GDF11通过抑制硫氧还蛋白1硝基化失活减轻心肌缺血/再灌注损伤

Growth differentiation factor 11 attenuates hypoxia/reoxygenation injury in rat H9C2 cardiomyocytes in vitro by inhibiting thioredoxin-1 nitrative inactivation

摘要

目的 探究生长分化因子11（GDF11）是否能够减轻心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤，并进一步探索其可能的机制。 方法 将培养的H9C2细胞置入厌氧培养室（95%N₂+5%CO₂）9 h后予以3 h复氧来模拟MI/R（SI/R）损伤。在复氧开始时将10 nmol/L的GDF11加入到细胞培养基中进行干预。实验分为：Sham组、Sham+GDF11组、SI/R组、SI/R+GDF11组。将iNOS抑制剂（1400W）及Trx1硝基化抑制剂（EUK134）干预分为：SI/R+1400W组、SI/R+EUK134组。SI/R+GDF11+hTrx1组、SI/R+GDF11+N-Trx1组分别为在GDF11干预的基础上分别给予重组人Trx1（hTrx1）、硝基化Trx1（N-Trx1）干预。采用MTT法及乳酸脱氢酶（LDH）释放水平检测细胞活力，TUNEL法及caspase-3活性检测心肌细胞凋亡，超氧化物水平及DHE染色法检测氧化应激水平，硝基酪氨酸含量及NO水平检测硝化应激水平，Western blotting法检测iNOS、gp91^phox、ASK1、p-ASK1等蛋白表达水平，胰岛素二硫还原试验检测Trx1活性，免疫共沉淀法检测Trx1硝基化水平。 结果 与单纯SI/R组相比，10 nmol/L GDF11能够增加SI/R后心肌细胞活力、减少LDH释放、抑制caspase-3激活及心肌细胞凋亡（P<0.01），能够减弱心肌细胞DHE染色红色荧光、减少超氧化物生成（P<0.01）、降低细胞内总NO浓度以及硝基酪氨酸生成（P<0.01），能够抑制iNOS表达（P<0.01）、抑制Trx1硝基化水平（P<0.01）、增强Trx1活性（P<0.01），还能够抑制心肌细胞SI/R 后ASK1 磷酸化（P<0.01）。1400W能够减少心肌细胞LDH释放（P<0.01）、减弱caspase-3激活（P<0.01）、减少总NO生成（P<0.01）、减少硝基酪氨酸生成（P<0.05）。EUK134能够减少心肌细胞LDH释放（P<0.05）、降低caspase-3活性（P<0.01b）、升高Trx活性（P<0.01）、减少超氧化物生成（P<0.01）。N-Trx1能够阻断GDF11减少LDH释放（P<0.05）及抑制caspase-3活性的作用（P<0.05）。 结论 GDF11可能通过减轻SI/R时氧化/硝化应激、抑制Trx1硝基化失活减轻心肌细胞凋亡，进而减轻MI/R损伤。

Abstract

Objective To verify the hypothesis that growth differentiation factor 11 (GDF11) attenuates myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury and explore the underlying mechanism. Methods To simulate MI/R injury, H9C2 cells were incubated in an anaerobic chamber (95% N₂+5% CO₂) for 9 h followed by 3 h of reoxygenation in the presence of GDF11 (10 nmol/L). The cells exposed to hypoxia/reoxygenation (H/R) or sham exposure were treated with GDF11 alone or in combination with the iNOS inhibitor 1400W, the Trx1 nitration inhibitor EUK134, human recombinant Trx1 (hTrx1) or N-Trx1, and the changes in cell viability was determined by MTT assay and LDH release assay. Cardiomyocyte apoptosis was determined by TUNEL staining and caspase-3 activity assessment, and oxidative stress levels were evaluated by measuring superoxide production and DHE staining. Nitrative stress in the cells was assessed by measuring total NO content and nitrotyrosine content. The expression levels of iNOS, gp91phox, ASK1 and p-ASK1 were detected using Western blotting, Trx1 activity was determined using insulin disulfide reduction assay, and Trx1 nitration was analyzed by immunoprecipitation. Results In H9C2 cells with H/R exposure, 10 nmol/L GDF11 treatment significantly increased cell viability, decreased LDH release, inhibited caspase-3 activation and cell apoptosis, and reduced superoxide production, total NO content and nitrotyrosine production. GDF11 also significantly inhibited iNOS expression, reversed H/R-induced increase of Trx1 nitration and inhibition of Trx1 activity, and inhibited ASK1 phosphorylation. Treatment of the cells with 1400W decreased LDH release and caspase-3 activity, and diminished total NO production and nitrotyrosine production. EUK134 diminished LDH release and caspase-3 activation, upregulated Trx activity, and inhibited superoxide production in H9C2 cells. N-Trx1 abolished the protective effects of GDF11 against H/R injury in the cardiomyocytes. Conclusion GDF11 protects cardiomyocytes against H/R injury partially by attenuating oxidative/nitrative stress and inhibiting Trx1 nitrative inactivation.

Graphical abstract

关键词

生长分化因子11 / 心肌缺血/再灌注损伤 / 氧化/硝化应激 / 硫氧还蛋白1 硝基化 / 凋亡

Key words

growth differentiation factor 11 / myocardial ischemia/reperfusion injury / oxidative/nitrative stress / thioredoxin-1 nitration / apoptosis

近年来，急性心肌梗死（AMI）的死亡率仍在持续增长，而冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）仍居于死亡原因的前列。随着血管介入技术的发展，越来越多的心梗患者得到及时救治，但再灌注损伤仍然是亟待解决的医学难题^［1］。既往大量研究显示氧化/硝化应激是MI/R损伤的重要机制之一^［2］，然而多种减轻氧化/硝化应激的干预手段和药物罕有成功转化为有效临床一线治疗的措施。

GDF11是TGF-β超家族的一员，是体内重要的生长调节分子^［3］。gdf11基因敲除小鼠会在出生后24 h内死亡，伴随肾脏、胰腺以及其他器官的发育缺陷^［4］。血浆GDF11水平随着年龄增长而下降，并与年龄相关性心肌肥大有关。通过注射重组GDF11蛋白可逆转这种年龄相关性心肌肥大^［5］。此外，GDF11还能够促进老年小鼠脑血管新生、骨骼肌再生以及抑制动脉瘤形成^［6-8］。在老年小鼠心肌组织中过表达GDF11能够改善心梗后心功能并减小心肌梗死面积^［9］。同时，临床研究显示，在稳定性缺血性心脏病患者中，高水平的GDF11与心血管事件及死亡的风险降低相关^［10］。因此，GDF11在MI/R损伤时可能发挥心肌保护作用，但其具体机制仍未完全阐明。

既往研究显示，MI/R损伤的重要机制之一是心肌过度产生的活性氧簇（ROS）、活性氮簇（RNS）、过氧亚硝基（ONOO^-）导致的心肌氧化/硝化应激^［2］。减轻氧化/硝化应激以及抑制ROS和RNS生成的方法都能够改善MI/R损伤。此外，老年人群心肌氧化/硝化应激明显增高，而其血浆GDF11水平却明显下降。综上，老龄化后心肌氧化/硝化应激增加可能与体内GDF11水平下降有关，但其具体机制仍未见报道。

硫氧还蛋白1（Trx1）通过维持细胞内氧化还原平衡，在MI/R时减轻氧化/硝化应激并抑制心肌细胞凋亡而减轻心肌损伤中发挥了重要作用。研究显示，MI/R诱导的Trx1硝基化失活显著加剧氧化/硝化应激。在老年小鼠体内，Trx1的过度硝基化失活会导致MI/R损伤的加重^［11］。然而，GDF11是否通过调节Trx1的活性并进而减轻MI/R损伤及其内在机制需要进一步阐明。

研究揭示GDF11对MI/R损伤的保护作用及机制，如外源性给予GDF11不仅通过调节自噬减轻低氧诱导的心肌细胞凋亡^［12］，还可通过抑制mtDNA损伤及NLRP3炎症小体活性减轻心肌MI/R损伤^［13］，同时，上调心肌细胞内源性GDF11表达可能也是减轻MI/R损伤的机制之一^［14］。但也有研究显示，连续30 d给予小鼠外源性GDF11可增加其心梗面积，且血浆中持续高水平的GDF11可能与心血管疾病高风险相关^［15］。基于此，GDF11对MI/R损伤的保护作用有待进一步验证，且其是否在不同的模型和实验条件下表现出不同的药理作用也有待深入研究。在MI/R过程中，心肌细胞损伤有众多的机制，GDF11是否参与调节氧化/硝化应激，及其下游信号通路是否与减轻硫氧还蛋白硝基化相关，仍未见报道。

因此，本研究通过细胞实验，采用不同的给药时间及浓度梯度进行预实验，反复摸索实验条件，验证了GDF11对心肌细胞SI/R损伤的保护作用，并进一步研究其是否通过抑制iNOS 及NADPH氧化酶表达来减轻SI/R诱导的心肌细胞氧化/硝化应激，并初步探讨Trx1硝基化是否参与到GDF11的心肌保护作用中。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

H9C2细胞（ATCC，CRL-1446）采用10%FBS的杜尔贝科改良伊格尔（DMEM， Hyclone，Logan，USA）培养基进行培养，培养基中加入100 units/mL青霉素及100 μg/mL链霉素，培养箱为37 ℃恒温、CO₂浓度为5%的湿润空气（恒温CO₂孵箱，Thermo Scientific）。传代至10~15代的细胞用于后续各项实验。

1.2 心肌细胞SI/R损伤模型的制备、实验分组及药物处理

将培养的心肌细胞消化离心后用新鲜的培养基重悬，接种在六孔板或9孔板中，培养约24~48 h，观察心肌细胞基本铺满孔底（80%~90%）后可进行SI/R实验。SI/R模型的制备：SI/R组的细胞，首先用PBS清洗2遍，再加入无糖无血清培养基1 mL，然后放入缺氧/复氧盒中，接通95%N₂+5%CO₂的混合气体通气约5 min，夹闭出气管，再夹闭进气管并将进出气管口连接密封；将缺氧/复氧盒平移入孵箱中，缺氧9 h；9 h后取出六孔板并立即置换常规培养基后置入37 ℃恒温、CO₂浓度为5%的湿润空气培养箱中进行复氧；复氧3 h后可收集细胞，进行相关指标检测。GDF11（Peprotech， New Jersey， USA）用去离子水溶解后配置成相应的浓度，在复氧开始时加入细胞培养基。GDF11药物浓度选择时的分组：Sham组、SI/R+Vehicle组、SI/R+G50组、SI/R+G10组、SI/R+G5组、SI/R+G0.5组（G50、G10、G5、G0.5分别代表加入的GDF11浓度为50、10、5、0.5 nmol/L）。经选择10 nmol/L为GDF11最佳的给药浓度，故后续实验GDF11处理组浓度均为10 nmol/L。在细胞损伤及机制探究实验中分组如下：Sham+Vehicle组、Sham+GDF11组、SI/R+Vehicle组、SI/R+GDF11组。Vehicle为相同体积的去离子水。

为了研究iNOS及Trx1硝基化在GDF11减轻心肌细胞SI/R损伤中的作用，我们分别给予细胞 iNOS抑制剂（1400 W）及 Trx1硝基化抑制剂（EUK134）处理。实验分组为：Sham组、SI/R组、SI/R+1400W组、SI/R+ EUK134组、SI/R+GDF11组。1400W（50 μmol/L，Cayman Chemical）以及EUK134（7 μmol/L，Cayman Chemical）均为缺氧前48 h加入细胞培养基。

为进一步明确Trx1硝基化在GDF11心肌保护中的作用，我们分别给予细胞重组人Trx1（hTrx1）或硝基化Trx1（N-Trx1）。实验分组为：Sham组、SI/R+Vehicle组、SI/R+GDF11组、SI/R+GDF11+hTrx1组、SI/R+GDF11+N-Trx1组。GDF11、hTrx1（1 µg/mL，Sigma， USA）及N-Trx1（1 µg/mL）均在复氧开始时加入细胞培养基。N-Trx1的体外制备：纯化的hTrx1以0.1 μmol/L溶解在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，继而在37 ℃条件下与Sin-1（终浓度100 μmol/L，Cayman Chemical）共同孵育30 min。未反应的Sin-1通过截留相对分子质量为10-kDa超滤膜去除^［11］。

1.3 心肌细胞活力及LDH 释放水平检测

采用MTT法检测细胞活力。10 μL MTT（5 mg/mL）与 100 μL 培养基混合后加入96孔板的各个孔中，37 ℃培养4 h后去除培养基，在各孔中加入200 μL二甲基亚砜并充分混匀使细胞充分裂解。LDH释放水平通过LDH检测试剂盒检测（Byotime）。在96孔板的各孔中分别加入60 μL LDH 检测液及120 μL细胞上清液，充分混匀后在37 ℃避光培养30 min，采用SpectraMax M2/M2e微孔读板器检测其吸光度A_{490 nm} （Molecular Devices）。

1.4 心肌细胞凋亡的检测

参照我们前期实验，心肌细胞凋亡采用TUNEL 法（Roche），caspase-3活性检测采用试剂盒（Beyotime）^［16］。

1.5 超氧化物及硝基酪氨酸水平检测

氧化/硝化应激是MI/R损伤的重要机制之一。而超氧化物、总NO以及硝基酪氨酸水平是心肌细胞内氧化/硝化应激程度的重要指标。超氧化物的检测采用光泽精化学发光法，并以RLU/s/mg protein来表达结果。DHE染色法用来检测原位超氧化物的生成，红色荧光越强提示细胞内超氧化物含量越高（DHE，Beyotime）。硝基酪氨酸的含量检测方法参考我们前期研究文献［11］。

1.6 NO水平检测

收集培养基上清液后采用NO检测试剂盒检测NO浓度（Beyotime）。培养皿各孔中细胞的蛋白含量采用BCA蛋白检测试剂盒检测（Beyotime）。NO含量以 μmol/mg 蛋白来表示。

1.7 Western blotting法检测iNOS、gp91^phox、ASK1及p- ASK1蛋白水平

充分混匀的细胞蛋白提取液会在十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶中被分离，并转移至硝酸纤维素膜，先与一抗孵育（iNOS ［Cell Signaling Technology，MA，USA］，gp91^phox ［Santa Cruz Biotechnology］，ASK1及p-ASK1［Cell Signaling Technology］），再与辣根过氧化物酶共轭的二抗孵育。蛋白条覆盖化学发光试剂后（Millipore）采用UVP Bio-Imaging系统采集影像。蛋白水平通过 Vision Works LS 系统获得并进行分析。

1.8 Trx1活性及其硝基化水平检测

Trx1活性通过胰岛素二硫还原试验进行检测^［11］。Trx1硝基化检测采用免疫共沉淀的方法。内源性Trx1通过一个单克隆抗鼠Trx1抗体进行共沉淀（Cell Signaling Technology），之后再使用硝基酪氨酸的单抗（Santa Cruz Biotechnology）检测Trx1硝基化水平。

1.9 统计学分析

数据以均数±标准误表示，统计分析采用SPSS 23.0软件进行，绘图采用Graphpad Prism 9.0软件进行。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用两样本非配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDF11能够减轻SI/R诱导的心肌细胞损伤和凋亡

与SI/R+Vehicle组相比，在复氧开始时给予心肌细胞5、10、50 nmol/L GDF11均能够增强SI/R后心肌细胞活力（图1A），减少LDH释放（图1B），且在10 nmol/L 浓度时发挥最大保护作用（P<0.01，图1A、B）。因此，后续实验我们均采用10 nmol/L 浓度进行。TUNEL结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，给予GDF11后心肌细胞凋亡率显著降低（P<0.01，图1C）。caspase-3活性检测结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，给予GDF11可显著降低SI/R诱导的caspase-3 激活（P<0.01，图1D）。

2.2 GDF11减轻SI/R后心肌细胞氧化/硝化应激

SI/R后心肌细胞内超氧化物水平、总NO含量、硝基酪氨酸含量均显著升高，给予GDF11后能够显著改善细胞内氧化/硝化应激水平（P<0.01，图2）。DHE染色结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组细胞红色荧光明显减弱，提示细胞内超氧化物水平降低（图2A）。超氧化物含量检测结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组心肌细胞内超氧化物含量显著降低（P<0.01，图2B）。总NO含量检测结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组心肌细胞内总NO含量显著降低（P<0.01，图2C）。硝基酪氨酸含量检测结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组心肌细胞内硝基酪氨酸含量显著降低（P<0.01，图2D）。

2.3 GDF11抑制SI/R诱导的iNOS表达上调及Trx1硝基化失活

与Sham组相比，SI/R可导致心肌细胞iNOS、gp91^phox表达显著增高（P<0.01，图3A~C）。与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组心肌细胞iNOS表达明显降低（P<0.01，图3A、B），而gp91^phox的表达没有明显变化（图3A、C）。Trx1硝基化结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组心肌细胞Trx1硝基化水平明显降低（P<0.01，图3D、E）。Trx1活性检测结果显示，与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组心肌细胞Trx1活性明显升高（P<0.01，图3F）。

2.4 GDF11减轻心肌细胞SI/R损伤的作用类似于抑制iNOS活性或抑制Trx1硝基化

与单纯SI/R+Vehicle组相比，SI/R+1400W组心肌细胞LDH释放减少（P<0.01，图4A）、caspase-3活性降低（P<0.01，图4B）、总NO生成减少（P<0.01，图4C）、硝基酪氨酸生成减少（P<0.05，图4D）。相似地，与单纯SI/R组相比，SI/R+EUK134组心肌细胞LDH释放减少（P<0.05，图4A）、caspase-3活性降低（P<0.01，图4B）、Trx活性升高（P<0.01，图4C）、超氧化物生成减少（P<0.01，图4F）。而给予GDF11组的心肌细胞也表现出类似的作用（P<0.01，图4）。

2.5 GDF11抑制心肌细胞SI/R 后ASK1 磷酸化

与Sham组相比，SI/R可导致心肌细胞ASK1磷酸化水平显著增高（P<0.01，图5）。与SI/R+Vehicle组相比，SI/R+GDF11组心肌细胞ASK1磷酸化水平明显降低（P<0.01，图5），提示GDF11可通过抑制SI/R导致的心肌细胞ASK1磷酸化激活而减少细胞凋亡。

2.6 硝基化Trx1（N-Trx1）能够阻断GDF11的心肌保护作用

hTrx1与Sin-1体外孵育可获得N-Trx1（图6A）。与单纯SI/R+Vehicle组相比，给予心肌细胞GDF11或GDF11+hTrx1处理，均能够显著减轻心肌细胞SI/R损伤，表现为LDH释放减少（P<0.01，图6B）、caspase-3活性降低（P<0.01，图6C）。相反，与单纯SI/R+Vehicle组相比，GDF11不能减轻N-Trx1组心肌细胞的SI/R损伤（图6B、C）。换言之，N-Trx1取消了GDF11对心肌细胞SI/R损伤的保护作用，与SI/R+GDF11组相比，给予N-Trx1后心肌细胞LDH释放增加（P<0.05，图6B）、caspase-3活性增高（P<0.05，图6C）。

3 讨论

本研究通过细胞实验证实，在SI/R时，GDF11具有心肌保护作用。GDF11部分通过抑制复氧时细胞内的氧化/硝化应激水平发挥其保护作用，其机制可能与抑制SI/R时iNOS表达和Trx1硝基化失活相关。该结果提示GDF11可能作为减轻MI/R损伤的新治疗靶点。

近年来，GDF11因其能够逆转诸如年龄相关性心肌肥大、骨骼肌功能退化、认知障碍等与老化相关疾病的作用而受到广泛关注^{［5-7， 17］}。在成年人中，心肌和骨骼肌等诸多组织都可以生成GDF11，成熟的GDF11被分泌到血清中与ActRⅡB/A受体结合，激活转录因子Smads后转位至细胞核中参与调节一系列基因的表达^{［18， 19］}。然而，GDF11在成年体内及老化过程中的作用仍是未解之谜。特别是，有不少研究得出了阴性甚至相反的结果，如有研究显示GDF11并不能改善骨骼肌再生反而会使其恶化^［20］，甚至也不能改善老化相关的心衰^［21］。GDF11的作用正在争论与质疑中逐渐被发掘^［22］。

研究显示，血浆GDF11水平在人类和哺乳动物中都随着年龄增大而降低，在糖尿病心肌病小鼠心肌组织中的表达也明显降低^［23］。而且，注射GDF11后能够逆转老化相关的症状，促进缺血后神经组织血管新生及神经再生^{［24， 25］}，这就说明GDF11在治疗老化相关性疾病中具有一定潜能。在老年心肌中，MI/R损伤会进一步加重，同时伴随着过度的氧化/硝化应激水平^［26］。但是，一些在青年动物中能够减轻MI/R损伤的干预措施在老年心肌中却不能发挥同样的作用，说明老年动物体内可能存在一些内源性保护因子的减少，比如血浆GDF11水平降低。在与老龄化相关的疾病如心衰中，可因GDF11缺乏导致的心脏血管新生受损而加速心衰进程^［27］。因此，本研究直接检测了GDF11对心肌细胞的SI/R损伤的保护作用，结果显示其能够通过减少心肌细胞凋亡从而减轻心肌损伤。既往研究显示，老化心脏MI/R后心肌细胞凋亡显著增加^［28］，结合本研究结果，这种损伤加重可能源自于老化导致的 GDF11 缺乏。一项大型的临床研究也得出了类似的结论，该研究显示人血浆GDF11水平随着年龄增加而降低，而在稳定的缺血性心脏病患者中，高血浆GDF11水平与低心血管事件风险及终点死亡具有相关性^［10］。另有研究显示，GDF11可通过促进线粒体生物合成及端粒酶活性减轻MI/R损伤^［29］。此外，近期研究显示，GDF11可通过激活自噬减缓氧化应激导致的移植入心肌的内皮祖细胞老化^［30］，上调GDF11表达可抑制动脉粥样硬化^［31］，心梗后给予GDF11蛋白或过表达GDF11能够减少巨噬细胞浸润并促进心脏再生修复^［32］，这些结果均证实GDF11在心肌保护中发挥多重作用。针对MI/R损伤，近年的研究逐渐发现一些可能的机制，如GDF11还可通过抑制mtDNA损伤及NLRP3炎症小体活性减轻心肌MI/R损伤^［13］，可通过调节自噬减轻低氧诱导的心肌细胞凋亡^［12］，包括上调心肌细胞内源性GDF11表达^［14］。我们的研究也进一步验证了GDF11对心肌细胞SI/R损伤的保护作用，而且从全新的角度初步探讨了其机制与氧化/硝化应激的关系，以及Trx1硝基化在其中的角色。但也有研究显示，连续30 d给予小鼠外源性GDF11可增加其心梗面积^［15］。我们认为可能与不同的模型及实验条件相关，更可能与GDF11本身在不同的药物浓度或病理生理条件下发挥不同的生理作用相关。随着研究的不断深入，我们将对GDF11的作用形成更加全面的认识。

凋亡在MI/R损伤中扮演着重要角色，而氧化/硝化应激是促发凋亡启动的重要因素之一^［2］。MI/R诱导的ROS和RNS生成是细胞内氧化/硝化应激的主要来源。因此，我们首先检测了GDF11对SI/R诱导的细胞氧化/硝化应激的作用。结果显示，GDF11能够显著减轻SI/R诱导的心肌细胞超氧化物和硝基酪氨酸生成，减少总NO水平，提示GDF11能够调节 ROS和RNS的生成或者对它们进行解毒。NADPH氧化酶是超氧化物生成的重要底物，而iNOS促进病理性NO的生成。GDF11能够显著抑制iNOS 表达，但对gp91^phox的表达无明显作用。虽然iNOS 的表达下调部分解释了GDF11减轻硝化应激的作用，但是其减轻氧化应激的作用并非通过对gp91^phox 表达的抑制。MI/R诱导的硝化应激以及过度生成的硝基酪氨酸可以导致Trx1硝基化失活丧失其维持细胞内氧化还原平衡的能力。硝基化失活的Trx1丧失其心肌保护功能以及抑制肺纤维化的能力^［33］。本研究发现，SI/R诱导的心肌细胞损伤时也伴随着Trx1硝基化水平明显增高，其活性明显下降，而给予GDF11后能够逆转这种现象并进而减轻细胞内氧化/硝化应激。Trx1不仅能够通过减轻氧化应激来维持细胞内氧化还原平衡，还能够与促凋亡因子ASK1 相互作用并抑制其激活来减少MI/R诱导的心肌细胞凋亡^［34］。因此，GDF11可能通过抑制SI/R后心肌细胞内的Trx1硝基化失活，促进其与ASK1结合，从而减少心肌细胞凋亡。然而，GDF11减轻SI/R 诱导的心肌细胞氧化应激水平下降是否存在其他的抗氧化酶参与，还需要更加深入的研究。

综上所述，本研究证实GDF11能够减轻心肌细胞SI/R 损伤，并发现其机制可能是部分通过抑制Trx1硝基化失活从而减轻SI/R后细胞内的氧化/硝化应激。这不仅能够为研究减轻MI/R损伤的方法提供新的靶点，而且也是对血浆GDF11水平下降的老年人群、糖尿病人群MI/R损伤加重的深入理解提供一定的证据支持。但本部分研究也存在不足之处，如局限于细胞实验以及对GDF11的信号转导通路没有完全阐明等，这也是后续在体实验的研究重点。

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基金资助

陕西省自然科学基础研究计划资助项目(2020JQ-538)

陕西省重点研发计划资助项目(2025SF-YBXM-316)

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