利拉鲁肽可改善糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠受损心脏结构和功能

Liraglutide improves cardiac structure and function in mice with advanced diabetic nephropathy and massive proteinuria

摘要

目的 探讨利拉鲁肽对糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠心脏结构及功能的影响。 方法 选取20只SPF级12周龄雄性自发2型糖尿病KKAy小鼠，10只SPF级12周龄雄性C57BL/6J小鼠，KKAy小鼠给予高脂饲料喂养、C57BL/6J 小鼠给予普通饲料喂养10周。糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠模型造模后分组，将KKAy小鼠随机分为2组（n=10）：模型组（DM）、利拉鲁肽组；10只C57BL/6J小鼠为正常对照组。药物干预8周后获取超声指标评估各组小鼠心脏结构和功能，HE染色、Masson染色、天狼星红染色（SRS）及透射电镜（TEM）观察小鼠心脏组织病理变化，并获取小鼠血清相关指标评估其心功能。RT-qPCR、Western blotting检测CollagenI、CollagenIII的mRNA及蛋白表达量。 结果 与对照组相比，DM组小鼠血糖、体质量升高（P<0.05），HE、Masson、SRS染色结果显示，DM组小鼠出现明显的心肌细胞形状不规则、排列紊乱，心肌间质及血管周围胶原纤维沉积，I、III型胶原纤维比例失衡。CollagenI、CollagenIII的mRNA及蛋白表达量均上调。DM组小鼠的心脏超声结果显示糖尿病小鼠心率降低（P<0.05），收缩末期左心室前壁厚度、舒张末期左心室前壁厚度、收缩末期左心室后壁厚度、舒张末期左心室后壁厚度、收缩末期室间隔厚度、舒张末期室间隔厚度均增加（P<0.05），左心室舒张末期内径、左心室收缩期内径减小（P<0.05），左心室心肌质量增大（P<0.05），左心室射血分数、缩短分数、左心室面积变化分数及舒张早期（E）至舒张晚期（A）二尖瓣口血流多普勒E/A值均下降（P<0.05），左心室等容舒张时间延长（P<0.05）。而利拉鲁肽干预组以上病理改变减轻。 结论 糖尿病肾病大量蛋白尿期的小鼠表现出左心室肥厚及心功能下降，心肌组织间质纤维化和炎症反应突出。利拉鲁肽可能通过减轻糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠的心脏纤维化及炎症反应而改善其受损的心脏结构和功能。

Abstract

Objective To investigate the effects of liraglutide on cardiac structure and function in a mouse model of diabetic nephropathy at the massive proteinuria stage. Methods Twenty 12-week-old male spontaneous type 2 diabetic KKAy mice were fed a high-fat diet for 10 weeks to establish diabetic models with massive proteinuria, which were then randomly divided into diabetic model group and liraglutide treatment group, with 10 age-matched C57BL/6J mice fed a standard chow diet serving as the normal control group. After 8 weeks of intervention, cardiac structural and functional parameters of the mice were evaluated using echocardiography, and myocardial histopathological changes were observed with HE staining, Masson's trichrome staining, Sirius red staining, and transmission electron microscopy. Serum levels of cardiac-related indicators were measured, and the mRNA and protein levels of collagen I and collagen III were determined using RT-qPCR and Western blotting, respectively. Results The diabetic mouse models showed significantly elevated blood glucose and increased body weight (P<0.05) with disordered myocardial fibers, severe interstitial and perivascular fibrosis, and markedly upregulated myocardial expressions of collagen I and collagen III. Echocardiography revealed significantly increased left ventricular wall thickness, interventricular septal thickness, and left ventricular mass, reduced left ventricular internal diameter, decreased LVEF, FS, FAC, and the E/A ratio, and prolonged IVRT in the mouse models. Liraglutide treatment significantly improved these pathologies and alleviated cardiac functional impairment in the diabetic mice. Conclusion Mice with diabetic nephropathy and massive proteinuria exhibit left ventricular hypertrophy and reduced cardiac function, accompanied by prominent myocardial interstitial fibrosis and inflammatory responses. Liraglutide improves cardiac structural and functional impairments in these mice possibly by alleviating myocardial fibrosis and inflammatory responses.

Graphical abstract

关键词

糖尿病 / 利拉鲁肽 / KKAy小鼠 / 心肌纤维化 / 大量蛋白尿期

Key words

diabetes / liraglutide / KKAy mice / myocardial fibrosis / massive proteinuria stage

糖尿病已成为全球重大的公共卫生问题，目前全球患者约5.89亿，预计2050年将增至8.53亿^［1］。长期持续高血糖引发的代谢紊乱会导致多系统并发症，其中心血管疾病（CVD）是糖尿病患者的首要死因，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者死于CVD的风险增加2~3倍^{［2， 3］}。研究显示，约2/3的糖尿病死亡病例源于冠状动脉粥样硬化性心脏病或心力衰竭^［4］。研究发现发病年龄较大且伴有微量蛋白尿或大量蛋白尿的糖尿病患者，死于CVD的风险会更高^［5］。有大量白蛋白尿的糖尿病患者出现CVD的风险是无白蛋白尿糖尿病患者的4~5倍^［6］。糖尿病大量蛋白尿期的患者发生心血管事件的风险是无糖尿病及蛋白尿受试者的4.09倍^［7］。蛋白尿与糖尿病患者左心室收缩及舒张功能障碍显著相关^［8］。可见糖尿病及蛋白尿并存会对CVD的发生风险产生叠加效应。糖尿病肾病（DKD）作为糖尿病的主要微血管并发症，与心血管风险高度关联，尤其在大量蛋白尿期（尿蛋白/肌酐比值UACR>300 mg/g），不仅标志DKD进展至中晚期，更意味着全身血管损伤加重，心脏承受更高的纤维化、重构及功能障碍的风险^［9］。因此，针对“糖尿病肾病大量蛋白尿期”这一高风险节点探索心脏保护策略，对临床降低糖尿病心血管致死率具有重要意义。

心肌纤维化是糖尿病心血管并发症进展的核心病理环节，高血糖、胰岛素抵抗及慢性炎症共同促进心肌成纤维细胞活化，导致I、III型胶原过度沉积，进而引发左心室肥厚、顺应性下降，最终进展为心力衰竭^{［10， 11］}。胰。研究显示利拉鲁肽可通过抑制内质网应激（CHOP 通路）、激活AMPK介导的自噬，减轻STZ诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化^{［12， 13］}；司美格鲁肽则能抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖，降低I、III型胶原表达^［14］。此外，胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）在心脏内皮细胞、心肌细胞及成纤维细胞中广泛表达，为其心脏保护作用提供了分子基础^{［15， 16］}。然而，现有研究仍存在明显不足，目前多数研究采用链脲佐菌素（STZ）化学诱导的糖尿病模型，或仅关注糖尿病早期阶段，缺乏对“自发性2型糖尿病肾病大量蛋白尿期”这一临床常见高风险人群的模拟^［17］。部分研究仅聚焦心肌纤维化，未系统整合心脏结构与功能的综合改变^{［18， 19］}，也有涉及超声评估的研究，也未结合透射电镜观察心肌超微结构的损伤，难以全面反映心脏病变的严重程度^［20］。现有利拉鲁肽对糖尿病患者的心脏保护研究多针对于无肾病或微量蛋白尿期的患者，而在糖尿病肾病大量蛋白尿阶段，肾脏出现了不可逆的损伤，同时伴随更复杂的代谢紊乱，在这一阶段的心脏病理改变、利拉鲁肽的心脏保护效应及安全性有待进一步验证。

KKAy小鼠作为自发性2型糖尿病模型，其肥胖及胰岛素抵抗的代谢特征更贴近临床2型糖尿病，本研究首次以自发性2型糖尿病KKAy小鼠为实验对象，构建糖尿病肾病大量蛋白尿期实验模型，整合超声心动图、病理染色、透射电镜及分子生物学的综合评估体系，全面解析糖尿病肾病大量蛋白尿期的心脏病变特征，针对性验证利拉鲁肽对糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠心脏的保护作用，为临床制定分层治疗方案提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雄性KKAy小鼠（12周龄，体质量35.0±2.0 g）、C57BL/6J小鼠（12周龄，体质量22.0±2.0 g）均购自北京华阜康生物科技股份有限公司［SCXK（京） 2019－0008］。实验小鼠在甘肃中医药大学动物实验中心SPF级动物实验动室［SYXK（甘）2021－0004］常规饲养，温度20~24 ℃，湿度40%~60%，每12 h交替照明。KKAy小鼠给予高脂饲料喂养，C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养，饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。本研究样本量参考既往研究^［17］，基于糖尿病心肌病模型构建成功后血糖指标进行科学计算，通过 G*Power 3.1计算，考虑到 KKAy小鼠作为自发性糖尿病模型，参考本实验室既往同类型实验数据，长期高脂喂养及药物干预的预期死亡率为20%~30%，及麻醉意外、样本检测失败退出等因素，为确保实验结束后每组仍有充足有效样本，将初始样本量扩大至10只/组。

所有小鼠均自由进食饮水，建立糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠模型。实验过程中观察小鼠的活动状态、毛色、精神状态、饮食、二便情况，每2周监测血糖及体质量。测KKAy小鼠随机血糖>16.7 mmol/L，视为糖尿病模型成立，随后每2~4周检测小鼠尿蛋白及肌酐，喂养10周后测得KKAy小鼠尿白蛋白肌酐比值（UACR）>300 mg/g，提示糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠模型成立。将建模成功的KKAy小鼠随机分为模型组（DM）和利拉鲁肽组（DM+L），C57BL/6J小鼠为正常对照组，10只/组。从22周龄开始，利拉鲁肽组给予利拉鲁肽200 μg/（kg∙d）皮下注射，DM组和对照组给予同等剂量生理盐水皮下注射，干预8周，直至30周龄。实验操作过程中KKAy小鼠死亡3只，C57BL/6J小鼠死亡2只。本研究经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：SY2024-262）。

1.2 实验试剂及仪器

1.2.1 实验试剂

甘油三酯（TG）比色法测试盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）比色法测试盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）比色法测试盒、总胆固醇（TC）比色法试剂盒、小鼠微量白蛋白尿酶联吸附测定试剂盒、尿素比色法测试盒（Elabscience），小鼠N端前脑钠肽（NT-proBNP）ELISA试剂盒（江苏酶免）；苏木素伊红染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝）；天狼星红染液、环保型脱蜡液（Servicebio）；无水乙醇、二甲苯（国药集团）；载玻片、盖玻片（江苏世泰）；石蜡（上海华申康复）；Epon812树脂（Structure Probe）；TRIZOL试剂（赛默飞世尔科技有限公司），Prime Script RT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq（艾科瑞）。

1.2.2 主要仪器

罗氏活力血糖仪（上海罗氏制药）；组织切片机（Thermo Fisher Scientific）；组织包埋机冷冻机（浙江科迪）；生物组织自动包埋机（沈阳龙首）；全封闭式组织脱水机（TP 1020）、超薄切片机（EMUC7）（Leica）；高分辨率小动物超声成像仪（S-Sharp Prospect T1）。光学显微镜（Olympus）；显微镜成像系统（NIKON）；透射电镜（FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin），分光光度计（DeNovix），电热恒温水浴锅（一恒科技仪器有限公司），7500 fast Real time PCR仪（ABI）。

1.3 实验方法

1.3.1 血糖、体质量和UACR检测

固定小鼠，选择尾静脉较为明显的部位用酒精棉签消毒后，用采血针刺破尾部血管轻轻挤压尾部，使血液流出，用罗氏活力血糖仪检测随机血糖。将小鼠放在专用小动物秤称重并记录体质量。将小鼠置于代谢笼，收集24 h尿液，记录尿量，离心后分离上清，用试剂盒按照说明书检测尿肌酐和尿蛋白含量，计算UACR。

1.3.2 超声心动图评估

小鼠吸入异氟烷（2%~3%）麻醉下获取经胸廓二维、M模式超声心动图和脉冲波多普勒谱成像，记录小鼠心率（HR）、小鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩期内径（LVIDs）、收缩末期室间隔厚度（IVSs）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）、收缩末期左心室后壁厚度（LVPWs）和舒张末期左心室后壁厚度（LVPWd）、舒张末期左心室前壁厚度（LVAWd）、收缩末期左心室前壁厚度（LVAWs）、舒张早期（E）至舒张晚期（A）二尖瓣口血流多普勒E/A值、左心室等容舒张时间（IVRT）、左室面积变化分数（FAC%），并计算缩短分数（FS%）、左心室心肌质量。检测前通过加热垫维持小鼠体温，全程监测呼吸，单只小鼠检测时间≤10 min，检测后给予吸氧辅助复苏。实验过程中，2只 C57BL/6J 小鼠因个体麻醉耐受性差异及麻醉-操作应激叠加，偶发呼吸循环抑制死亡。为保证组间样本量均衡，最终对照组、DM组、利拉鲁肽干预组均纳入7只小鼠进行统计分析，满足统计效能要求。

1.3.3 小鼠血清NT-proBNP、TC、TG、HDL、LDL检测

禁食禁水8 h，使用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球采集血样，并收集血清保存在EP管中，用试剂盒按照说明书检测小鼠血清NT-proBNP、TC、TG、HDL、LDL。

1.3.4 小鼠心脏组织HE、Masson和Sirius red染色及心脏指数

解剖小鼠，开胸取出心脏，冰盐水冲洗后称重，测量小鼠胫骨长度，计算小鼠心脏质量与胫骨长度的比值，获得心脏指数。切取部分心脏组织放入组织固定液固定、经常规脱水、石蜡包埋，制成4 μm厚的石蜡切片，经常规脱蜡后行HE、Masson、SRS染色，光学显微镜及偏振光显微镜观察、拍照。

1.3.5 小鼠心脏组织的透射电镜（TEM）观察

取出心脏组织，冰盐水冲洗去除血液，选取心尖部分心脏组织，切成1~3 mm³的小块，放入电镜固定液中，4 ℃固定过夜，之后用0.1 mol/L PBS漂洗3次，10 min/次，再用1%锇酸固定液后固定、乙醇梯度脱水、浸透包埋，用超薄切片肌将包埋好的组织切成50 nm厚的薄片，并将切片捞至铜网上，用2%醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，然后用蒸馏水冲洗、干燥，后将铜网放入透射电镜中观察、拍照。

1.3.6 RT-qPCR实验检测小鼠心脏胶原纤维mRNA相对表达量

取30 mg小鼠心脏组织，使用TRIZOL试剂从小鼠心肌组织中提取RNA，并使用分光光度计进行光谱定量。使用带有gDNA 擦除剂的 Prime Script RT 试剂试剂盒对1 μg RNA 进行逆转录，并使用相应的特异性引物扩增50 ng的cDNA。CollagenI正向引物：ACCTATCACTGCAAGAACAGCGT，反向引物：GGAGGTCTTGGTGGTTTTGTATT；CollagenIII正向引物：GTGGCAATGTAAAGAAGTCTCTGAAG，反向引物：GGGTGCGATATCTATGATGGGTAG；引物序列由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。PCR扩增按照试剂盒说明，在电热恒温水浴锅中使用SYBR Premix Ex Taq进行。以β-actin的PCR扩增用作标准化对照。实时PCR检测使用7500 fast Real time PCR仪进行。β-actin的正向引物：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA，反向引物：GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC。循环设置为95 ℃ 15 s，随后60 ℃ 30 s，重复40次。仪器默认设置溶解曲线，读取CT值，并计算相应mRNA相对表达含量。

1.3.7 Western blotting实验检测小鼠心脏胶原纤维化蛋白相对表达量

取30 mg小鼠心脏组织加入RIPA组织裂解液，超声破碎后12 000 r/min离心10 min取上清液，定量后进行SDS-PAGE分离蛋白，并电转移到PVDF膜，5%的脱脂奶粉室温封闭１h，然后与按抗体：抗体稀释液（1∶1000）比例稀释好的CollagenI、CollagenIII抗体孵育，４ ℃轻摇过夜，TBST洗膜，HRP标记山羊抗兔二抗（1∶20 000）室温孵育１ h，TBST洗膜，ECL发光液检测蛋白条带，ImageJ软件分析条带灰度值，以GAPDH作为上样内参，每组３个重复。

1.4 统计学分析

采用SPSS27.0软件统计分析数据，所得数据均进行正态性检验，服从正态分布的计量资料用均数±标准差表示，符合方差齐性的多组间比较用单因素方差分析。方差不齐采用Games-Howell检验，非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异具有统计学意义。用imageJ软件分析I型和III胶原的含量及比例。所有实验独立重复3次。

2 结果

2.1 利拉鲁肽对糖尿病小鼠一般状态、体质量、血糖及UACR的影响

对照组小鼠饮食饮水正常，生长状况良好，毛色有光泽，活动正常，体质量及血糖稳定。与对照组相比，DM组小鼠体质量及血糖升高（P<0.001），出现精神萎靡，活动度减少。在给药前、给药4周、8周后DM组和DM+L组体质量及血糖均高于对照组（P<0.001）；利拉鲁肽干预8周后，DM+L组体质量增加量与对照组差异无统计学意义（P=0.638），而DM组体质量增加量明显高于对照组（P<0.001）；与DM组相比，DM+L组在给药前体质量及血糖差异无统计学意义（P>0.05），在给药4周、8周后体质量及血糖下降（P<0.05），体质量增加量明显低于DM组（P<0.001）。药物干预前DM小鼠UACR大于300 mg/g，且DM组与DM+L差异无统计学意义（P>0.05，表1~3）。

2.2 利拉鲁肽对糖尿病小鼠N末端B型利钠肽（NT-proBNP）及心脏指数的影响

与对照组相比，DM组NT-proBNP升高（P<0.001），DM+L组与对照组的NT-proBNP差异无统计学意义（P>0.05）；DM组及DM+L组心脏指数高于对照组（P<0.001）；与DM组相比，DM+L组NT-proBNP及心脏指数下降（P<0.05，表4）。

2.3 利拉鲁肽对糖尿病小鼠血脂的影响

与对照组相比，DM组和DM+L组小鼠TC、HDL及LDL均升高（P<0.05）；而TG差异无统计学意义（P>0.05）；与DM组相比，DM+L组TC、TG、HDL、LDL差异均无统计学意义（P>0.05，表5）。

2.4 利拉鲁肽对糖尿病小鼠心脏超声结构和功能指标的影响

与对照组相比，DM组小鼠心率降低（P<0.05），LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd均增加（P<0.05），LVIDs、LVIDd减小（P<0.05），LVmass增大（P<0.05），LVEF、FS、FAC及E/A值均下降（P<0.05），IVRT显著延长（P<0.05）；DM+L组小鼠心率差异无统计学意义（P=0.061），LVPWs、LVPWd、LVAWd、IVSs均明显增加，LVIDs减小，LVmass增大，E/A值下降（P<0.05），而LVAWs、IVSd、LVIDd、LVEF、FS及FAC差异无统计学意义（P>0.05）。与DM组相比，DM+L组心率明显升高（P<0.001），LVAWs、LVAWd、LVPWd均降低（P<0.05），LVPWs、IVSs、IVSd、LVmass差异无统计学意义（P>0.05），LVIDd增大（P<0.05），IVRT缩短（P<0.05），LVIDs差异无统计学意义（P>0.05），LVEF、FS及FAC均增加（P<0.05），E/A值增大（P<0.05，图1、表6）。

2.5 利拉鲁肽对糖尿病小鼠心脏组织病理改变及纤维化的影响

HE染色结果显示，对照组小鼠心肌细胞排列整齐，胞浆染色均匀清晰，细胞核致密且大小均一，未见细胞坏死及炎症细胞浸润。与对照组相比，DM组小鼠心肌纤维组织紊乱、疏松，肌纤维增粗，部分溶解断裂，心肌间质炎性细胞浸润明显。与DM组相比，DM+L组心肌组织病理改变减轻（图2A）。

Masson染色结果显示，对照组小鼠心肌纤维结构清晰，心肌间质及血管周围伴有少量胶原纤维沉积。与对照组相比，DM组小鼠心肌纤维减少，心肌间质及血管周围大量胶原纤维沉积。与DM组相比，DM+L组心肌间质及血管周围胶原纤维沉积不同程度的减少（图2A、B）。

SRS染色偏振光结果显示，I型胶原纤维呈橙黄色，III型胶原纤维化呈绿色，对照组小鼠胶原纤维纹理清晰，走向一致，I型胶原纤维化面积大于III型胶原纤维面积，与对照组比较，DM组小鼠胶原纤维面积分数明显增加（P<0.05），且排列紊乱，I/III型胶原面积比值升高（P<0.001），比例失衡；与DM组相比，DM+L组小鼠胶原纤维面积分数减小（P<0.05），I/III型胶原面积比值下降（P<0.05），I、III型胶原比例失衡有所改善（图2A、B）。

RT-qPCR、 Western blotting结果显示，与对照组比较，DM组小鼠Collagen I和Collagen III mRNA及蛋白表达水平升高（P<0.05），DM+L组小鼠Collagen I和Collagen III mRNA及蛋白表达水平下降（P<0.05，图2C、D）。

2.6 利拉鲁肽对糖尿病小鼠心脏超微结构的影响

对照组小鼠肌纤维排列整齐有序，肌节完整，Z线清晰，线粒体呈圆形或椭圆形，排列整齐，线粒体嵴清晰、膜完整，肌质网结构规则，无扩张，细胞核及核仁清晰。与对照组相比，DM组小鼠心肌细胞出现坏死，细胞间质增宽，肌纤维排列紊乱，部分肌纤维溶解断裂，Z线模糊，线粒体肿胀变形、嵴消失，可见大量脂滴，部分线粒体膜破裂、溶解，肌质网肿胀扩张，细胞核肿胀，部分溶解消失。与DM组相比，DM+L组小鼠心肌病变明显减轻（图3）。

3 讨论

糖尿病状态下持续的高血糖是诱发心肌损伤、心肌重构、心功能下降的核心病理机制，而糖尿病大量蛋白尿期因肾损伤引发的全身代谢紊乱与炎症激活，会进一步加速心脏病变^{［11， 21］}。本研究证实，糖尿病大量蛋白尿期的小鼠存在显著左心室肥厚、收缩、舒张功能障碍及心脏超微结构损伤，利拉鲁肽可通过减轻纤维化与炎症反应改善其心脏病变。

利拉鲁肽是目前临床上广泛应用的一种较为新型的糖尿病治疗药物，其核心药理作用是降糖，本研究结果亦证实，利拉鲁肽可显著降低糖尿病小鼠血糖水平，而高血糖可通过激活氧化应激、炎症反应、糖基化终产物堆积、心肌细胞钙稳态失衡等通路，直接损伤心肌细胞、破坏心肌微环境、加重心肌纤维化，进而引发糖尿病心肌病等心脏并发症^{［22， 23］}。本研究中利拉鲁肽的降糖作用可从根源上减轻高血糖介导的心肌病理损伤，改善心肌代谢紊乱，缓解心肌炎症与氧化应激损伤，实现心脏保护作用。然而，既往研究已证实，GLP-1R不仅存在于胰腺中，还存在于心脏、血管中，GLP-1或GLP-1类似物可直接与心肌组织表达的 GLP-1R结合发挥靶向调控，如司美格鲁肽可与小鼠心肌成纤维细胞表达的GLP-1R结合显著抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞的增殖与活化，减轻I、III型胶原的表达^［14］。利拉鲁肽可通过抑制链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠P4hα-1表达及C/EBP同源蛋白介导的内质网应激、增强AMPK介导的自噬作用，降低I、III型胶原的表达，改善糖尿病大鼠的心功能，减轻心脏纤维化^［17-19］，且该调控效应独立于血糖变化之外。胶原沉积，尤其是I、III型胶原的过度沉积，是导致DCM心肌纤维化和心功能障碍的一个重要因素^［24］。利拉鲁肽作为GLP-1RA之一，一方面可直接结合心肌组织GLP-1受体，抑制心肌成纤维细胞活化，减少胶原沉积，延缓心肌纤维化进程，同时抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌细胞肥大，改善心肌收缩与舒张功能^{［17， 25-27］}；另一方面，可直接调控心肌局部的NF-κB炎症通路^［28］、TGF-β1/Smad纤维化通路^［29］、Nrf2/HO-1氧化应激通路^［26］，降低炎症因子释放、清除氧自由基，减轻心肌局部炎症与氧化应激损伤，改善心肌纤维化。在本研究中，利拉鲁肽可显著降低I、III型胶原的mRNA及蛋白质表达，减轻糖尿病肾病期小鼠的心脏炎症及心肌间质、血管周围纤维化，改善其心功能。且该研究中利拉鲁肽的应用开始于糖尿病肾病大量蛋白尿阶段，表明利拉鲁肽可能通过直接靶向调控抑制小鼠心脏I、III型胶原蛋白表达，减轻糖尿病小鼠心肌纤维化及炎症反应而改善其心功能。因此，本研究中利拉鲁肽对糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠的心脏保护作用并非单一途径介导，而是降糖继发的间接心脏获益与不依赖降糖的直接心肌靶向作用共同参与的结果。

利拉鲁肽的作用除降糖、减重及心脏保护作用外还具有潜在的调脂作用，有研究^［30］在2型糖尿病合并冠心病患者中证实，利拉鲁肽可降低血清TC、TG及低密度脂蛋白（LDL），升高高密度脂蛋白（HDL）。但本研究结果显示，DM+L组的TC、TG、HDL及LDL与DM组差异均无统计学意义（P>0.05）。这一差异的核心原因可能在于既往调脂研究的模型为单纯高脂喂养小鼠或无肾病的2型糖尿病患者，代谢紊乱仅聚焦于糖脂代谢，而本研究模型为糖尿病大量蛋白尿期小鼠，肾损伤引发的尿潴留、炎症因子升高可能干扰脂质代谢通路，削弱利拉鲁肽的调脂效应；此外，临床研究中人类的脂质代谢调节机制更完善，而小鼠模型对利拉鲁肽的脂代谢响应可能更弱。这一发现提示，利拉鲁肽的调脂作用可能受糖尿病肾病分期影响，需在更大样本的临床研究中进一步验证。

既往关于利拉鲁肽对糖尿病心脏保护的研究，局限于急性高血糖且无肾病或在肾病早期阶段，如研究通过腹腔注射STZ构建糖尿病大鼠模型^［17］，实验全程未监测尿白蛋白/肌酐比值，未将模型诱导至大量蛋白尿期，无法模拟糖尿病肾病中晚期的心脏损伤状态。另有研究证实利拉鲁肽可通过活化AMPK，减轻糖尿病心肌病小鼠的心肌纤维化^［31］，同样未明确评估糖尿病小鼠的肾功能及尿蛋白情况。本研究选择自发性2型糖尿病KKAy小鼠结合高脂饮食构建糖尿病模型，通过10周高脂饮食喂养明确诱导至糖尿病肾病大量蛋白尿期（UACR>300 mg/g），聚焦临床中 “糖尿病肾病中晚期”这一心血管高风险阶段，而既往研究均未针对该阶段展开探索。同时，本研究选择自发性2型糖尿病KKAy小鼠结合高脂饮食构建糖尿病模型，更贴近临床2型糖尿病特征，使得本研究结果对2型糖尿病伴大量蛋白尿患者的临床转化价值更高。此外，既往研究对糖尿病心脏病变的评估中，部分研究在糖尿病小鼠模型中检测了左心室舒张功能与心肌纤维化，但未涉及收缩功能指标^{［18， 19］}；另有研究仅通过Western blotting检测Collagen I/III的表达水平，未观察心肌细胞形态及超微结构^［12］；有研究涉及超声评估，但未纳入心脏指数（心重/胫骨长度）以排除体质量差异对心脏质量的干扰^［32］。本研究构建了更系统的评估体系，除常规LVEF、FS外，首次同步检测收缩及舒张期左心室前后壁及室间隔厚度（LVAWs/d、LVPWs/d、IVSs/d）、心腔内径（LVIDs/d）及等容舒张时间（IVRT），证实糖尿病肾病大量蛋白尿期小鼠存在左室壁增厚及心腔缩小的典型肥厚表现，且发现E/A值降低、IVRT延长，提示舒张功能损伤早于收缩功能损伤，这一发现补充了既往对该阶段心脏重构模式的认识；同时，本研究在HE、Masson染色基础上，通过天狼星红偏振光染色量化 I/III 型胶原比例，并利用透射电镜观察到该阶段小鼠心肌线粒体肿胀、嵴消失及肌纤维断裂，这一超微结构损伤的发现，为利拉鲁肽改善心肌细胞能量代谢与结构完整性提供了直接证据，而既往研究涉及透射电镜观察研究的较少。本研究将Collagen I/III 的mRNA及蛋白表达与天狼星红染色的胶原面积分数、超声心动图的左心室心肌质量进行关联分析，证实利拉鲁肽通过下调胶原表达减轻纤维化，进而改善左心室肥厚，这一系统性的分析形成“分子-病理-功能”的完整证据链，优于既往单一指标的研究。

然而本研究未深入探索利拉鲁肽改善心肌纤维化的具体分子通路，如是否通过 GLP-1R/AMPK/mTOR 通路调节自噬等，未检测炎症因子的表达，难以量化利拉鲁肽的抗炎效应强度。研究仍存在许多不足，未来研究可结合Western blotting检测AMPK、mTOR 磷酸化水平，及ELISA检测血清炎症因子，进一步明确利拉鲁肽的作用机制。

综上所述，本研究通过更贴近临床的实验模型、更系统的评估体系，证实糖尿病大量蛋白尿期小鼠存在显著心脏结构与功能损伤，利拉鲁肽可通过减轻心肌纤维化与超微结构损伤改善心脏病变，这一结果不仅丰富了糖尿病大量蛋白尿期心脏保护的研究，更为临床中该阶段患者的心血管保护治疗提供了实验依据，支持 GLP-1RA在糖尿病肾病中晚期的推广应用。

参考文献

[1] Duncan BB, Magliano DJ, Boyko EJ. IDF Diabetes Atlas 11th edition 2025: global prevalence and projections for 2050[J]. Nephrol Dial Transplant, 2025, 41(1): 7-9. doi：10.1093/ndt/gfaf177

[2] Huxley R, Barzi F, Woodward M. Excess risk of fatal coronary heart disease associated with diabetes in men and women: meta-analysis of 37 prospective cohort studies[J]. Bmj, 2006, 332(7533): 73-8. doi：10.1136/bmj.38678.389583.7C

[3] An YL, Zhang P, Wang JP, et al. Cardiovascular and all-cause mortality over a 23-year period among Chinese with newly diagnosed diabetes in the da Qing IGT and diabetes study[J]. Diabetes Care, 2015, 38(7): 1365-71. doi：10.2337/dc14-2498

[4] Low Wang CC, Hess CN, Hiatt WR, et al. Clinical update: cardiovascular disease in diabetes mellitus: atherosclerotic cardiovascular disease and heart failure in type 2 diabetes mellitus–mechanisms, management, and clinical considerations[J]. Circulation, 2016, 133(24): 2459-502. doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.116.022194

[5] Valmadrid CT, Klein R, Moss SE, et al. The risk of cardiovascular disease mortality associated with microalbuminuria and gross proteinuria in persons with older-onset diabetes mellitus[J]. Arch Intern Med, 2000, 160(8): 1093. doi：10.1001/archinte.160.8.1093

[6] Howard BV, Magee MF. Diabetes and cardiovascular disease[J]. Curr Atheroscler Rep, 2000, 2(6): 476-81. doi：10.1007/s11883-000-0046-8

[7] Kishor S, Chen JR, Zhang Y, et al. Interaction of proteinuria and diabetes on the risk of cardiovascular events: a prospective cohort CKD-ROUTE study[J]. BMC Public Health, 2024, 24(1): 3192. doi：10.1186/s12889-024-20715-2

[8] Liu JE, Robbins DC, Palmieri V, et al. Association of albuminuria with systolic and diastolic left ventricular dysfunction in type 2 diabetes[J]. J Am Coll Cardiol, 2003, 41(11): 2022-8. doi：10.1016/S0735-1097(03)00403-0

[9] Nakamura K, Miyoshi T, Yoshida M, et al. Pathophysiology and treatment of diabetic cardiomyopathy and heart failure in patients with diabetes mellitus[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(7): 3587. doi：10.3390/ijms23073587

[10] Li Y, Du YH, Liu Y, et al. Cardiomyocyte-derived small extracellular vesicle: a new mechanism driving diabetic cardiac fibrosis and cardiomyopathy[J]. Theranostics, 2024, 14(15): 5926-44. doi：10.7150/thno.99507

[11] Jia GH, Hill MA, Sowers JR. Diabetic cardiomyopathy: an update of mechanisms contributing to this clinical entity[J]. Circ Res, 2018, 122(4): 624-38. doi：10.1161/circresaha.117.311586

[12] Liu JY, Liu Y, Chen L, et al. Glucagon-like peptide-1 analog liraglutide protects against diabetic cardiomyopathy by the inhibition of the endoplasmic reticulum stress pathway[J]. J Diabetes Res, 2013, 2013: 630537. doi：10.1155/2013/630537

[13] Zhang Y, Ling YN, Yang L, et al. Liraglutide relieves myocardial damage by promoting autophagy via AMPK-mTOR signaling pathway in zucker diabetic fatty rat[J]. Mol Cell Endocrinol, 2017, 448: 98-107. doi：10.1016/j.mce.2017.03.029

[14] 李京娟, 李凡凡, 牛 璐, 等. 司美格鲁肽对高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖的作用研究[J]. 南方医科大学学报, 2023, 43(11): 1935-40. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2023.11.14

[15] Pyke C, Heller RS, Kirk RK, et al. GLP-1 receptor localization in monkey and human tissue: novel distribution revealed with extensively validated monoclonal antibody[J]. Endocrinology, 2014, 155(4): 1280-90. doi：10.1210/en.2013-1934

[16] Ban K, Noyan-Ashraf MH, Hoefer J, et al. Cardioprotective and vasodilatory actions of glucagon-like peptide 1 receptor are mediated through both glucagon-like peptide 1 receptor-dependent and-independent pathways[J]. Circulation, 2008, 117(18): 2340-50. doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.107.739938

[17] Zhao T, Chen HQ, Xu F, et al. Liraglutide alleviates cardiac fibrosis through inhibiting P4hα‑1 expression in STZ-induced diabetic cardiomyopathy[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2019, 51(3): 293-300. doi：10.1093/abbs/gmy177

[18] Huynh K, Kiriazis H, Du XJ, et al. Coenzyme Q10 attenuates diastolic dysfunction, cardiomyocyte hypertrophy and cardiac fibrosis in the db/db mouse model of type 2 diabetes[J]. Diabetologia, 2012, 55(5): 1544-53. doi：10.1007/s00125-012-2495-3

[19] Huynh K, McMullen JR, Julius TL, et al. Cardiac-specific IGF-1 receptor transgenic expression protects against cardiac fibrosis and diastolic dysfunction in a mouse model of diabetic cardiomyopathy[J]. Diabetes, 2010, 59(6): 1512-20. doi：10.2337/db09-1456

[20] Ji YQ, Zhao Z, Cai TZ, et al. Liraglutide alleviates diabetic cardio-myopathy by blocking CHOP-triggered apoptosis via the inhibition of the IRE-α pathway[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(4): 1254-8. doi：10.3892/mmr.2014.1956

[21] Seferović PM, Paulus WJ, Rosano G, et al. Diabetic myocardial disorder. a clinical consensus statement of the heart failure association of the ESC and the ESC working group on myocardial & pericardial diseases[J]. Eur J Heart Fail, 2024, 26(9): 1893-903. doi：10.1002/ejhf.3347

[22] Ritchie RH, Abel ED. Basic mechanisms of diabetic heart disease[J]. Circ Res, 2020, 126(11): 1501-25. doi：10.1161/circresaha.120.315913

[23] Balogh DB, Wagner LJ, Fekete A. An overview of the cardioprotective effects of novel antidiabetic classes: focus on inflammation, oxidative stress, and fibrosis[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(9): 7789. doi：10.3390/ijms24097789

[24] Liu MR, López de Juan Abad B, Cheng K. Cardiac fibrosis: Myofibroblast-mediated pathological regulation and drug delivery strategies[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2021, 173: 504-19. doi：10.1016/j.addr.2021.03.021

[25] Helmstädter J, Frenis K, Filippou K, et al. Endothelial GLP-1 (glucagon-like peptide-1) receptor mediates cardiovascular pro-tection by liraglutide in mice with experimental arterial hypertension[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2020, 40(1): 145-58. doi：10.1161/atv.0000615456.97862.30

[26] Noyan-Ashraf MH, Momen MA, Ban K, et al. GLP-1R agonist liraglutide activates cytoprotective pathways and improves outcomes after experimental myocardial infarction in mice[J]. Diabetes, 2009, 58(4): 975-83. doi：10.2337/db08-1193

[27] Zhu YX, Zhang W, Qu HL, et al. Liraglutide alleviates diabetic cardiomyopathy in streptozotocin-induced diabetic rats by enhancing mitophagy mediated by the AMPK-Parkin signaling pathway[J]. World J Diabetes, 2025, 16(12): 1125-33. doi：10.4239/wjd.v16.i12.112423

[28] Wang XW, Zhang FX, Yang F, et al. Effects of linagliptin and liraglutide on glucose- and angiotensin II-induced collagen formation and cytoskeleton degradation in cardiac fibroblasts in vitro [J]. Acta Pharmacol Sin, 2016, 37(10): 1349-58. doi：10.1038/aps.2016.72

[29] Eid RA, Khalil MA, Alkhateeb MA, et al. Exendin-4 attenuates remodeling in the remote myocardium of rats after an acute myocardial infarction by activating β‑arrestin-2, protein phosp-hatase 2A, and glycogen synthase kinase-3 and inhibiting β-catenin[J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2021, 35(6): 1095-110. doi：10.1007/s10557-020-07006-9

[30] Wang LD, Xin QQ, Wang Y, et al. Efficacy and safety of liraglutide in type 2 diabetes mellitus patients complicated with coronary artery disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Pharmacol Res, 2021, 171: 105765. doi：10.1016/j.phrs.2021.105765

[31] Kuo CY, Tsou SH, Kornelius E, et al. The protective effects of liraglutide in reducing lipid droplets accumulation and myocardial fibrosis in diabetic cardiomyopathy[J]. Cell Mol Life Sci, 2025, 82(1): 39. doi：10.1007/s00018-024-05558-9

[32] Noyan-Ashraf MH, Shikatani EA, Schuiki I, et al. A glucagon-like peptide-1 analog reverses the molecular pathology and cardiac dysfunction of a mouse model of obesity[J]. Circulation, 2013, 127(1): 74-85. doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.112.091215

基金资助

国家自然科学基金(81560143)

甘肃省自然科学基金(24JRRA589)

甘肃省卫生健康行业科研项目(GSWSQN2024-01)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021