, Krzykawski K, et al. Selected flavonols targeting cell death pathways in cancer therapy: the latest achievem-ents in research on apoptosis, autophagy, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis, and cuproptosis[J]. Nutrients, 2024, 16(8): 1201. doi：10.3390/nu16081201

[18] Zhao SJ, Zhang XJ, da Silva-Júnior EF, et al. Computer-aided drug design in seeking viral capsid modulators[J]. Drug Discov Today, 2023, 28(6): 103581. doi：10.1016/j.drudis.2023.103581

[19] Mahat DB, Tippens ND, Martin-Rufino JD, et al. Single-cell nascent RNA sequencing unveils coordinated global transcription[J]. Nature, 2024, 631(8019): 216-23. doi：10.1038/s41586-024-07517-7

[20] Li YT, Miao JH, Liu CZ, et al. Kushenol O regulates GALNT7/NF-κB axis-mediated macrophage M2 polarization and efferocytosis in papillary thyroid carcinoma[J]. Phytomedicine, 2025, 138: 156373. doi：10.1016/j.phymed.2025.156373

[21] Ferkingstad E, Sulem P, Atlason BA, et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease[J]. Nat Genet, 2021, 53(12): 1712-21. doi：10.1038/s41588-021-00978-w

[22] Pierce BL, Ahsan H, VanderWeele TJ. Power and instrument strength requirements for Mendelian randomization studies using multiple genetic variants[J]. Int J Epidemiol, 2011, 40(3): 740-52. doi：10.1093/ije/dyq151

[23] Shi X, Gekas C, Verduzco D, et al. Building a translational cancer dependency map for The Cancer Genome Atlas[J]. Nat Cancer, 2024, 5(8): 1176-94. doi：10.1038/s43018-024-00789-y

[24] Li SQ, Chen X, Shi H, et al. Tailoring traditional Chinese medicine in cancer therapy[J]. Mol Cancer, 2025, 24(1): 27. doi：10.1186/s12943-024-02213-6

[25] Zhai JC, Tan R, Yuan SL, et al. Unveiling tectorigenin: a novel ferroptosis inducer targeting EGFR in bladder cancer[J]. Phytomedicine, 2025, 148: 157419. doi：10.1016/j.phymed.2025.157419

[26] Tan YJ, Ren YS, Lv JL, et al. Cistanoside F acts as a Mono-acylglycerol Lipase inhibitor that synergizes the anti-tumor effect of 2-Arachidonoyl Glycerol on Bladder cancer[J]. Phytomedicine, 2025, 145: 157046. doi：10.1016/j.phymed.2025.157046

[27] Chen RQ, Li YT, Zuo L, et al. Astragalus polysaccharides inhibits tumor proliferation and enhances cisplatin sensitivity in bladder cancer by regulating the PI3K/AKT/FoxO1 axis[J]. Int J Biol Macromol, 2025, 311: 143739. doi：10.1016/j.ijbiomac.2025.143739

[28] Zhang P, Zhang DF, Zhou WA, et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine[J]. Brief Bioinform, 2023, 25: bbad518. doi：10.1093/bib/bbad518

[29] Nogales C, Mamdouh ZM, List M, et al. Network pharmacology: curing causal mechanisms instead of treating symptoms[J]. Trends Pharmacol Sci, 2022, 43(2): 136-50. doi：10.1016/j.tips.2021.11.004

[30] Hollingsworth SA, Dror RO. Molecular dynamics simulation for all[J]. Neuron, 2018, 99(6): 1129-43. doi：10.1016/j.neuron.2018.08.011

[31] Chen O, Fu LL, Wang Y, et al. Targeting HSP90AA1 to overcome multiple drug resistance in breast cancer using magnetic nanoparticles loaded with salicylic acid[J]. Int J Biol Macromol, 2025, 298: 139443. doi：10.1016/j.ijbiomac.2024.139443

[32] Zhang NN, Shao Q, Xiang XN, et al. C1QL1 inhibits breast cancer through the HSP90α/VCP-ERS/UPR axis[J]. Exp Mol Med, 2025, 57(6): 1308-23. doi：10.1038/s12276-025-01486-1

[33] Sui Y, Shen ZY, Pan RT, et al. AHSA1-HSP90AA1 complex stabilized IFI6 and TGFB1 promotes mitochondrial stability and EMT in EGFR-mutated lung adenocarcinoma under Osimertinib pressure[J]. Cell Death Dis, 2025, 16: 298. doi：10.1038/s41419-025-07650-9

[34] Li YS, Dong MY, Qin HH, et al. Mulberrin suppresses gastric cancer progression and enhances chemosensitivity to oxaliplatin through HSP90AA1/PI3K/AKT axis[J]. Phytomedicine, 2025, 139: 156441. doi：10.1016/j.phymed.2025.156441

[35] An XY, Ma LS, Bai YL, et al. Nuciferine attenuates cancer Cachexia-induced muscle wasting in mice via HSP90AA1[J]. J Cachexia Sarcopenia Muscle, 2025, 16(2): e13777. doi：10.1002/jcsm.13777

[36] Wang K, Jiang XL, Jiang Y, et al. EZH2-H3K27me3-mediated silencing of mir-139-5p inhibits cellular senescence in hepato-cellular carcinoma by activating TOP2A[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2023, 42(1): 320. doi：10.1186/s13046-023-02855-2

[37] Wu ZH, Shi T, Shao Q, et al. Application of a CYP1B1-targeted NIR probe for breast cancer diagnosis, surgical navigation, and CYP1B1-associated chemotherapy resistance monitoring[J]. Mol Pharmaceutics, 2025, 22(3): 1507-17. doi：10.1021/acs.molpharmaceut.4c01223

[38] Xue YT, Yin TT, Yuan S, et al. CYP1B1 promotes PARPi-resistance via histone H1.4 interaction and increased chromatin accessibility in ovarian cancer[J]. Drug Resist Updat, 2024, 77: 101151. doi：10.1016/j.drup.2024.101151

[39] Fontana F, Giannitti G, Marchesi S, et al. The PI3K/Akt pathway and glucose metabolism: a dangerous liaison in cancer[J]. Int J Biol Sci, 2024, 20(8): 3113-25. doi：10.7150/ijbs.89942

[40] Zheng XC, Chen JW, Deng MH, et al. G3BP1 and SLU7 jointly promote immune evasion by downregulating MHC-I via PI3K/Akt activation in bladder cancer[J]. Adv Sci, 2024, 11(7): 2305922. doi：10.1002/advs.202305922

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021